…………………………………………28

10-2-2- تغذیه بلدرچین …………………………………………………………………………………………..30

11-2-2- فراوری و بسته بندی گوشت و تخم بلدرچین ها ……………………………………………..32

3-2- کلیاتی در مورد بیماری های بلدرچین ………………………………………………………………….34

1-3-2- کلی باسیلوز در بلدرچین و طیور ……………………………………………………………………..35

2-3-2- اشکال دیگر کلی باسیلوز در طیور …………………………………………………………………..41

3-3-2- بیماری نیوکاسل …………………………………………………………………………………………..42

4-3-2 -آنفلوانزا ……………………………………………………………………………………………………….45

5-3-2- برونشیت بلدرچین ………………………………………………………………………………………….46

6-3-2- بیماری آسپرژیلوز ………………………………………………………………………………………….50

فصل سوم: مواد و روش کار

1-3- مواد و وسایل مورد استفاده …………………………………………………………………………………54

2-3- روش کار ………………………………………………………………………………………………………..55

1-2-3- جمع آوری و تقسیم بندی نمونه ها ……………………………………………………………………55

2-2-3- كشت نمونه ها و جدا سازی اشریشیاکلی ……………………………………………………………55

3-2-3- تأیید نمونه های اشریشیاکلی …………………………………………………………………………..56

4-2-3- ذخیره نمونه ها ………………………………………………………………………………………………56

5-2-3- آزمایش PCR …………………………………………………………………………………………….57

1-5-2-3- استخراج DNA ………………………………………………………………………………………57

2-5-2-3- آزمایش PCR جهت شناسایی ژنهای کد کننده شیگا توکسین و انتیمین ……………57

3-5-2-3- آزمایش PCR جهت تعیین گروه و تحت گروه فیلوژنی …………………………………59

4-5-2-3- شناسایی و آنالیز محصولات PCR ……………………………………………………………..61

1-4-5-2-3- مراحل انجام الکتروفورز …………………………………………………………………………61

3-3- تعیین حساسیت آنتی بیوتیكی ………………………………………………………………………………64

فصل چهارم: نتایج

1-4- تعیین درصد جدایه های اشریشیاکلی در گروه های فیلوژنی …………………………………….67

2-4- انتشار جدایه ها از مدفوع بلدرچین در تحت گروههای فیلوژنی …………………………………68

3-4- نتیجه آزمایش PCR جهت شناسایی ژن هایeae،stx1 وstx2……………………………70

4-4- انتشار فیلوژنی جدایه های اشریشیاکلی مثبت از نظرstx1،eaeوstx2……………………71

5-4- تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی جدایه ها …………………………………………………………………73

فصل پنجم : بحث و نتیجه گیری

نتیجه گیری …………………………………………………………………………………………………………….. 76

پیشنهادات …………………………………………………………………………………………………………………..

منابع …………………………………………………………………………………………………………………….83

خلاصه انگلیسی…………………………………………………………………………………………………..90

باکتری اشریشیاکلی بطور معمول در دستگاه گوارش پستانداران و پرندگان وجود دارد.سویه های بیماریزا، در شرایط استرس محیطی و تضعیف سیستم ایمنی باعث ایجاد کلی باسیلوز[1] در طیور می شوند. سویه های بیماریزا همچنین باعث ایجاد بیماریهای گوارشی و عفونت دستگاه ادراری در انسان می شوند. سویه های بیماریزای اشریشیاکلی طیور[2] (APEC) بصورت عادی جزء میكروفلور طبیعی دستگاه گوارش طیور می باشند و ممكن است در سطوح مخاطی حیوانات اهلی و وحشی نیز یافت شوند. حدود 10 تا 15 درصد از کلی فرم[3] های روده، مربوط به سروتیپ های بیماریزا[4] می باشد. می توان سروتیپ های بیماریزا را همراه با سروتیپ های غیر بیماریزا[5] از محیط اطراف طیور جدا كرد. عفونت با سویه های APEC غالباً با عفونت های خارج گوارشی به ویژه عفونت های تنفسی و یا سیستمیك همراه است.

در بلدرچین سویه های اشریشیاکلی بیماریزا غالبا متعلق به گروههای سرمی O15,O4,O9,O38,O42,O88 و برخی سروگروههای دیگر می باشند. سروگروههای مذکور از موارد سپتی سمی کلی باسیلی، سلولیت و موارد مرگ جنینی جدا شده اند (10). بلدرچین به عنوان یک میزبان برای کلی باسیلوز شناخته می شود و پرورش دهندگان آن از این بابت خسارات زیادی را متحمل می شوند.

