بز……………………………………………………………………………………………………………………….. 23

عنوان صفحه

5-7- 2- سگ………………………………………………………………………………………………………………….. 23

6- 7- 2- گربه…………………………………………………………………………………………………………………. 24

7- 7- 2- انسان……………………………………………………………………………………………………………….. 24

8- 2- بیماریزایی………………………………………………………………………………………………………….. 25

1- 8- 2- مکانیسم سقط جنین ……………………………………………………………………………………. 26

2-8- 2- آسیب های وارده به جفت ………………………………………………………………………….. 27

3- 8- 2- آسیب های وارده به جنین……………………………………………………………………………. 27

9-2 – یافته های كالبدگشایی………………………………………………………………………………………………… 31

10-2-خسارات اقتصادی نئوسپوروزیس در گاو………………………………………………………………….. 31

11-2- عوامل مستعد كننده………………………………………………………………………………………………… 33

1-11-2- حضور سگ ها……………………………………………………………………………………………….. 33

2-11-2- سایر گوشتخواران………………………………………………………………………………………….. 33

3-11-2- میزبان های واسط به غیر از گاو……………………………………………………………………. 33

4- 11-2- چراگاه، علوفه و آب شرب……………………………………………………………………………. 34

5-11-2- سن گله…………………………………………………………………………………………………………… 34

6-11-2- خوردن شیر یا آغوز………………………………………………………………………………………… 34

7- 11-2- سرکوب ایمنی ……………………………………………………………………………………………… 34

8- 11-2- تراكم گله و ابعاد مزرعه……………………………………………………………………………….. 35

9-11-2- آب و هوا…………………………………………………………………………………………………………. 35

10- 11-2- تراكم جمعیت انسانی………………………………………………………………………………… 35

11-11-2- فصل و نژاد……………………………………………………………………………………………………. 35

12-11-2- پرورش………………………………………………………………………………………………………….. 35

12-2- ایمنی…………………………………………………………………………………………………………………………. 36

13-2- تشخیص…………………………………………………………………………………………………………………….. 37

1- 13-2- روش های سرولوژیك…………………………………………………………………………………….. 38

1- 1- 13-2- روش ایمونو فلورسنت آنتی بادی غیر مستقیم (IFAT)……………. 40

2- 1- 13-2- روش آگلوتیناسیون مستقیم (DAT) …………………………………………… 41

3- 1- 13-2- روش الایزا ……………………………………………………………………………………….. 42

4-1- 13-2- تست لاتکس آگلوتیناسیون (LAT)…………………………………………………. 42

2- 13-2 – روش های تشخیص بافتی………………………………………………………………………….. 46

عنوان صفحه

1-2-13-2 – هیستوپاتولوژی…………………………………………………………………………………… 46

2-2-13-2 – هیستوشیمی……………………………………………………………………………………… 47

3-2- 13-2 – ایمنوهیستوشیمی……………………………………………………………………………. 47

3-13-2 – تكنیك های مولكولی………………………………………………………………………………. 48

4- 13-2 – استفاده از مدل های حیوانی……………………………………………………………….. 48

5-13-2 – روش كشت سلول………………………………………………………………………………….. 49

6-13-2 – تشخیص تفریقی………………………………………………………………………………………. 50

14-2 – درمان……………………………………………………………………………………………………………………….. 50

15-2 – پیشگیری و کنترل………………………………………………………………………………. 51

16-2 – پروتئین های نوترکیب و اهمیت آنها………………………………………………………………………. 52

1-16-2 – سیستم های بیان ژن برای تولید پروتئین های نو ترکیب…………………………… 53

2-1-16-2 – سیستم های باکتریایی……………………………………………………………………………… 54

3-1-16-2- سیستمpET………………………………………………………………………………………………… 54

4-1-16-2 – سیستم مخمری و قارچی ……………………………………………………………………… 54

5-1-16-2 – حشرات …………………………………………………………………………………………………….. 55

