2-10- روش های ارزیابی تنوع ژنتیکی……………………………………….. 16

2-11- نشانگرهای ژنتیکی……………………………………………………… 16

2-11-1- نشانگرهایمورفولوژیک………………………………………………. 16

2-11-2- مزایا و معایب نشانگرهای مورفولوژیک……………………………… 17

2-11-3- نشانگرهای مولکولی………………………………………………….. 18

2-11-3-1- خصوصیات مناسب یک نشانگر مولکولی…………………………. 19

2-11-3- 2-اهمیت نشانگرهای مولکولی DNA………………………………..

2-11-3-3- نشانگرهای بیوشیمیایی………………………………………….. 20

2-11-3-4- نشانگرهای مبتنی بر DNA…………………………………………

2-11-3-5- نشانگرهای DNA غیر مبتنی بر PCR……………………………

2-11-3-6- نشانگرهای DNA مبتنی بر PCR………………………………….

2-11-3-7- نشانگرهای DNA مبتنی بر PCR هدفمند و توالی یابی……..22

2-12- نشانگرهای مولکولی ISSR……………………………………………

2-12-1- علل ایجاد چندشکلی حاصل از نشانگر مولکولی ISSR…………..

2-12-1-1- نمونه DNA………………………………………………………….

2-12-1-2- ماهیت آغازگر………………………………………………………… 25

2-12-1-3- روش مورد استفاده برای تشخیص باندها………………………… 26

2-12-2- مزایای نشانگرهای ISSR………………………………………………

2-12-2-1- تکرارپذیری بسیار بالا……………………………………………….. 26

2-12-2-2- دقت بالا………………………………………………………………. 27

2-12-2-3- تنوع بالا……………………………………………………………….. 27

2-12-2-4- هزینه پایین………………………………………………………….. 27

2-12-2-5- سرعت و سهولت اجرا………………………………………………. 27

2-12-3- معایب نشانگرهای ISSR……………………………………………….

2-12- 4- انواع نشانگرهای ISSR………………………………………………..

2-12-4-1-تکنیک MP-PCR ……………………………………………………

2-12-4-2- تکنیک F-ISSR……………………………………………………..

2-12-5-کاربرد نشانگرهای مولکولی ISSR…………………………………..

2-12-5-1- انگشت­نگاری ژنومی………………………………………………… 29

2-12-5-2- مطالعات تنوع ژنتیکی و تجزیه و تحلیل فیلوژنتیکی……………29

2-12-5-3- نقشه­یابی ژنتیکی………………………………………………… 30

2-12-5-4- نشانمند کردن ژن و انتخاب به کمک نشانگر…………………….. 30

2-12-5-5- مشخص کردن فراوانی توالی­هایریزماهواره­ای………………….. 30

2-12-5-6- کاربرد نشانگرهای ISSR در شناسایی و رده­بندی گونه ها……31

2-13- تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی……………………………………………… 31

2-14- تخمین فاصله ژنتیکی……………………………………………………. 32

2-14- 1- روش گروهبندی افراد یا جمعیت ها………………………………….. 32

2-14-1-1-تجزیه خوشه ای……………………………………………………… 33

2-14-1-2- تجزیه به مختصات اصلی (PCoA)………………………………….. 34

2-14-2- معیارهای سودمندی نشانگرها………………………………………. 34

2-14-2-1- محتوی اطلاعات چندشکلی……………………………………….. 34

2-14-2-2- احتمال همسانی…………………………………………………… 35

2-14-2-3- قدرت تفکیک………………………………………………………….. 35

2-15- مروری بر مطالعات ژنتیکی و مورفولوژی انجام شده روی گونه های آژیلوپس….35

فصل سوم (مواد و روشها)……………………………………………………….. 40

3 -1- مواد گیاهی………………………………………………………………… 41

3-2- آغازگرها………………………………………………………………………. 43

3-3- مکان و زمان انجام آزمایش مولکولی…………………………………….. 43

3-4- عملیات زراعی……………………………………………………………….. 44

3 -4-1- مشخصات جغرافیایی محل انجام آزمایش مزرعه ای…………………. 44

3 -4- 2- طرح آزمایشی و مراحل اجرای آن………………………………………. 44

3 -5- استخراج DNA ژنومی………………………………………………………. 45

3-6- تعیین کمیت نمونه های DNA ژنومی…………………………………….. 47

3 -7- تعیین کیفیت نمونه های DNA ژنومی……………………………………. 48

3 -8- روش تهیه آگاروز 8/0و 5/1 درصد برای تعیین کمیت وکیفیت و تفکیک قطعات تکثیر شده…..48

3-9- آماده سازی نمونه ها واجرای الکتروفورز ژل آگاروز………………………… 49

3-10- اجزای واکنش زنجیره ای پلیمراز…………………………………………… 50

3-11- سیکل حرارتی و مراحل واکنش زنجیره­ای پلیمراز……………………….. 50

3 -12-توان و زمان مورد نیاز برای الکتروفورز محصول PCR………………………..

