1-14)میل الحاقی به فیبرین.. 22

1-15)غلظت-فعالیت و نیمه عمر. 22

1-16)ساختار دومن ها 23

1-17)تاریخچه درمان تجزیه لخته. 24

1-18)داروهای تجزیه کننده فیبرین.. 24

1-19)طبقه بندی داروهای ترومبولیتیک… 24

1-20)انواع فعال کننده های پلاسمینوژن. 25

1-20-1) Streptokinase. 27

1-20-2) Urokinase. 27

1-20-3) Staphylokinase. 28

1-20-4) Alteplase. 28

1-20-5) Reteplase. 29

1-20-6) Tenecteplase. 30

1-20-7) Lanoteplase. 30

1-21) Truncated t-PA.. 30

1-20-8) میزبان های رایج در تولید پروتئین های نوترکیب… 32

1-21)انتخاب رده سلولی مناسب… 33

1-22)رده های سلولی رایج در بیان پروتئین های نوترکیب… 34

1-23)مزایای CHO.. 34

1-24)روش های بیان ژن. 34

1-24-1)سیستم بیان پایدار ژن Transient Gene Expression)) 34

1-24-2)سیستم بیان موقت ژن Transient gene expression)) 34

1-25)روش های انتقال ژن به سلول های پستانداران. 36

1-25-1)روشهای انتقال ژن غیر ویروسی.. 36

1-26)فاکتور های دخیل در کشت سلول های نوترکیب… 37

1-27)انواع سلول ها از نظر نحوه کشت… 37

1-27-1)سلول های غیر وابسته به بستر. 37

1-27-2)سلول های وابسته به بستر. 38

1-28) کشت معلق.. 38

1-29)انتخاب محیط کشت مناسب و شرایط محیط کشت… 39

1-30)بهینه سازی شرایط کشت سلول. 39

1-31)متابولیسم سلولی و تولید متابولیت های سلولی.. 39

1-31-1)نقش گلوکز در محیط کشت… 40

1-32)عناصر تشکیل دهنده محیط کشت… 41

1-32-1)عناصر ماکرو. 42

1-32-2)عناصر میکرو. 42

1-32-3)نقش عناصر میکرو در محیط کشت… 42

1-32-4)ویتامین ها 43

1-32-5) Pluronic acid. 43

1-33)نقش گلوتامین در محیط کشت… 44

مواد و روش ها 46

2-1)دستگاه های مورد نیاز. 47

2-2) میکروارگانیسم ها و سلول های مورد استفاده 47

2-3)لیست کامل مواد استفاده شده 48

2-4) لیست کامل وسایل مورد استفاده 50

2-5) شرایط لازم جهت انجام کشت سلول rCHO DG44. 50

2-5-1)محیط های کشت جهت فرایند بهینه سازی.. 51

2-5-1-1)تهیه محیط کشت BRC.. 51

2-5-1-2)ذخیره سازی سلول ها و محیط های کشت… 51

2-6)آماده سازی سلول هایrCHO DG44. 52

2-7) دفریز نمودن سلولهایrCHO DG44. 52

2-8) انکوباسیون سلول هایrCHO DG44. 53

2-8-1)انكوباتور دی اكسید كربن.. 53

2-8-2)دمای انکوباتور جهت کشت سلول rCHO DG44. 53

انکوباتور جهت کشت سلول rCHO DG44. 54

2-8-4) رطوبت انکوباتور جهت کشت سلول rCHO DG44. 54

2-9) استریلیزاسیون انکوباتور. 54

2-10) آنتی بیوتیک ها و آنتی مایکوتیک ها 55

2-10-1) میزان مصرف آنتی بیوتیک… 55

2-11) کشت سلول های rCHO DG44. 56

2-12)ارزیابی وضعیت محیط کشت از نظر pH.. 56

2-13) شمارش سلول های rCHO DG44. 57

2-13-1)اصول شمارش سلول. 57

2-13-2)تعیین درصد سلول های زنده Viability)) 59

2-13-3) انجماد سلولها و ذخیره سازی آنها Cell Freezing)) 59

2-14)ترانسفکشن سلول rCHO DG44. 60

2-14-1)پلاسمید حاوی ژن. 60

2-14-2)تهیه DNA 60

2-14-3)کشت سلول. 61

2-15)بهینه سازی فرایند TGE. 61

2-15-1)ترانسفکشن به روش PEI 61

2-15-2)بررسی میزان بهینه دانسیته سلولی جهت انجام TGE. 61

2-15-3)بررسی میزان بهینه DNA جهت انجام TGE. 62

2-15-4)اندازه گیری میزان درصد ترانسفکشن.. 62

2-15-4-1)اندازه گیری GFP به روش فلوسایتومتری.. 62

2-16)افزودن غلظت های متفاوت پپتون های گیاهی به محیط های کشت… 62

2-16-1) تعیین پروفایل رشد. 70

2-16-2)تعیین پروفایل بیان به روش Elisa. 70

2-16-2) بررسی تغییرات رفتار متابولیک سلول ها 72

نتایج.. 76

3-1)ترانسفکشن سلول های rCHO DG44 به روش TGE. 76

3-1-1)بررسی میزان بهینه PEI جهت انجام TGE. 76

3-1-2)بررسی میزان بهینه دانسیته سلولی جهت انجام TGE. 83

3-1-3)بررسی میزان بهینه DNAجهت انجام TGE. 96

3-2)تعیین الگوی رشد سلول های CH0 DG44 در محیط های کشت ProCHO 5,CD DG44و BRC.. 109

3-3)غلظت پپتون ها وابسته به نوع محیط کشت… 110

3-4)بررسی تغییرات متابولیکی در سلول های CHO DG44 تولید کننده t-PA.. 115

3-4-1)بررسی تغییرات متابولیکی در محیط ProCHO 5. 115

3-4-2)تغییرات متابولیکی در محیط CD DG44. 117

3-4-3) بررسی تغییرات متابولیکی در محیط BRC CD.. 118

3-5)بررسی تاثیر پپتون ها بر میزان بیان پروتئین نوترکیب… 119

3-6)بررسی تاثیر استراتژی تغذیه با پپتون های گیاهی در بهینه سازی TGE. 121

بحث و نتیجه گیری نهایی.. 129

منابع. 133

اختصارات… 136

Optimization of recombinant protein production in TGE system… 137

Abstract 137

چکیده

بیماریعروق کرونرقلب یکی از شایع ترین بیماری ها در سطح جهان به خصوص کشور های صنعتی می باشد.

فعال کننده پلاسمینوژن بافتی (t-PA( Tissue Plasminogen Activator، یک پپتید طبیعی است که با اتصال به فیبرین موجود در لخته و تبدیل پلاسمینوژن به پلاسمین باعث شکسته شدن فیبرین، فیبرینوژن و سایر پروتئین های انعقادی شده و با رفع انسداد باعث به حداقل رساندن آسیب بافتی و در نهایت نجات بیمار می شود.پروتئین مورد بررسی در این مطالعه فرم کوتاه شده موتانت از داروی t-PA باخواص فارماکولوژیک بهینه می باشد که در میزبان بیانی CHO(Chinese Hamster Ovary) با هدف تغییرات پس ترجمه ای مناسب و مشابه فرم طبیعی بیان می شود.