1-1-6- گیرنده هورمون انسولین…………………………………………………………………………………. 13
1-2- بیماری دیابت قندی…………………………………………………………………………………………………… 15
1-2-1- دیابت نوع- I…………………………………………………………………………………………………….. 15
1-2-1-1- دیابت آدیوپاتیک……………………………………………………………………………………. 16
1-2-2- دیابت نوع- II…………………………………………………………………………………………………… 16
1-2-3- دیابت حاملگی………………………………………………………………………………………………….. 17
1-2-4- عوارض بیماری دیابت ……………………………………………………………………………………. 17
عنوان صفحه
1-3- آسپرین ………………………………………………………………………………………………………………………. 19
1-3-1- ساز و کار عملکرد آسپرین …………………………………………………………………………….. 21
1-4- تا خوردگی و تجمعات پروتئینی……………………………………………………………………………….. 22
1-4-1- تجمعات منظم پروتئینی: فیبر آمیلوئیدی…………………………………………………….. 25
1-4-2- مراحل تشکیل فیبریل ها……………………………………………………………………………….. 26
1-4-3- پدیده فیبریلاسیون هورمون انسولین…………………………………………………………….. 28
1-5- نقش چاپرون ها در جلوگیری از فرآیند توده ای شدن
و فیبریلاسیون پروتئین ها……………………………………………………………………………………………………. 32
1-5-1- چاپرون های آلفا کریستالین و بتا کازئین……………………………………………………… 32
فصل دوم: مروری بر پژوهش های پیشین…………………………………………………………………………. 35
فصل سوم: مواد و روش های تحقیق
3-1- مواد مصرفی و رده ی سلولی…………………………………………………………………………………….. 40
3-1-1- مواد مصرفی……………………………………………………………………………………………………… 40
3-1-2- رده ی سلولی…………………………………………………………………………………………………… 41
3-2- تهیه محلول ها……………………………………………………………………………………………………………. 41
3-2-1- تهیه محلول های مورد نیاز کشت سلول سرطانی…………………………………………. 41
3-2-1-1- تهیه محلول MTT………………………………………………………………………………… 41
3-2-1-2- تهیه محلول تریپان بلو جهت رنگ آمیزی و شمارش
سلول های زنده و غیر زنده……………………………………………………………………………………… 41
3-2-1-3- تهیه محلول SDS-DMF……………………………………………………………………… 42
3-2-2- تهیه ی محلول های پروتئینی………………………………………………………………………… 42
عنوان صفحه
3-2-2-1- تهیه ی محلول انسولین ………………………………………………………………………. 42
3-2-2-2- تهیه محلول های بتاکازئین و آلفاکریستالین………………………………………. 43
3-2-3- تهیه ی محلول های مورد نیاز………………………………………………………………………. 43
3-2-3- 1- تهیه محلول بافر فسفات…………………………………………………………………….. 43
3-2-3-2- تهیه ی محلول استوک ANS……………………………………………………………… 44
3-2-3-3- تهیه ی محلول استوک تیوفلاوین T ………………………………………………… 45
3-2-3-4- تهیه محلول استوک کنگورد………………………………………………………………… 46
3-2-3-5- تهیه محلول OPA………………………………………………………………………………. 47
3-2-3-6- تهیه محلول فلورسامین………………………………………………………………………. 48
3-2-4- تهیه محلول های مورد نیاز ژل الکتروفورز …………………………………………………… 48
3-2-4-1- تهیه محلول آکریل آمید و بیس آکریل آمید……………………………………… 48
3-2-4-2- تهیه محلول 20 درصد SDS…………………………………………………………….. 48
3-2-4-3- تهیه محلول 10 درصد آمونیوم پرسولفات (APS) …………………………. 49
3-2-4-4- تهیه محلول بافر تریس 5/1 مولار ……………………………………………………… 49
3-2-4-5- تهیه محلول بافر تریس 5/0 مولار ……………………………………………………. 49
3-2-4-6- تهیه محلول بافر تانک…………………………………………………………………………. 50