3 -13- مواد تشکیل دهنده بافرTE………………………………………………….

3-14- تهیه بافرTAE10X…………………………………………………………..

3 -15- اتیدیوم بروماید…………………………………………………………….. 53

3 -16- رنگ بارگذاری……………………………………………………………… 53

3 -17- مراحل رنگ آمیزی تا ظاهرسازی قطعات تکثیر شده…………………….53

3-18- تجزیه وتحلیل داده ها………………………………………………………… 54

3-18-1- امتیازبندی باندهای حاصل از داده های مولکولی……………………….54

3-18-2- تجزیه خوشه ای و آنالیز مولکولی…………………………………………54

فصل چهارم(بحث و نتیجه­گیری)…………………………………………………….55

4-1- نتایج استخراج DNA ژنومی…………………………………………………. 56

4 -2- نتایج واکنش زنجیره­ای پلیمراز……………………………………………… 56

4 -3- محاسبه چندشکلی نشانگرهای ISSR…………………………………….

4-4- محاسبه محتوای اطلاعات چندشکلی نشانگرهای ISSR…………………

4-5- محاسبه شاخص نشانگر(MI) نشانگرهای ISSR…………………………

4 -5- محاسبه ضرایب همبستگی کوفنتیک…………………………………….. 61

4-6- ترسیم دندروگرام جمعیت­هایAe.crassa…………………………………….

4-7- تجزیه به مختصات اصلی با استفاده از نرم­افزار DARWin وترسیم نمودار سه بعدی جمعیت­ها با نرم ­افزار Minitab

4-8- محاسبه فاصله ژنتیکی درون و بین جمعیت­هایAe.crassa……………..

4-9- محاسبه ماتریس فاصله و تشابه ژنتیکی شاخص Nei ………………….

4 -10- میزان آلل­های چندشکل در جمعیت­هایAe.crassa…………………….

4-11- محاسبه شاخص­های ژنتیکی در جمعیت­هایAe.crassa…………………

4 -12- تجزیه واریانس مولکولی………………………………………………….. 71

4-13- بررسی صفات مورفولوژی…………………………………………………. 72

4-13-1- همبستگی ساده فنوتیپی……………………………………………… 72

4-13-2- تجزیه کلاستر (خوشه­ای)…………………………………………………74

4-13-3- تجزیه به مولفه های اصلی……………………………………………… 76

4 -13-4- تجزیه علیت (مسیر)…………………………………………………….. 78

4-14- نتیجه­گیری کلی مولکولی…………………………………………………. 80

4-15- نتیجه­گیری کلی مورفولوژیکی……………………………………………….81

4-15-1 پیشنهادات…………………………………………………………………… 83

منابع…..……………………………………………………………………………………84

چکیده:

گیاهAegilops crassa،دارای دو سیتوتیپ تتراپلوئید وهگزاپلوئید با ژنوم ( 2n=2x=28 M^crM^crD^cr1D^cr1) و (2n=6x=42 M^crM^crD^cr1D^cr1D^cr2D^cr2) است. این گیاه یکساله و متعلق به خانواده گرامینه و طایفهTriticeaeمی باشد. بررسی تنوع ژنتیکی در ژرم­پلاسم گیاهی پیش­نیاز هر برنامه­ی اصلاحی یا حفاظتی گیاهان است. این تحقیق به منظور بررسی تنوع ژنتیکی بین 16 جمعیتAe.crassaبا استفاده از 10 آغازگر ISSR انجام شد. DNA ژنومی از گونه­ها در مرحله­ی دو تا سه برگی به روش CTAB با اندکی تغییرات استخراج و نتایج تکثیر با آغازگرهای مختلف روی ژل آگاروز 5/1 درصد مشاهده شدند. باندهای تکثیر شده به صورت حضور باند (یک) و عدم حضور باند (صفر) امتیازدهی و با نرم­افزارهای مولکولی و آماری، تجزیه و تحلیل داده­ها انجام گرفت. همچنین این آزمایش در قالب طرح آزمایشی اگمنت (در 3 بلوک) در مزرعه تحقیقاتی دانشکده کشاورزیدانشگاه ایلامانجام شد. از میان نمونه های ارزیابی شده سه نمونه که دارای بذر بیشتری بودند به عنوان شاهد استفاده شدند. نتایج تکثیر DNA ژنومی با استفاده از آغازگرهای ISSR، در مجموع 105 آلل تولید کرد که از این تعداد 86 آلل (9/81 درصد)، به عنوان آلل چندشکل تشخیص داده شد. اندازه آلل­های تکثیر شده از 190 (آغازگر UBC840) تا 1500 جفت باز (آغازگر 12،14) بود. محتوای اطلاعات چندشکلی از 17/0 در آغازگر UBC842 تا 34/0 برای آغازگر 12 متفاوت بود. همچنین با استفاده از نشانگر ISSR به ترتیب بیشترین و کم­ترین درصد باندهای چندشکل در جمعیت IUGB-00319 (05/39 درصد) و IUGB-01564 (48/10درصد) مشاهده گردید. جمعیت IUGB-00319 بالاترین شاخص تصحیح شده هتروژنی و میزان شاخص شانون را به خود اختصاص داد. آنالیز واریانس مولکولی نشان داد که سطح بیشتری از تنوع به درون جمعیت­ها (53 درصد) تعلق داشت، درحالی که (47 درصد) تنوع در بین جمعیت­ها مشاهده گردید. همچنین تجزیه خوشه ای داده ها با استفاده از ماتریس شاخص Nei با الگوریتم Nj انجام شد. دندروگرام بدست آمده جمعیت­ها را به سه گروه و زیر گروه­هایی تقسیم نمود و تا حدی عدم ارتباط بین تنوع مولکولی و تنوع جغرافیایی را نشان داد. نتایج این تحقیق نشان می­دهد که نشانگرهای ISSR برای ارزیابی میزان تنوع ژنتیکی در آژیلوپس کراسا مفید است.

