2-1- تجهیزات و دستگاه های مورد استفاده…………………………………………………………………………………………………18

2-2- مواد مصرفی و نحوه ساخت………………………………………………………………………………………………………………19

2-3- بخش آزمایشگاهی…………………………………………………………………………………………………………………………21

2-4- سویه های باکتری استفاده شده…………………………………………………………………………………………………………21

2-5- ناقل های استفاده شده………………………………………………………………………………………………………………………21

2-6-طراحی وسنتز ژن nsLTP2 برنج ایرانی……………………………………………………………………………………………..22

2-7- شرایط استریل کردن……………………………………………………………………………………………………………………….25

2-8-محیط کشت لوریا برتانی (LB)…………………………………………………………………………………………………………25

2-9- آنتی بیوتیک…………………………………………………………………………………………………………………………………26

2-10- شرایط کشت و نگهداری سویه های باکتری اشرشیا کلی………………………………………………………………………26

2-10-1- طرز تهیه استوک گلیسرول…………………………………………………………………………………………………………26

2-11- استخراج ناقل………………………………………………………………………………………………………………………………26

2-11-1- استخراج ناقل با روش لیز قلیایی……………………………………………………………………………………………………26

2-11-1-1- روش انجام استخراج ناقل با روش لیز قلیایی…………………………………………………………………………………28

2-11-2- استخراج ناقل با استفاده از کیت شرکت بیو بیسیک………………………………………………………………………….30

2-11-2-1- روش انجام استخراج ناقل با استفاده از کیت شرکت بیوبیسیک……………………………………………………….31

2-12- الکتروفورز DNA بر روی ژل آگارز………………………………………………………………………………………………32

2-12-1- مواد لازم جهت الکتروفورز DNA بر روی ژل آگارز……………………………………………………………………..32

2-12-1-1- بافر TAE…………………………………………………………………………………………………………………………..32

2-12-1-2- بافر TBE…………………………………………………………………………………………………………………………..33

2-12-1-3-تهیه ژل آگارز………………………………………………………………………………………………………………………33

2-12-1-4- نشانگر اندازه DNA…………………………………………………………………………………………………………….34

2-12-1-5-رنگ سایبر گرین………………………………………………………………………………………………………………….35

2-12-1-6- بافر بارگذاری………………………………………………………………………………………………………………………36

2-12-2- تعیین اندازه و غلظت DNA توسط الکتروفورز………………………………………………………………………………36

2-12-3- تخمین غلظت DNA با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر………………………………………………………………….36

2-13- تهیه سلول های مستعد از باکتری اشرشیاکلی با روش شیمیایی………………………………………………………………..37

2-13-1- مواد لازم………………………………………………………………………………………………………………………………..37

2-13-2- تهیه سلول مستعد………………………………………………………………………………………………………………………38

2-14- ترانسفورماسیون با روش شوک گرمایی…………………………………………………………………………………………….38

2-14-1- روش انجام ترانسفورماسیون………………………………………………………………………………………………………..39

2-15- هضم آنزیمی با آنزیم های محدود کننده…………………………………………………………………………………………..40

2-15-1- مواد لازم برای هضم آنزیمی با آنزیم های محدود کننده……………………………………………………………………40

2-15-1-1- آنزیم (Thermo scientific) XhoI…………………………………………………………………………………..42

2-15-1-2- آنزیم (Thermo Scientific) NcoI…………………………………………………………………………………..42

2-15-1-3 آنزیم BpiI (Thermo Scientific)……………………………………………………………………………………..42

2-16- خالص سازی DNA از ژل…………………………………………………………………………………………………………….42

2-16-1- مواد لازم برای خالص سازی DNA از ژل……………………………………………………………………………………43

2-16-2- روش انجام استخراج DNA از ژل………………………………………………………………………………………………43

2-17- تکنیک الحاق………………………………………………………………………………………………………………………………44

2-17-1-مواد لازم برای تکنیک الحاق……………………………………………………………………………………………………….44

2-17-2- روش انجام تکنیک الحاق…………………………………………………………………………………………………………..45

2-18- واکنش کلنی PCR……………………………………………………………………………………………………………………..45

2-18-1- روش انجام واکنش کلنی- PCR………………………………………………………………………………………………..45

2-19- تعیین توالی ژن rice-nsLTP2……………………………………………………………………………………………………..47

2-20-مطالعات بیوانفورماتیکی…………………………………………………………………………………………………………………47

2-20-1-نرم افزار ها و سرورهای مورد استفاده…………………………………………………………………………………………….47

2-20-2-برر سی توالی nsLTP2…………………………………………………………………………………………………………….48

2-20-3-بررسی هیدروفوبیسیته یnsLTP2 برنج ایرانی………………………………………………………………………………49

2-20-4-بررسی خاصیت آنتی ژنیسیتی nsLTP2 برنج ایرانی ……………………………………………………………………….50