3-2-4-7- تهیه بافر نمونه X2 ……………………………………………………………………………. 50
3-2-4-8- تهیه محلول رنگ آمیزی کوماسی بلو………………………………………………… 51
3-2-4-9- تهیه محلول رنگ زدای کوماسی بلو……………………………………………………. 51
3-3- روش های استفاده شده در این پژوهش………………………………………………………………….. 52
3-3-1- تخلیص آلفا کریستالین ………………………………………………………………………………… 52
3-4- روش های تحقیق………………………………………………………………………………………………………. 53
3-4-1- فرآیند استیلاسیون هورمون انسولین پانکراس گاوی با آسپیرین……………….. 53
عنوان صفحه
3-4-2- الکتروفورز ژلی هورمون انسولین استیله و غیر استیله
به منظور بررسی میزان استیلاسیون و تشکیل توده های پروتئینی
با وزن مولکولی بالا………………………………………………………………………………………………………….. 53
3-4-3- تعیین گروه های آمین آزاد/ غیر واکنش دهنده در هورمون انسولین……….. 54
3-4-4- مطالعه فلورسانس ذاتی هورمون انسولین در حضور آسپیرین…………………….. 55
3-4-5- مطالعه فلورسانس عارضی هورمون انسولین در حضور آسپیرین………………… 56
3-4-6- بررسی تشکیل فیبر آمیلوئیدی هورمون انسولین در حضور
آسپیرین با استفاده از آزمون فلورسانس تیوفلاوین T (ThT) و آزمون
اسپکتروسکوپی سنجش جذبی کنگورد……………………………………………………………………….. 57
3-4-7- بررسی توده ای شدن پروتئین انسولین استیله و غیر استیله ……………………. 58
3-4-8- مطالعه اثر استرس های شیمیایی و فیزیکی در القاء تشکیل
فیبر آمیلوئیدی انسولین استیله و غیر استیله…………………………………………………………….. 58
3-4-9- مطالعه جلوگیری از توده ای شدن هورمون انسولین استیله
و غیر استیله با چاپرون های بتا کازئین و آلفا کریستالین……………………………………………. 59
3-4-10- مطالعه ساختار دوم انسولین به روش دو رنگ نمای دورانی
در حضور آسپیرین ………………………………………………………………………………………………………… 59
3-4-11- مطالعه هورمون انسولین به روش دستگاه پراکندگی
پویای نور در حضورآسپیرین……………………………………………………………………………………………. 61
3-4-12- مطالعه تغییرات کشش سطحی نمونه های
انسولین استیله و غیر استیله………………………………………………………………………………………… 62
3-4-13- مشاهده ی فیبر آمیلوئیدی پروتئین با دستگاه
میکروسکوپ فلورسانس…………………………………………………………………………………………………… 63
3-4-14- بررسی فعالیت القا مرگ سلولی انسولین استیله با سنجش MTT …………. 63
3-4-15- آزمون آماری………………………………………………………………………………………………….. 65
عنوان صفحه
فصل چهارم: نتایج و بحث
4-1- مطالعه استیلاسیون پروتئین انسولین پانکراس گاوی در حضور آسپیرین……………. 67
4-2- مطالعه بررسی استیلاسیون پروتئین انسولین…………………………………………………………. 67
4-3- بررسی پیدایش گونه های مولکولی با وزن بالای انسولین در حضور آسپیرین
با الکتروفورز ژلی……………………………………………………………………………………………………………………. 70
4-4- مطالعه پیدایش گونه های مولکولی مختلف انسولین در حضور آسپیرین
با روش پراکنش پویای نور…………………………………………………………………………………………………… 73
4-5- مطالعه ساختار دوم پروتئین انسولین استیله به روش دو رنگ نمای دورانی……….. 75
4-6- مطالعه ساختار سوم انسولین استیله با روش فلورسانس ذاتی و محیطی…………….. 78
4-7- مطالعه کشش سطحی انسولین نمونه های مختلف انسولینی……………………………….. 80
4-8- بررسی توده ای شدن پروتئین انسولین بعد از فرآیند استیلاسیون…………………….. 82
4-9- بررسی تشکیل فیبر آمیلوئیدی پروتئین انسولین در حضور آسپیرین