6-1-16-2 – سلول پستانداران …………………………………………………………………………………….. 55

فصل سوم: موادوروشکار

1-3- طراحی پرایمرها…………………………………………………………………………………………………………… 58

2- 3- تهیه تاكی زوئیتنئوسپورا کانینوم……………………………………………………………………………. 58

3- 3- استخراج DNA از تاكی زوئیتهاینئوسپورا کانینومخالص شده……………………………. 59

۴- ۳- تکثیر قسمتی از ژن NcSAG1 با روش PCR………………………………………………………… 60

5- ۳- خالص سازی باند مورد نظر از ژل آگاروز ………………………………………………………………… 61

6- ۳- اتصال Ligation) ) محصول PCR در پلاسمید pTZ57R …………………………………….. 62

7-3- تهیه ی سلول های پذیرا Competent cells)) از باکتری E.coliGM2163 ……….. 62

٨-٣- وارد کردن پلاسمید به درون سلول باکتری ( (Transformation……………………………. 63

9-3- تأیید وجود پلاسمید حاوی قطعه ی ژن مورد نظر درون کولونی باکتری …………….. 63

۱۰- ۳- تعیین توالی پلاسمیدهای بدست آمده (Sequencing)………………………………………. 64

۱۱- ۳- برش قطعات حاوی NcSAG1 و پلاسمید pET-28a………………………………………… 66

۱-۱۱- ۳- برش NcSAG1 و پلاسمید pET-28a

با آنزیم های NcoІ و ІІІ Hind…………………………………………………………………………………… 67

عنوان صفحه

12- ۳- اتصال قطعات برش خورده ی NcSAG1 و پلاسمید pET-28a(Ligation)…….. 67

-۱۳ ۳- تأئید وجود قطعه هدف NcSAG1)) درون پلاسمید pET-28a………………………. 67

-۱۴ ۳- انتقال وكتورحاوی ژن موردنظر به داخل باكتریE.coliBL21 …………………………. 68

-۱۵ ۳- بررسی چند كولونی رشد كرده برای ارزیابی وجود ژن كلون شده……………………… 68

-۱۶ ۳- جداسازی پلاسمید SAG1-pET28 ……………………………………………………………………… 69

-۱۷ ۳- برش پلاسمید با آنزیمهای NcoІ و HindІІІ و الكتروفورز محصول

برای اطمینان از وجود قطعه مورد نظر در پلاسمید ……………………………………………………….. 69

-۱۸ ۳- انتخاب یك یا دو كلون برای توالی یابی (برای حصول اطمینان

از توالی درست ژن)…………………………………………………………………………………………………. 69

-۱۹ ۳- پس از حصول اطمینان از توالی ژن، كلون مورد نظر برای بیان ژن

مورد استفاده قرار می گیرد…………………………………………………………………………………….. 69

۲۰-۳- خالص سازی (Purification) پروتئین های تولیدشده به فرم گنجیدگی های

درون سلولی(Inclusion body) تحت شرایط دناتوره کننده…………………………………………….. 70

۲۱-۳- حل کردن (Solubilization)و بازتاخوردگی ( Refolding) پروتئین های

تولیدشده به فرم گنجیدگی های درون سلولی (Inclusion body)…………………………………… 71

۲۲- ۳- اندازه گیری غلظت پروتئین نوترکیب NcSAG1به روش لوری………………………… 73

۲۳-۳- ارزیابی پروتئین نوتركیب خالص شده و بازتاخورده با استفاده از

SDS-PAGE و وسترن بلاتینگ(Western Blotting)……………………………………………………… 74

۲۴- ۳- آزمایش وسترن بلاتینگ پروتئین ها……………………………………………………………………… 75

1-24- ۳- بلاتینگ ……………………………………………………………………………………………………….. 75

2-24-3- مسدود سازی سطح کاغذ (Blocking)………………………………………………………… 75

3-24- ۳- اضافه کردن سرم ضدنئوسپورا……………………………………………………………………. 76

4-24- ۳- اضافه کردن آنتی بادی کنژوگه……………………………………………………………………. 76

5-24- ۳- اضافه کردن محلول سوبسترا………………………………………………………………………… 76

۲۵- ۳- پوشاندن (Coating) ذرات لاتكس با آنتی ژن نوتركیب NcSAG1……………………. 77

۲۶- ۳- جمع آوری نمونه های سرم……………………………………………………………………………………. 78

۲۷-۳- انجام تست لاتكس آگلوتیناسیون LAT) )…………………………………………………………….. 78

۲۸-۳- انجام تست الایزا……………………………………………………………………………………………………….. 79

۲۹-۳- مقایسه ارزش تشخیصی تست لاتكس آگلوتیناسیون LAT) )

