2-1 بیوانفورماتیک و نقش آن در زیستفناوری

1-2-1 پایگاهداده

1-1-2-1 جایگاه Expasy

2-1-2-1 پایگاهداده Swiss-Prot

3-1-2-1- پایگاهدادهProsite یا پایگاهداده موتیفها

3-1 کاربرد بیوانفورماتیک در پیشگویی ساختار پروتئین

1-3-1 پیشگویی ساختار دوم پروتئینها

2-3-1 پیشگویی ساختار سوم پروتئینها

4-1 نمایش ساختار پروتئین

5-1 مقایسه ساختار سوم پروتئینها

6-1 فلزات سنگین و اثرات زیستمحیطی آنها

7-1 منابع تولید کننده آلودگیهای فلزات سنگین

8-1 کادمیوم

9-1 حذف فلزات سنگین از محیطزیست

1-9-1 روشهای فیزیکوشیمیائی

1-1-9-1 روش اسمز معکوس

2-1-9-1 روش دیالیز الکتریکی

3-1-9-1 روش اولترا فیلتراسیون

4-1-9-1 تبادل یونی

5-1-9-1 رسوبدهی شیمیایی

2-9-1 روشهای پاکسازی زیستی

1-2-9-1 پاکسازی گیاهی

2-2-9-1 جذب زیستی

1-2-2-9-1 سازکارهای جذب زیستی

1-1-2-2-9-1 فرایند رسوب و تجمع خارج سلولی

1-1-1-2-2-9-1 جذب الکتریکی

2-1-1-2-2-9-1 جذب فیزیکی یا جذب با دخالت نیروهای واندروالس

3-1-1-2-2-9-1 جذب شیمیایی

2-1-2-2-9-1 رسوب وتجمع داخل سلولی

1-2-1-2-2-9-1 متیلهکردن فلز

2-2-1-2-2-9-1 سولفوره کردن

3-2-1-2-2-9-1 رسوب فلزات مسموم کننده به صورت غیرمستقیم

10-1سازکارهای ورود فلزات سنگین به ریزسازوارهها

11-1 پروتئینها و پپتیدهای عمومی متصل شونده به فلزات سنگین

12-1 نمایش سطحی باکتریایی

1-12-1 نمایشسطحی در باکتریهای گرممنفی

2-12-1 نمایش پروتئینهای هترولوگ در باکتریهای گرم مثبت

13-1 افزایش جذبزیستی فلزات سنگین در باکتریهای گرم منفی با روشهای مهندسی ژنتیک با تاکید بر نمایشسطحی