با روش های اسپکتروسکوپی………………………………………………………………………………………………. 84
4-10- مطالعه ی میکروسکوپی تشکیل فیبر آمیلوئیدی به وسیله ی پروتئین
انسولین در حضور آسپیرین………………………………………………………………………………………………… 87
4-11- مطالعه ی اثر استرس های شیمیایی و فیزیکی بر ساختار و ویژگی های
آمیلوئیدی انسولین استیله و غیر استیله…………………………………………………………………………….. 88
4-12- مطالعه کینتیک توده ای شدن نمونه های مختلف انسولینی……………………………. 93
4-13- جلوگیری از فرآیند توده ای شدن نمونه های مختلف انسولینی
به کمک دو چاپرون مولکولی آلفا کریستالین و بتا کازئین……………………………………………….. 94
4-14- مطالعه ی سمیت توده های پروتئینی انسولین استیله……………………………………….. 97
نتیجهگیری……………………………………………………………………………………………………………………………… 99
فهرست منابع و مآخذ101
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول3-1- مقادیر لازم برای تهیه ی 1 لیتر بافر فسفات………………………………………………………. 43
جدول3-2- مقادیر لازم برای تهیه ی 1 لیتر بافر تانک………………………………………………………….. 50
جدول 3-3- مقادیر مورد نیاز جهت تهیه ی 25 میلی لیتر بافر نمونه…………………………………. 51
جدول 4-1- تغییرات شعاع هیدرودینامیک پروتئین انسولین در حضور آسپیرین……………… 75
جدول 4-2- محتوای ساختارهای دوم نمونه های مختلف انسولین بر حسب درصد…………… 77
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل 1-1- توالی اسید آمینهی پروتئین انسولین انسانی……………………………………………………….. 4
شکل 1-2- ساختار سوم و چهارم انسولین……………………………………………………………………………….. 7
شکل1-3- نمایی از مراحل سنتز هورمون انسولین………………………………………………………………….. 9
شکل 1-4- نمایی شماتیک از سلول بتای پانکراس
و چگونگی ترشح انسولین از این سلول…………………………………………………………………………………….. 10
شکل1-5- مدل ساختاری گیرنده انسولین……………………………………………………………………………… 14
شکل1-6- نمایی از ساختار مولکولی داروی آسپیرین……………………………………………………………. 20
شکل1-7- نمایی از مراحل تاخوردگی پروتئین………………………………………………………………………. 23
شکل1-8- نمایی از ایجاد حالات مولکولی گوناگون در مسیر تاخوردگی پروتئین……………….. 25
شکل1-9- تصویر شماتیک الگوی پراش اشعه X ساختار های بتا در فیبرهای آمیلوئید….. 26
شکل1-10- کینتیک تشکیل فیبر آمیلوئیدی………………………………………………………………………… 27
شکل 1-11- نمایی از ساز و کار فیبریلاسیون هورمون انسولین………………………………………….. 28
شکل1-12- مدل سلسله مراتبی تجمع انسولین در تشکیل فیبر آمیلوئید………………………….. 31
شکل 3-1- نمایی از طیف جذبی انسولین………………………………………………………………………………. 43
شکل3-2- نمایی از طیف جذبی ANS………………………………………………………………………………….. 44
شکل3-3- نمایی از طیف جذبی تیو فلاوین-T………………………………………………………………………. 45
شکل 3-4- نمایی از طیف جذبی کنگورد……………………………………………………………………………….. 46
شکل3-5- نمایی از ساختار ترکیبOPA………………………………………………………………………………. 47
عنوان صفحه
شکل3-6- نمایی از ساختار شیمیایی ترکیب فلورسامین………………………………………………………. 48
شکل 3-7- دستگاه فلورسانس Cary-Eclips………………………………………………………………………….. 57
شکل 3-8- نمایی از دستگاه دورنگ نمای دورانی215 Aviv……………………………………………… 60
شکل 3-9- نمایی از دستگاه DLS………………………………………………………………………………………….. 61
شکل3-10-دستگاه کشش سنج Kruss K100…………………………………………………………………….. 62