بر اساس آنتی ژن نوترکیب NcSAG1 با تست الایزا ………………………………………………………. 79

عنوان صفحه

فصل چهارم: نتایج

۱-۴- تکثیر قسمتی از ژن NcSAG1 با روش PCR…………………………………………………………. 81

۲-۴- کلون کردن ژن NcSAG1 در پلاسمید pTZ57R/T………………………………………………. 82

۳-۴- استخراج پلاسمید از کلون 2163E.coliGM حاوی قطعه ژنی مورد نظر

در پلاسمید pTZ57R/T………………………………………………………………………………………………………… 83

۴-۴- برش پلاسمید حاوی قطعه ژنی و پلاسمیدpET-28a (کلون 2821)

با آنزیم ІІІ Hind …………………………………………………………………………………………………………………. 84

۵-۴- برش قطعه ژنی و پلاسمیدpET-28a بریده شده با آنزیم ІІІ Hind، بوسیله

آنزیم NcoІ……………………………………………………………………………………………………………………………. 85

۶-۴- خالص سازی قطعه ژنی و پلاسمیدpET-28a بریده شده با آنزیم های

ІІІ Hind و NcoІ…………………………………………………………………………………………………………………. 86

۷-۴- کلون کردن قطعه ژنی NcSAG1 بریده شده در پلاسمید pET-28a

بریده شده با همان آنزیم ها………………………………………………………………………………………………… 87

۸-۴- نتایج بیان پروتئین نوتركیب………………………………………………………………………………………. 88

۹-۴- نتایج خالص سازی پروتئین نوترکیب تولیدشده به فرم

گنجیدگی های درون سلولی……………………………………………………………………………………………….. 91

۱۰-۴- نتایج اندازه گیری غلظت پروتئین نوترکیب NcSAG1 به روش لوری……………….. 93

۱۱-۴- نتایج حاصل از وسترن بلاتینگ پروتئین نوترکیب خالص شده

تحت شرایط دناتوره کننده…………………………………………………………………………………………………… 94

۱۲-۴- نتایج حاصل از الکتروفورز و وسترن بلاتینگ پروتئین نوترکیب بازتاخورده………… 95

۱۳-۴- نتایج حاصل از تست لاتكس آگلوتیناسیون……………………………………………………………. 95

فصل پنجم: بحث

پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………. 103

فهرست منابع و مآخذ……………………………………………………………………………….. 104

مقدمه

نئوسپورا کانینومتك یاخته اجباری داخل سلولی از شاخه آپی کمپلکسا ، اولین بار توسط برکاس و همكارانش (۱٩۸۴) توصیف شد. دوبی و همكاران (۱٩۸۸) این تک یاخته را برای اولین بار از سگ ها جدا و نامگذاری كردند (Dubeyet al. 1988a,b) سپس مشخص شد كه میزبان نهائینئوسپورا کانینوم، سگ است (Holmdahl and Mattsson 1996; Lindsayet al. 1995 Bassoet al.2001;).

نئوسپورورزیس از علل اصلی سقط جنین گاو است، از این رو با سقط ، مرده زائی، تولدگوساله ضعیف یا همراه با عفونت دائمی و كاهش تولید شیر ضررهای اقتصادی قابل توجهی ایجاد می كند. انتشار عفونت در گاو با انتقال تاكی زوئیت از مادر به جنین و یا با خوردن آب و غذائی آلوده به اووسیست انگل صورت می گیرد 1999, Treeset al. 1999; Romeroetal. 2004) Dubey).

مطالعات انجام شده در برخی كشورها حاكی از این است كه ۴۲-۱۳ درصد جنین های سقط شده در گاوها به این انگل آلوده هستند (Dubey and Lindsay 1993; Dubeyet al. 2006 ).نئوسپورا کانینومعلاوه بر گاو ، سایر گونه های اهلی چون اسب، گوسفند، بز، شتر، سگ، گربه و سگ سانان وحشی را آلوده می كند (Dubey 2003; Gondinm 2006 ).