2-20-5-Molecular Docking………………………………………………………………………………………………………….51

فصل سوم:نتایج

3-1-استخراج ناقل های pET26b و pUC57 با روش لیز قلیایی ………………………………………………………………52

3-2-نتایج هضم آنزیمی ناقل pET26b وقطعه ی nsLTP2 جهش یافته……………………………………………………….53

3-3-نتایج خالص سازی از ژل………………………………………………………………………………………………………………….54

3-4-واکنش الحاق………………………………………………………………………………………………………………………………..55

3-5-ترانسفورماسیون ناقل pET26b نوترکیب ایجاد شده…………………………………………………………………………..56

3-6-غربالگری ناقل های pET26b حاوی ژن nsLTP2 جهش یافته…………………………………………………………..57

3-6-1-واکنش کلنی-PCR…………………………………………………………………………………………………………………..57

3-6-2-نتایج استخراج ناقل های pET26b نوترکیب…………………………………………………………………………………58

3-6-3- نتایج هضم آنزیمی ناقل نوترکیب…………………………………………………………………………………………………59

3-6-4-نتایج تعیین توالی قطعه ی وارد شده به ناقل pET26b………………………………………………………………………60

3-7-نتایج بخش بیوانفورماتیک………………………………………………………………………………………………………………..61

3-7-1- بررسی ساختار اول پروتئین nsLTP2 برنج …………………………………………………………………………………..61

3-8- جهش زایی پروتئین nsLTP2 برنج ایرانی و Molecular Docking…………………………………………………67

فصل چهارم:بحث و نتیجه گیری

4-1 –کلیات…………………………………………………………………………………………………………………………………………68

4-2- مقایسهnsLTP2 و nsLTP1 ……………………………………………………………………………………………………….69

4-3- سنتز ژن جهش یافته nsLTP2 گیاه برنج ایرانی ………………………………………………………………………………….70

4-4 -همسانه سازی ژن جهش یافته ی nsltp2 برنج ایرانی……………………………………………………………………………..71

4-5- بررسی نوع وحشی و جهش یافته nsLTP2 گیاه برنج ایرانی…………………………………………………………………..71

4-6- بررسی خاصیت آنتی ژنیسیتی nsLTP2 گیاه برنج ایرانی………………………………………………………………………72

4-7- نتیجه گیری کلی…………………………………………………………………………………………………………………………….74

4-8- پیشنهادات جهت تحقیقات آینده……………………………………………………………………………………………………….75

فهرست شکل ها

عنوان صفحه

شکل1-1-تصویر شماتیک ناحیه ی کد کننده ی ژنLTP2 گیاه برنج ایرانی………………………………………………………5

شکل1-2-بررسی توالی nsLTP1 و nsLTP2 در برخی از گیاهان……………………………………………………………….5

شکل1-3-الگوی تشکیل چهار نوع پیوند دی سولفیدی در دو نوع LTP موجود در گیاه برنج………………………………6

شکل1-4-توالی و ساختار LTP1………………………………………………………………………………………………………………8

شکل 1-5-توالی و ساختار LTP2…………………………………………………………………………………………………………….9

شکل1-6-نمای کلی از وجود ساختار های ثانویه ی آلفا هلیکس در ساختار LTP1 و LTP2……………………………..9

شکل 1-7-تطابق اسید آمینه ای آلرژن های LTP……………………………………………………………………………………….12

شکل1-8-برهمکنش ترکیبات مختلف از جمله کلسترول وانواع LTP ،………………………………………………………….16

شکل2-1-دیاگرام شماتیک نقشه ی ژنتیکی pET26b………………………………………………………………………………..22

شکل 2-2-دیاگرام شماتیک نقشه ی ژنتیکی pUC57…………………………………………………………………………………23

شکل2-3-توالی ژنی طراحی شده ی nsLTP2 برنج ایرانی…………………………………………………………………………..24

شکل2-4-اندازه نمایDNA…………………………………………………………………………………………………………………..35

شکل2-5-نمایی شماتیک از واکنش ترانسفورماسیون…………………………………………………………………………………..40

شکل3-1-نتایج استخراج ناقل با کیت استخراج پلازمید شرکت بیوبیسیک……………………………………………………….53