شکل3-11- نمایی از دستگاه میکروسکوپ فلورسانس Olympus-CX31…………………………… 63
شکل 3-12- نمایی از خانه های پلیت کشت سلولی……………………………………………………………… 64
شکل 3-13- تبدیل MTTبه فورمازان در یک واکنش کاهشی
در میتوکندری سلول های زنده…………………………………………………………………………………………………. 65
شکل 4-1- نتایج حاصل از مطالعه ی استیلاسیون پروتئین انسولین
با استفاده از آزمون های جذبیOPA و نشری فلورسامین………………………………………………………. 69
شکل 4-2- نمایی از الکتروفورز طبیعی و غیر طبیعی (احیایی و غیر احیایی )
نمونه های مختلف هورمون انسولین………………………………………………………………………………………….. 71
شکل 4-3- نمایی از الکتروفورز طبیعی و غیر طبیعی (احیایی و غیر احیایی )
نمونه های مختلف هورمون انسولین………………………………………………………………………………………… 72
شکل 4-4- مطالعه ی DLS نمونه های متفاوت انسولین……………………………………………………… 74
شکل 4-5- طیف دو رنگ نمای دورانی محدوده فرابنفش دور نمونه های
انسولین استیله شده در مدت زمان 20 روز و 36 روز………………………………………………………… 76
شکل 4-6- طیف نشری فلورسانس ذاتی نمونه های مختلف انسولین………………………………….. 79
شکل 4-7- طیف نشری فلورسانس عارضی نمونه های مختلف انسولین……………………………… 80
شکل 4-8- مطالعه ی تغییرات کشش سطحی نمونه های متفاوت انسولین
طی انکوباسیون در مدت زمان 20 و 36 روز…………………………………………………………………………… 82
شکل 4-9- مطالعه ی توده ای شدن انسولین در حضور آسپیری………………………………………… 83
عنوان صفحه
شکل 4-10- مطالعه ی فلورسانس تیوفلاوین T نمونه های انکوبه شده
20 روز و 36 روز انسولین در حضور آسپیرین………………………………………………………………………. 85
شکل 4-11- مطالعه ی اتصال کنگورد به نمونه های مختلف انسولینی………………………………. 86
شکل 4-12- تصویر فیبر آمیلوئیدی پروتئین انسولین مشاهده شده
با فلورسانس تیوفلاوین T………………………………………………………………………………………………………….. 88
شکل 4-13- مطالعه ی نشر فلورسانس ذاتی نمونه های متفاوت انسولین
در حضور استرس شیمیایی و فیزیکی…………………………………………………………………………………….. 90
شکل4-14- مطالعه ی نشر فلورسانس عارضی نمونه های متفاوت انسولین
در حضوراسترس شیمیایی و فیزیکی………………………………………………………………………………………. 91
شکل 4-15- مطالعه ی فلورسانس تیوفلاوین T نمونه های متفاوت انسولین
در حضور استرس شیمیایی و فیزیکی…………………………………………………………………………………….. 92
شکل 4-16- مطالعه ی کنیتیک توده ای شدن نمونه های مختلف انسولینی……………………. 94
شکل 4-17- مطالعه جلوگیری از فرآیند توده ای شدن نمونه های مختلف
انسولین با استفاده از چاپرون های بتا کازئین و آلفا کریستالین……………………………………………. 96
شکل 4-18- نتایج حاصل از آزمون MTT پس از 24 ساعت انکوبه کردن
رده سلول سرطانی Jurkat با فیبر نمونه های انسولینی استیله وغیراستیله………………………… 98
علائم اختصاری
BPI: Bovine Pancreatic Insulin.
OPA:o-Phthalaldehyde.
ANS: 1-anilino-8-naphthalene sulfonate.
CD: Circular dichroism.
CDNN: Context dependent neural networks.
DLS: Dynamic light scattering.
DMF: Dimethylformamide.
DMSO: Dimethyl Sulfoxide.
DTT: Dithiothreitol.
MTT: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide.
RH: Hydrodynamic radius.
RPMI: Rapid Prototyping & Manufacturing Institute.
SDS: Sodium dodecyl sulfate.
ThT: Thioflavin T.
هورمون انسولین