فصل اول: مقدمه و اهداف

1-1- مقدمه

ایران یکی از غنی ترین مراکز دنیا از نظر ذخایر ژنتیکی گیاهی محسوب می شود. به عقیده گیاهشناسان ایرانی حدود 10 الی 12 هزار گونه گیاهی در ایران وجود دارد که آن را به عنوان یکی از غنی ترین مراکز تنوع ذخایر توارثی گیاهی در جهان ساخته است.گونه های وحشی به لحاظ داشتن ژن های مفید برای مقاومت به تنش های زنده و غیرزنده و گسترش سازگاری ژنتیکی در برابر تغییرات محیطی دارای اهمیت می باشند. برای استفاده از این منابع، اطلاع از ماهیت و میزان تنوع موجود در ژرم پلاسم، از اهمیت ویژه ای برخوردار است [108] . بررسی تنوع ژنتیکی در گیاهان زراعی برای برنامه های اصلاحی و حفاظت از ذخایر توارثی، حیاتی بوده و اطلاع از سطح تنوع ژنتیکی در گونه گیاهی برای انتخاب والدین جهت رسیدن به هیبرید مناسب از اهمیت زیادی برخوردار است [109]. بررسی تنوع ژنتیکی همچنین از جنبه مدیریت موثر و حفظ منابع ژرم پلاسم دارای اهمیت می باشد [96]. روش هایی که برای تخمین تنوع ژنتیکی مورد استفاده قرار گرفته اند متفاوت می باشند. از جمله ی آن ها می توان ثبت شجره، خصوصیات مورفولوژیکی و نشانگرهای مولکولی را نام برد [41]. آگاهی از تنوع ژنتیکی ژرم پلاسم ها معیاری مناسب برای استفاده از آن ها در شناسایی و انتقال ژن ها در بهبود گیاهان زراعی می باشند [41]. تنوع ژنتیکی اساس بیشتر برنامه های اصلاحی بوده و انجام گزینش منوط به وجود تنوع ژنتیكی مطلوب از نظر ویژگیهای مورد بررسی می باشد [32]. مطالعه تنوع ژنتیكی فرآیندی است كه تفاوت یا شباهت گونه ها، جمعیت ها و یا افراد را با استفاده از روش ها و مدل های آماری خاص بر اساس صفات مورفولوژیك، اطلاعات شجره ای یا خصوصیات مولكولی افراد بیان می کنند [32]. تعیین سطح تنوع ژنتیکی یکی از مراحل اساسی در مدیریت مؤثر و استفاده از ذخایر ژنتیکی می باشد [96،23،7]. منابع ژنتیكی یا ذخایر توارثی به دلیل اهمیت فراوانی كه دارند یكی از ارزشمند ترین ثروت های ملی و منابع پایه ای در هر كشور محسوب می شوند [1]. یکی از عواقب اصلاح نباتات موفق، افزایش فرسایش یا کاهش منابع ژنتیکی گیاهی بوده که تحت برنامه انتخاب قرار گرفته اند. در سال های اخیر عوامل بسیار زیادی در فرسایش ژنتیکی و نابودی ذخایر ژرم پلاسم نقش داشته اند [16]. استفاده از واریته های اصلاح شده بجای واریته های بومی، اعمال روش های مدرن زراعی مانند استفاده از سموم علف کش، پیشرفت شهرها و مراکز صنعتی، مسکونی شدن زمین های زراعی و مرتعی، تغییر روش های کشت و سایر عواملی که منجر به فرسایش و انقراض مواد با ارزش می شوند که به طور مستقیم وغیر مستقیم در کشاورزی و اصلاح نباتات قابل استفاده هستند. بنابراین حفاظت و استفاده از منابع ژنتیکی گیاهی برای بقا و بهبود تولیدات زراعی ضروری بوده و به عنوان نیازی اساسی در توسعه پایدار و کاهش فقر محسوب می شود. تنوع ژنتیکی اساس اکثر برنامه های اصلاح نباتات می باشد [111،74،7]. موفقیت در اصلاح یک گیاه زراعی، در درجه اول به دسترسی تنوع ژنتیکی موجود در آن گیاه بستگی دارد، ضمن اینکه تنوع ژنتیکی یکی از ارکان اصلی کشاورزی پایدار است و وجود تنوع ژنتیکی در نظام های زراعی با درس گرفتن از طبیعت باید همواره مد نظر قرار گیرد. مدیریت و استفاده صحیح از تنوع موجود در ارقام محلی و خویشاوندان وحشی یک گونه گیاهی در اجرای برنامه های موثر اصلاحی بسیار مهم است. اولین قدم در اصلاح یک گیاه، شناسائی دقیق ساختار ژرم پلاسم آن گیاه است که این مطلب خود نمونه گیری منظم و دقیق از ژرم پلاسم را برای اهداف اصلاحی و حفاظتی امکان پذیر خواهد ساخت. کاهش تنوع علاوه بر کاهش بازده برنامه های اصلاحی، باعث یکنواختی ژنتیکی در مزارع و آسیب پذیری شدید محصولات کشاورزی در برابر آفات، بیماری ها و تنش های محیطی می گردد. خویشاوندان وحشی گیاهان، دربردارنده منابع ژنی با ارزش برای مقاومت به تنش های زنده و غیرزنده می باشند.

توده های وحشی و نژادهای بومی از مهم ترین منابع تنوع ژنتیکی در دسترس می باشند [26]. اهلی سازی جمعیت های برتر انتخاب شده از بین تعداد زیادی توده می تواند پیشرفت قابل توجهی در تأمین نیاز صنایع وابسته بدون نیاز به روش های پرهزینه و گران اصلاحی ایجاد نماید [26]. اهلی کردن، فرآیندی طولانی است، اما با انتخاب مناسب در شروع به شدت بر سرعت آن افزوده می شود [26]. بنابراین، با بررسی تنوع موجود، آگاهی از ساختار ژنتیکی جمعیت و بررسی تنوع فنوتیپی و ویژگی های شیمیایی می توان در بین توده های طبیعی به انتخاب، به عنوان اولین روش اصلاحی در طی اهلی کردن پرداخت [26]. تنوع ژنتیکی، کلیدی برای به نژادی گیاهان است. دانش روابط ژنتیکی بین توده های مختلف به مدیریت ژرم پلاسم کارآمد و استراتژی های بهره برداری کمک بزرگی می نماید. تنوع ژنتیکی گیاهان طی هزاران سال ایجاد شده و در طبیعت به صورت پایدار باقی مانده است [26].

ارقام بومی گیاهان زراعی و خویشاوندان وحشی آن ها، به دلیل قدمت و سازگاری شان به شرایط زیستی و عوامل نامسائد محیطی دارای مناسب ترین ژن ها بوده وتنوع ژنتیکی مورد نیاز اصلاح گیاه را تأمین می نماید [13]. تعیین میزان تنوع ژنتیکی در مواد گیاهی گام اولیه برای شناسایی، حفظ ونگهداری ذخایرتوارثی ونیز پایه اساسی و اولیه برای تحقیقات ژنتیکی و برنامه های اصلاحی می باشد [27].