نئوسپوروزیس انتشار جهانی داشته و از بسیاری از كشورهای جهان گزارش شده است، ایران نیز از این قائده مستثنی نیست. در بررسی آلودگینئوسپورا کانینومدرگاوهای شیریسقط كرده، رزمی و همكاران (۲۰۰۶) اولین مورد سقط جنین گاوی را در مشهد گزارش كردند و ۱۸/۱۵درصد نمونه های سرمی گاوها در تست IFAمثبت بودند

(et al.2007; Sadrebazzazet al. 2004 Razmi).

با توجه به گزارشاتی مبنی بر وجود آلودگی در گاوهای كشور و خسارات اقتصادی حاصله بر صنعت گاوداری، طراحی و ارزیابی تستهای تشخیصی حساس و اختصاصی كه توانایی تشخیص حیوانات آلوده را به منظور كنترلنئوسپورا کانینومدر سطح گله داشته باشند ضروری به نظر می رسد.

از زمان شناسایینئوسپورا کانینومتاكنون روشهای تشخیصی زیادی برای شناسایی آلودگی دامها به این انگل ابداع شده است. از این میان می توان به روشهای هیستوپاتولوژی، ایمونوهیستوشیمی، سرولوژی، مولكولی، كشت سلولی و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی اشاره نمو د

(2003 Dubey and Schares 2006 ; Dubey and Lindsay 1993; Dubeyet al. 2006; Dubey )

تشخیص قطعی بر اساس آزمایش ایمونوهیستوشیمی بافتهای آلوده است. این روش معمولاﹰ برای تأیید سایر روشها و نیز برای تفکیکنئوسپورا کانینومازتوکسوپلاسما گندئیاستفاده شده اما روشی وقت گیر بوده و تفسیر نتایج آن مشکل است

(Dubey and Lindsay 1993; Jones 1996; Romandet al. 1998; Dubey and ;Schares 2006; Dubey 2003).

تشخیص آلودگی عمدتا با روشهای سرولوژیکی، به عنوان ابزار مهمی برای بررسی های کلینیکی و اپیدمیولوژیکی، انجام می شود (et al. 2007 Silva).

آزمایشات سرولوژیك دارای این مزیت هستند که قبل از مرگ دام قابل انجام بوده و اطلاعات کافی در مورد مرحله آلودگی فراهم می سازند (Dubey and Schares 2006). از آنجایی که تنها نشانه در معرض قرار گرفتن بانئوسپورا کانینوم، حضور آنتی بادی های اختصاصی در سرم گاو است، روشهای مختلف سرولوژیک برای تشخیص آنتی بادی به کار گرفته شده که شامل IFAT، انواع الایزا وDAT هستند (et al. 1997 Williams Romandet al. 1998; Packhamet al. 1998; Paréet al. 1995a; Lallyet al. 1996; Conradet al. 1993a; Björkman and Lunden 1998; ). در این روشها از تاکی زوئیت کامل یا آنتی ژن های مشتق شده از تاکی زوئیت استفاده می شود که به علت واکنش متقاطع با سایر انگلهای مربوطه مانندتوکسوپلاسما گندئیباعث واکنش مثبت کاذب می شود

(et al. 1993b; Dubey and Lindsay 1993 Conradet al. 2003; ; 1999 Chahan Bjorkman and Uggla ). همچنین به علت نیاز این آزمایشات به استفاده از مقادیر زیاد آنتی ژنهای مشتق شده از کشت سلولی، اغلب تهیه آنتی ژن و استاندارد کردن آن مشکل است و به دلیل تفاوت در میزان بقایای سلول میزبان بر اختصاصیت و تکرارپذیری نتایج تست تاثیر می گذارد (Lallyet al. 1996; Jianget al. 2008; al. 1996; etBaszler). بنابراین ضروری است که تست تشخیصی مطمئن، حساس و اختصاصی با استفاده از آنتی ژن های اختصاصینئوسپورا کانینومطراحی شود.

آنتی ژن های نوترکیب درمقایسه با آنتی ژن های کامل، مزایای بیشتری دارند زیرا اولا به آسانی درحجم زیاد تهیه می شوند و ثانیا به راحتی برای آزمایشات تشخیصی استاندارد می شوند. بنابراین با به كارگیری این آنتی ژن ها، نیازی به آنتی ژن های مشتق شده از کشت سلولی نیست (et al. 2003; Louieet al. 1997 Chahan).