14-1 سازکار تشکیل پیلی باکتریایی

1-14-1 پیلیهای باکتریایی و پیلی CS3

1-1-14-1 سازمان دهی ژنتیکی اپرونcst

2-1-14-1 تنظیم بیان CS3

15-1 اهداف تحقیق

فصل دوم: مواد و روشها

1-2 بررسیهای بیوانفورماتیکی

1-1-2 پایگاههایداده و برنامههای بیوانفورماتیکی

2-1-2 ساختار پروتئین و روشهای پیشگویی عملکرد

1-1-2-1-2 جستجوی (شباهت) در پایگاهداده توالی

3-1-2 روشهای آنالیز ساختار اول

4-1-2 روشها و برنامهی پیشگویی ساختار و عملکرد پروتئین

5-1-2 ابزارهای مشاهده و آنالیز ملکولی

2-2 روشهای بیوانفورماتیکی

1-2-2 پیشگویی ساختار دوم

2-2-2 پیشگویی ساختار سوم پروتئینها و مدلسازی

1-2-2-2 جستجوی توالیهای مشابه با PSI-Blast و Blast در مقابل پایگاهداده PDB

2-2-2-2 مدلسازی مقایسهای

1-2-2-2-2 سرور SWISS-MODEL

2-2-2-2-2 مدلسازی با برنامه Modeller

3-2-2-2 مدلسازی براساس روش شناسایی تاخوردگی

4-2-2-2 شبیه سازی دینامیک مولکولی با استفاده از نرم افزار GROMACS

5-2-2-2 تغییرات RMSD

1-5-2-2-2اندازه گیری RMSD با نرم افزار Swiss-pdb viewer

2-4-2-2-2اندازهگیری RMSD با برنامه تحت شبکه CE

3-2-2 پیشگویی سطوح در دسترس و سطوح مشترک بین دو پروتئین

3-2 مواد

1-3-2 ترکیبات استفادهشده

2-3-2 آنتی بیوتیک ها

3-3-2 آنتیبادیهای اولیه

4-3-2 آنتیبادیهای ثانویه

5-3-2 باکتریها

6-3-2 پلاسمیدها

7-3-2 اولیگونوکلئوتیدها

8-3-2 کیتهای آزمایشگاهی

9-3-2 آنزیمها

10-3-2 نشانگرها

11-3-2 محلولها و بافرها

12-3-2 محیطهای کشت

1-12-3-2 محیطهایکشت CFA آگار

13-3-2 محلول های مورد نیاز برای تهیه سلول های باكتریایی مستعد

14-3-2 محلولهای مورد نیاز به منظور نگهداری باکتریها

4-2 وسایل و دستگاهها

5-2 روشها

1-5-2 کشت باکتری

2-5-2 استخراج پلاسمید

1-2-5-2 استخراج پلاسمید با روش شکستن قلیایی

3-5-2 استخراج DNA پلاسمیدی با استفاده از کیت

4-5-2 بازیافت قطعات DNA از روی ژلآگارز با استفاده از کیت

6-5-2 تهیه باکتریهای مستعد برای پذیرش DNA پلاسمید خارجی

1-6-5-2 مستعد سازی باکتریها

7-5-2 انتقال پلاسمید به درون باکتری

8-5-2 واکنش زنجیرهای پلیمراز(Polymerase chain reaction, PCR)

1-8-5-2 SOEing-PCR (Splicing by overlap extension PCR)

1-1. 9-5-2 کلونینگ ژن جهش یافته cstHدر وکتورpBR322

10-5-2 تائید صحت کلونهای واجد پلاسمید نوترکیب (Screening)

11-5-2 بررسی پروتیئنها

1-11-5-2 استخراج پروتیئن پیلی از باکتری

2-11-5-2 سنجش پروتیئن به روش برادفورد(Baradford)

1-2-11-5-2 رسم منحنی استاندارد پروتئین

3-11-5-2 وسترنبلاتینگ (Western Blotting)

4-11-5-2 لکهگذاری برای سلولهای باکتری

12-5-2 رنگ آمیزی ایمینوفلوروسنس

13-5-2 بررسی میزان جذب یون فلز

14-5-2 ویژگیهای پلاسمیدهای استفادهشده در این مطالعه

15-5-2 بررسی های آماری

فصل سوم: نتایج

1-3 نتایج بررسی های بیوانفورماتیکی

1-1-3 شناسایی و طراحی موتیف(پپتید) متصل شونده به فلزات

2-1-3 آنالیز ساختاری پروتئین CstH جهت پیشگویی جایگاه مجاز در آن

1-2-1-3 شناسایی الگو و همردیفی توالی الگو–هدف

2-2-1-3 تولید و ساخت مدل و ارزیابی کیفیت آنها

3-2-1-3 سطوح قابل دسترس و اسیدهایآمینه سطحی

4-2-1-3 سطوح مشترک و اسیدهایآمینه درگیر در ارتباطات زیرواحدها در پلیمر پیلی و زیرواحد–چاپرون

5-2-1-3 پیشگویی و تعیین ساختار دوم

3-1-3 پیشگویی نهایی مناطق مجاز در زیرواحد CstH

4-1-3 مدلسازی پروتئینهای هیبرید

2-3 نتایج آزمایشگاهی

1-2-3 ساخت کاست های ژنی از ترکیب ژنcstHو توالی متصل شونده به کادمیوم

101

2-2-3 کلونینگ DNA زیرواحد اصلی(CstH) جهشیافته در وکتور کلونینگ

103

1-2-2-3 غربالگری کلونهای دارای پلاسمیدهای نوترکیب

103

1-1-2-2-3 غربالگری با مقاومت آنتیبیوتیکی و مقایسه وزنی با پلاسمیدهای کنترل

103

2-1-2-2-3 غربالگری با PCR

105

3-1-2-2-3 برش آنزیمی

105

4-1-2-2-3 تعیین توالی ژنهایCstH::CbmوCstH::Cbβmدر کلونهای نوترکیب

106

3-2-3 کلونینگ ژنهایcstH::cbmوcstH::cbβmدر اپرون cst

108

1-3-2-3 غربال کردن کلون های حاوی اپرون هیبریدcst::cbmوcst::cbbm

109

1-1-3-2-3 تائید صحت کلونینگ با برش آنزیمی

110

2-1-3-2-3 تائید کلونیگ با PCR

112

4-2-3 بررسی بیان پیلیهای هیبرید CS3::cbβm و CS3::cbm توسط روشهای داتبلاتینگ باکتری و وسترن پروتئین