شکل3-2-نتایج هضم آنزیمی…………………………………………………………………………………………………………………..54

شکل3-3-بررسی کیفیت قطعات استخراج شده از ژل…………………………………………………………………………………..55

شکل 3-4-نتایج تهیه ی سلول های مستعد………………………………………………………………………………………………….56

شکل3-5-نتایج ترانسفورماسیون ناقل pET26b…………………………………………………………………………………………57

شکل 3-6-نتیجه ی کلونی- PCR ………………………………………………………………………………………………………..58

شکل 3-7-استخراج ناقل pET26b نوترکیب……………………………………………………………………………………………59

شکل3-8-بررسی هضم آنزیمی ناقل نوترکیب…………………………………………………………………………………………….60

شکل3-9-نتیجه ی توالی یابی جهش های F39A و L28A ……………………………………………………………………..61

شکل3-10-بخش های غشاء گذر و هیدروفوب پروتئین nsLTP2 با روش TMHMM………………………………….63

شکل3-11-نواحی هیدروفوب توالی پروتئینی nsLTP2 با روش Sliding Widow……………………………………….64

شکل 3-12-. میانگین میزان آنتی ژنیسیته ی آمینو اسید های توالی پروتئینی nsLTP2 در حالت طبیعی………….65

شکل3-13- میانگین میزان آنتی ژنیسیته ی آمینو اسید های توالی پروتئینی nsLTP2 در توالی جهش یافته………………….65

شکل3-14- ساختار شیمیایی LysoPC14 ……………………………………………………………………………………………..67

فهرست جدول ها

عنوان صفحه

جدول1-1- ساختار های LTP1 بررسی شده به وسیله ی NMR و کریستالوگرافی اشعه ی X……………………………7

جدول 2-1-تجهیزات و دستگاه های مورد استفاده……………………………………………………………………………………….19

جدول2-2- فهرست مواد مورد استفاده……………………………………………………………………………………………………..20

جدول 2-3- ترکیبات محیط کشت LB…………………………………………………………………………………………………….25

جدول2-4- مواد لازم برای ساخت محلول I استخراج ناقل……………………………………………………………………………27

جدول 2-5-مواد لازم برای ساخت محلول II استخراج ناقل…………………………………………………………………………..27

جدول 2-6-مواد لازم برای ساخت محلول III استخراج ناقل……………………………………………………………………….28

جدول 2-7-مواد لازم برای ساخت محلول TE…………………………………………………………………………………………..28

جدول 2-8-محتویات کیت استخراج ناقل بیوبیسیک……………………………………………………………………………………30

جدول 2-9 مواد لازم برای ساخت بافر TAE10X…………………………………………………………………………………….32

جدول2-10- مواد لازم برای ساخت بافر TBE10X…………………………………………………………………………………..33

جدول 2-11-ترکیب بافر بارگذاری 6X……………………………………………………………………………………………………36

جدول 2-12- مواد لازم جهت تهیه سلول مستعد………………………………………………………………………………………….37

جدول 2-13-غلظت آنتی بیوتیک برای انتخاب سویه ی مقاوم……………………………………………………………………….39

جدول 2-14-ترکیبات لازم برای واکنش هضم آنزیمی دوگانه ب برای ناقل pET26b…………………………………….41

جدول2-15-ترکیبات لازم برای واکنش هضم آنزیمی دوگانه برای ناقل pUC57 …………………………………………..41

جدول 2-16-محتویات کیت استخراج DNA از ژل بیونیر……………………………………………………………………………43

جدول 2-17-ترکیبات لازم برای واکنش اتصال با استفاده از ناقل pET26b……………………………………………………45

جدول2-18-مواد مورد نیاز برای PCR…………………………………………………………………………………………………….46

جدول 2-19-برنامه ی زمانی و دمایی واکنش کلنی PCR……………………………………………………………………………47

جدول2-20-نرم افزار ها و سرورهای مورد استفاده……………………………………………………………………………………….48

جدول 2-21-میزان هیدروفوبیسیته ی هر آمینو اسید……………………………………………………………………………………..49

جدول2-22-پارامتر های تنظیم شده در زمان Docking……………………………………………………………………………..51

جدول3-1- ویژگی های فیزیکو شیمیایی nsLTP2 برنج ایرانی…………………………………………………………………..62

جدول 3-2-موتیف ها و محل قرار گیری آن ها روی توالی nsLTP2 برنج ایرانی……………………………………………63

جدول 3-3-نواحی آنتی ژن توالی پروتئینی nsLTP2 برنج ایرانی………………………………………………………………..64

جدول 3-4-نواحی آنتی ژنیک موجود در توالی nsLTP2 برنج ایرانی که با MHC-II واکنش می دهد……………66