تاکنون چندین آنتی ژننئوسپورا کانینومشناسایی شده اند که اغلب آنها شامل
پروتئین هایی هستند که روی سطح مراحل مهاجم انگل ظاهر می شوند مانند NcSAG1و NcSRS2که از آنتی ژن های سطحی ایمونودومینانت اصلی هستند
(immunodominant surface antigens major). علاوه بر این ، آنتی ژن هایی نیز هستند که بطور موقتی روی سطح تاکی زوئیت های انگل ظاهر می شوند مانند محتویات میکرونم، راپتری و گرانولهای متراکم. این ها ارگانل های ترشحی در ناحیه قدامی مراحل مهاجم انگل هستند و در واکنشهای فیزیکی مستقیم بین انگل و سلول میزبان نقش دارند
( Soldatiet al. 2001; Sondaet al. 2000et al. 1998; Nishikawaet al. 2001a;b; Liddell Lallyet al. 1997; Boothroyd 2000; Dubremetzet al. 1998; Hemphillet1997 Black and ).

اگرچه NcSAG1 و NcSRS2 بطور واضح با همتاهای خود درتوکسوپلاسما گندئی(TgSAG1 و TgSRS2) هومولوگ هستند اما میزان تشابه توالی به اندازه ای نیست که باعث بروز واکنش متقاطع شود، از این رو به عنوان مارکرهای تشخیصی عالی برای تمایز موثر بیننئوسپوراکانینوموتوکسوپلاسما گندئیقابل استفاده هستند (Howeet al. 1998). همچنین پاسخهای ایمنی القاء شده توسط این آنتی ژن های سطحی، آنها را به مارکرهای ایده آل برای تشخیص سرولوژیکی آلودگی بهنئوسپوراکانینومو تهیه واکسن تبدیل كرده است

Chahanet al. 2003; Gaturagaet al. 2005; Howeet al. 1998; Liuet al.2007; Pinitkiatisakulet al.2005 ) Ahnet al.2003; ).

تست الایزا با استفاده از آنتی ژن های tNcSRS2 -GST و GST-NcSAG1t برای تشخیصنئوسپوراکانینومطراحی و مورد استفاده قرار گرفته است و نتایج نشان می دهد که این تست، حساسیت و اختصاصیت بالایی دارد و واکنش متقاطعی با سرم مثبت توکسوپلاسما گندئیندارد Liuet al. 2007 ; Pinitkiatisakulet al. 2005; Hemphillet al. 1997; l Gaturagaet al. 2005; Ahnet al. 2003; ).

اكثر تستهای تشخیصی به صورت كیت های تجاری وارداتی، پرهزینه و وقت گیرهستند و به مواد و ابزارخاصی نیز نیاز دارند که آن ها را برای کاربرد فیلدی و کلینیکی نامناسب می سازند (et al. 2005 Chahanet al. 2003; Liao )، از این رو طراحی و ارزیابی تست تشخیصی با حساسیت و اختصاصیت بالا كه به ابزار اختصاصی پیشرفته نیاز نداشته باشد و در عین حال سریع و آسان انجام شود ضروری است.

تست لاتکس آگلوتیناسیون LAT)) یکی از راحت ترین تستهای تشخیصی است و در حال حاضر به عنوان یک تست تجاری در دسترس برای تشخیصتوکسوپلاسما گندئیاستفاده می شود (et al. 2004 Huang). در تحقیقی از تست لاتکس آگلوتیناسیون LAT)) با آنتی ژن نوترکیب TgMIC3 برای تشخیص سرولوژیکیتوکسوپلاسما گندئیاستفاده شده که به علت اختصاصیت بالا ، کاربرد سریع و ساده،کم هزینه بودن و مناسب برای استاندارد شدن، روش تشخیصی مناسبی گزارش شده است (Jianget al. 2008). تاکنون از این تست برای تشخیصنئوسپوراکانینوماستفاده نشده ولی از آنجایی که TgMIC3 هومولوگ NcMIC3 است و با سرم گاو آلوده بهنئوسپوراکانینومواکنش متقاطع می دهد ) Jianget al. 2008)، در تحقیق حاضر از NcSAG1 نوترکیب به عنوان آنتی ژن برای تشخیص آنتی بادی ضدنئوسپوراکانینومدر گاو استفاده شد (2005et al. Chahanet al. 2003; Liao).

