…………………………………………………………………………………………………………………………………….. 1

مقدمه ………………………………………………………………………………………………………………………………………..3

فصل اول کلیات …………………………………………………………………………………………………….. 5

1-1-پیشینه تاریخی ………………………………………………………………………………………………………………….. 6

1-2-آماده سازی ال-آسپاراژیناز قابل استفاده برای درمان ……………………………………………………………… 8

1-3- آزمایش های بالینی با ال-آسپاراژیناز ……………………………………………………………………………….. 10

1-4-خصوصیات شیمیایی و داروشناسی این دارو ………………………………………………………………………. 12

1-4-1 اثر ضد سرطانی ………………………………………………………………………………………………………….. 12

1-4-2- ترکیبات شیمیایی داروی در دسترس برای درمان …………………………………………………………… 14

1-4-2-1 آنزیم طبیعی ……………………………………………………………………………………………………………. 14

1-4-2-2-آنزیم تغییریافته ………………………………………………………………………………………………………. 16

1-5- فارماکوکنتیک ……………………………………………………………………………………………………………….. 19

1-5-1- مقاومت دارویی ………………………………………………………………………………………………………… 23

1-5-2- تأثیر دارویی ………………………………………………………………………………………………………….. 25

1-6-سمیّت ………………………………………………………………………………………………………………………… 28

فصل دوم روش کار …………………………………………………………………………………………… 34

2-1- مواد و میکروارگانیسم ها ……………………………………………………………………………………………….35

2-2- کشت باکتری ……………………………………………………………………………………………………………… 35

2-3- اعمالUV در زمان های مختلف …………………………………………………………………………………… 35

2-4- انجام تستNesslerizationبه منظور بررسی مقدار آمونیاک آزاد شده ..……………………….. 36

2-4-1- کشت کلنی ها ……………………………………………………………………………………………………….. 36

2-4-2- تعیین غلظت آمونیاک آزاد شده در محلول واکنش توسط ال-آسپاراژیناز کلنی ها …………… 37

2-4-3- محلول های لازم برای سنجش میزان فعالیت آنزیم ال-آسپاراژیناز کلنی ها ……………………. 38

2-5-استخراجDNA…………………………………………………………………………………………………………. 40

2-5-1- کشت باکتری به منظور استخراج DNA…………………………………………………………………….. 40

2-5-2- استخراج DNA ژنومی ……………………………………………………………………………………………. 41

2-6- واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR) ………………………………………………………………………………. 42

2-7- الکتروفورز بر روی ژل آگارز ……………………………………………………………………………………. 43

2-8- خالص سازی محصول PCR …………………………………………………………………………………….. 44

2-9- استخراج پلاسمید ……………………………………………………………………………………………………. 46

2-10- هضم آنزیمی و کلون کردن قطعه در داخل وکتور ……………………………………………………… 47

2-10-1- الگوی برش آنزیمی ژن ال-آسپاراژیناز ll …………………………………………………………….. 47

2-10-2- برش و آماده سازی وکتور pET23a(+) ……………………………………………………………… 48

2-10-3- واکنش الحاق وکتور pET23a(+) با قطعه ژنی ال-آسپاراژینازll ……………………………. 48

2-11-ایجاد سلول های Competant و انتقال پلاسمید …………………………………………………….. 49

2-12-انتخاب کلون های مثبت …………………………………………………………………………………………. 50

2-13- تأیید کلنی های نوترکیب باPCRو هضم آنزیمی …………………………………………………….. 51

2-13-1-PCR ……………………………………………………………………………………………………………….. 51

2-13-2- هضم آنزیمی ……………………………………………………………………………………………………. 52

2-14- بیان و استخراج پروتئین بیان شونده توسط ژن آنزیم ال-آسپاراژینازll …………………………. 53

2-14-1- القاء بیان پروتئین آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll…………………………………………………………… 53

2-14-2- استخراج پروتئین های آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll و ال-آسپاراژیناز l ………………………… 54

2-15- بررسی اولیه بیان پروتئین نوترکیب ال-آسپاراژیناز ll و پروتئین ال-آسپاراژیناز l با SDS-

PAGE …………………………………………………………………………………………………………………………… 55

2-16- تعیین فعالیت آنزیمی یا فعالیت کلّی( IU ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز …………………………. 58

2-17- تعیین پروتئین کلّی ( mg ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز ……………………………………………….. 59

2-18- تعیین فعالیت ویژه( IU/mg ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز ………………………………………….. 62

2-19- کشت سلول انسانی ………………………………………………………………………………………………. 62

2-19-1- تهیه محیط كشت RPMI1640…………………………………………………………………………. 63

2-20- تاثیر آنزیم ال-آسپاراژینازll(نوترکیب)،ال-آسپاراژینازlو آنزیم استاندارد بر سلول های

سرطانی انسانی ………………………………………………………………………………………………………………. 63

2-20-1- MTT Assay …………………………………………………………………………………………………. 63

2-21- تست تغییرات سیتوپلاسمی سلول های سرطانی بعد از انجام تست MTT …………………… 65

فصل سوم نتایج …………………………………………………………………………………………….. 67

3-1- بررسی و شماره گذاری کلنی ها ………………………………………………………………………………. 68

3-2- نتایج اعداد جذب محلول های استاندارد سولفات آمونیوم در طول موج nm490 …………… 69

3-3- بررسی اعداد جذب آمونیاک آزاد شده در محلول های به دست آمده از کلنی های جهش

یافته ……………………………………………………………………………………………………………………………… 70

3-4- جداسازی و تکثیر ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز ll ……………………………………………………………. 72

3-5- تعیین توالی قطعه ژنیl-aspsraginase ll…………………………………………………………….. 74

3-6- وارد کردن قطعه ژنیl-asparaginase ll در وکتور pET23a و تأیید آن …………………. 76

3-7- نتیجه SDS-PAGE نمونه های آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll , l و استاندارد ………………………… 79

3-8- محاسبۀ فعالیت آنزیمی(IU) ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و ال-آسپاراژیناز

استاندارد ……………………………………………………………………………………………………………………….. 80

3-9- تعیین پروتئین کلّی (mg) آنزیم های ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و ال-

آسپاراژیناز استاندارد ………………………………………………………………………………………………………… 82

3-10- تعیین فعالیت ویژه( IU/mg ) آنزیم های ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و

ال-آسپاراژیناز استاندارد ………………………………………………………………………………………………….. 84

3-11- بررسی تأثیر آنزیم ال-آسپاراژینازll (نوترکیب)، ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول

های سرطانی HeLa ………………………………………………………………………………………………………. 85

3-12- بررسی تأثیر آنزیم ال-آسپاراژینازll (نوترکیب)، ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول

های سرطانی LCL ……………………………………………………………………………………………………….. 89

3-13- بررسی تغییرات سیتوپلاسمی سلول های سرطانی بعد از انجام تست MTT ………………… 97

فصل چهارم بحث و پیشنهادات ………………………………………………………………………. 98

منابع …………………………………………………………………………………………………………………………….. 108