113

1-4-2-3 دات بلاتینگ باکتری

114

2-4-2-3 وسترن بلاتینگ

115

5-2-3 بررسی نمایش سطحی پیلیهای هیبرید CS3::cbβm و CS3::cbm توسط رنگآمیزی ایمونوفلورسانس

117

6-2-3 بررسی خاصیت اتصال به فلز باکتریهای بیان کننده پیلی CS3 نوترکیب

119

1-6-2-3 جذب کادمیم

120

2-6-2-3 اختصاصیت اتصال

فصل چهارم: بحث و نتیجهگیری

123

1-4 مزیت بیان سطحی بر سایر سیستمهای بیان پروتئین

124

2-4 کاربرد پیلی CS3 جهت نمایش سطحی و نقش مطالعات بیوانفورماتیکی در شناسایی مناطق مجاز ورود پپتیدهای بیگانه در آن

129

3-4 مقایسه موتیفهای طراحیشده جهت جذب یون کادمیوم توسط باکتریهای نوترکیب ساختهشده در این پروژه با مطالعات پیشین

135

4-4 پیشنهادات

136

منابع

144

پیوستها

فهرست جدولها

عنوان	صفحه
جدول 1-1. موتیفهای حفظ شده و اختصاصی متصل شونده به یونهای فلزی	8
جدول 1-2. مهمترین صنایع تولید كننده فاضلاب حاوی فلز سنگین	15
جدول 1-3. خانوادههای مهم پروتئینهای دخیل در نقل وانتقالات فلزات سنگین در باکتریها	22
جدول1 -4. ارگانلهای سطحی باکتریایی که از طریق مسیر چاپرون-آشر اسمبل میشوند	35
جدول 1-5. خلاصه ای از اپی توپها و موتیفهای ارائه شده توسط پیلیها	38
جدول 2-1. پایگاههایداده و برنامههای بیوانفورماتیکی	42
جدول 2-2.ابزارهای مقایسه توالی	43
جدول 2-3. ابزارهای آنالیز توالی اول پروتئین	43
جدول 2-4. روشهای جستجوی پروفایل و پترن	44
جدول 2-5. ابزارهای پیشگویی ساختار دوم	44
جدول 2-6. ابزارها و روش های پیشگویی ساختار سوم	45
جدول 2-7. ابزارهای آنالیز و مشاهده ملکولی	46
جدول 2-8. مشخصات پلاسمیدهای استفاده شده و یا ساخته شده در این تحقیق	56
جدول 2-9. مشخصات اولیگونوکلئوتیدهای استفاده شده در این تحقیق	57
جدول 2-10. ترکیبات استفاده شده در یک واکنش SOEing-PCR	65
جدول 2-11. واكنش برش آنزیمی پلاسمید pPR322	67
جدول 2-12. تركیبات مورد استفاده برای واكنش الحاق	68
جدول 3-1 توالی اسید آمینه ای زیرواحد اصلی و چاپرون دو سیستم CS3 و کپسول آنتیژنی F1	81
جدول 3-2. ویژگیهای ساختاری الگو-هدف که توسط روشهای محاسباتی به همراه امتیازات نمرهدهی بدست آمدهاست	87
جدول 3-3. مناطق و اسیدهایآمینه درگیر در ارتباطات ملکولی و غیرقابل دسترس ملکول CstH	94
جدول 3- 4. اثر رقابتی یونهای Ni²^+,Cu²⁺و Cr³⁺بر جذب Cd²⁺در حضور کادمیوم	121
4 -1. مقایسه میزان جذب یون کادمیم در سیستمهای نمایشسطحی مختلف و نتایج حاصل از این تحقیق	133