هدف از این تحقیق طراحی و استاندارد کردن تست لاتكس آگلوتیناسیون LAT)) بر اساس آنتی ژن نوترکیب NcSAG1 برای تشخیص سرولوژیکینئوسپوراکانینومو مقایسه ی ارزش تشخیصی این تست با کیت تجاری الایزا است.

کلیات

1-2- تاریخچه

نئوسپوراکانینوم (Neospora caninum) تک یاخته داخل سلولی اجباری از شاخه آپی کمپلکسا (Apicomplexa) و بسیار شبیهتوکسوپلاسما گندئی(Toxoplasma gondii) است. در ابتدا در سگ های نروژی دارای علائم عصبی مانند آنسفالیت و فلجی اندام های حركتی انگلی شبیه بهتوكسوپلاسما گندئیگزارش شد (Bjerkaset al.1984). سپس انگل در سال 1987 در گوساله های مبتلا به میلوآنسفالیت مشاهده گردید ( Andersonet al. 2000).

در یك مطالعه گذشته نگر مقاطع آسیب شناسی، نشانه های بالینی و اطلاعات آزمایشگاهی ثبت شده از 23 سگ نروژی كه در آنها یك بیماری مانند توكسوپلاسموزیس تشخیص داده شده بود را مورد بررسی و با میكروسكوپ نوری و الكترونی مورد مطالعه قرار دادند. در 13 مورد عامل بیماریتوكسوپلاسما گندئیتشخیص داده شد، اما در 10 مورد دیگر از سگ ها یك جنس جدید به نامنئوسپوراو گونه ای به نامنئوسپورا كانینومكه از نظر ساختمانی و آنتی ژنی متفاوت ازتوكسوپلاسما گندئیبود، تشخیص داده شد. به این دلیل این انگلنئوسپورانام گرفت كه از لحاظ سیر تكاملی و ریخت شناسی مشابه با سایر اعضای دسته اسپوروزوآ (Sporozoea) بود و چون برای اولین بار تشخیص داده می شد انگل هاگ دار جدید یانئوسپورانام گرفت (2003b; Dubeyet al. 1988 Dubey).

تا مدت ها سیر تكاملی این انگل كاملاً روشن نبود و میزبان نهایی آن شناسایی نشده بود و تنها حدس زده می شد كه به دلیل شباهت هایی كه با خانواده ساركوسیستیده (Sarcocystidae) دارد باید میزبان نهایی آن یك گوشتخوار باشد. محققین تعداد زیادی از حیوانات و پرندگان را با مرحله كیستی انگل به طور تجربی آلوده كردند، اما نتوانستند اووسیست های انگل را به دست بیاورند و همچنان میزبان نهایی ناشناخته بود تا در یك بررسی اووسیست های انگل از دو قلاده سگ كه به طور طبیعی آلوده شده بودند، جدا شد و سگ به عنوان میزبان نهایی انگل معرفی شد. مدتی بعد نیز اووسیست های این انگل را از مدفوع چند قلاده كایوت جدا كردند و كایوت نیز به عنوان میزبان نهایی انگل مطرح شد
(Dubey 1992; Haddadet al. 2005 ).

از سال 1984 تا كنون شاهد پیشرفت های فراوانی در زمینه یافته های جدیدنئوسپورابوده ایم، به طوری كه تا كنون مقالات زیادی در زمینه های مختلف نئوسپوروزیس از نقاط مختلف جهان منتشر شده است. در ایران نیز اولین بار سقط ناشی ازنئوسپوراكانینومدر مشهد توسط رزمی و همكاران (2007) گزارش شد (Razmiet al. 2007 Dubey1999 b; ).

2-2– طبقه بندی انگل

تک یاختهنئوسپورا کانینومدر شاخه آپی کمپلکسا، رده اسپوروزوا، راسته اوکوکسیدیدا (Eucoccidiidae) ، خانواده سارکوسیستیده، تحت خانواده توکسوپلاسماتینه (Toxoplasmatinae) و جنسنئوسپوراقرار دارد (1999 Hemphill).

3-2- سیر تکاملی و ساختمان انگل