در کشور ما بعد از انقلاب، برای اولین بار پرورش بلدرچین[6] در استان یزد آغاز گردید که به صورت مجتمع شامل واحدهای مادر، گوشتی، بسته بندی و جوجه کشی اداره می گردد. وجود ویژگی های مناسب همچون رشد سریع، بلوغ زودرس، تولید تخم بالا، کوتاهی فاصله میان نسل ها، بالابودن تراکم پرورشی در واحد سطح، حساسیت کم نسبت به بعضی از بیماری های طیور، قیمت بالای تولیدات که شامل گوشت و تخم می باشد و به خصوص بازگشت سریع سرمایه سبب شده است تا بلدرچین به عنوان یک پرنده مطلوب نزد کشاورزان و پرورش دهندگان تلقی شده و علاقمندان زیادی به پرورش صنعتی این پرنده روی آورند. بلدرچین دارای گوشتی با پروتئین بالا و درصد چربی کم می باشد که برای کودکان و بیماران بسیار سودمند و مفید می باشد.

پاتوتیپ تولید کننده شیگاتوکسین (STEC) اشریشیاکلی عامل بروز کولیت هموراژیک با منشا مواد غذائی در انسان است. امروزه سویه های STEC به عنوان گروهی از عوامل مسبب بیماریهای مشترک انسان و دام شناخته شده و خصوصا در کشورهای در حال توسعه بیماری های قابل توجهی در انسان ایجاد می کنند که شامل کولیت های هموراژیک و سندرم اورمی
می باشند. اخیرا مشخص شده که این سویه ها ممکن است در دامها و طیور سالم هم حضور داشته باشند. مهمترین عامل بیماریزایی این سویه ها، تولید شیگاتوکسین است که از مدفوع طیور و حیوانات سالم به محیط ،آب و غذا منتقل شده و باعث بیماری در انسان می گردد. سویه های STEC قادرند دو نوع شیگاتوکسینStx1وStx2را تولید نمایند. مطالعات اندکی در زمینه سویه های STECجدا شده از طیور ، انجام شده است. از طرف دیگر آنالیز فیلوژنتیکی باکتری اشریشیاکلی نشان داده است که سویه های مختلف این باکتری در 4 گروه فیلوژنتیکی شامل A ,B1 B2 , وD قرار دارند.

از آنجائیکه تاکنون مطالعه فیلوژنتیکی بر روی سویه های اشریشیاکلی STEC جدا شده از بلدرچین وجود ندارد، لذا هدف از انجام این پایان نامه جدا سازی اشریشیاکلی از مدفوع
بلدرچین های سالم و شناسائی سویه های واجد ژن های کد کننده شیگا توکسین و انتیمین
(Stx1و(eae_,Stx2و تعیین گروه فیلوژنتیکی اشریشیاکلی به روش PCR می باشد.

1-2 کلیاتی در مورد سویه های تولید کننده شیگاتوکسین((STECاشریشیاکلی

کشف پاتوتیپ اشریشیاکلی های تولید کننده شیگا توکسین (STEC) از زمانی آغاز شد که گروهی از دانشمندان گزارش کردند که مایع فیلتر شده ی کشت تعدادی از سویه های مختلف اشریشیاکلی برای سلولهای ورو[8] سایتوتوکسیک کشنده بوده و این فعالیت کشندگی سلول با آنتی سرم انتروتوکسین [9] اشریشیاکلی های شبه کلرای کلاسیک خنثی نمی شد. متعاقباً آنالیز 136 سویه اشریشیاکلی آشکار ساخت که 10 مورد از این سویه ها قادر به تولید این سیتوتوکسین سلول های ورو [10]هستند. بعد از اخذ این نتایج، اهمیت حضور سویه های اشریشیاکلی O26 تولید کننده سیتوتوکسین درارتباط با اسهال خونی مشخص شد در سال 1983 ارتباطی بین یک سروتیپ نادر از اشریشیاکلی (O157:H7) والتهاب کولون خونریزی دهنده [11] گزارش شد. در همان سال گروهی از محققین ارتباط بین حضور شیگاتوکسین تولید شده توسط اشریشیاکلی و بروز سندرم یورمی انسان را مطرح کردند. این مشاهدات باعث توجه قابل ملاحظه ای به پاتوتیپ STEC شد و از آن زمان تاکنون بیش از 200 تیپ مختلف اشریشیاکلی گزارش شده اند که شیگاتوکسین تولید می کنند و تعداد زیادی از آنها با بیماری های انسان ارتباط دارند(4)

1-1-2 وروتوكسین ها یا توكسین های شبیه شیگا

از نظر تاریخچه در سال 1977 كنوالجوك[12] ، كلمه وروتوكسین را برای سیتوتوكسین اشریشیاكلی بكار برد در یك مطالعه كه برروی 136 سویه اشریشیاكلی انجام گرفت، 7 مورد از 10 سویه ای كه وروتوكسین تولید می كردند با بیماری اسهال انسانی و یك مورد از آنها با اسهال خوكها ارتباط داشتند. در یك مطالعه مقدماتی در سال 1977 و مورد كامل آن در سال 1982، گزارش گردید كه سویه های خاصی از ETEC، سیتوتوكسینی را تولید می كنند كه برای سلولهای هلا[13] كشنده است همانند توكسین شیگا این سیتوتوكسین نیز از سنتز پروتئینی در سلول های هلا ممانعت می كند و از طرف دیگر در روده خرگوش اثرات آنتروتوكسیك داشته و برای موش نیز كشنده است، به همین دلیل این سیتوتوكسین را توكسین شبیه شیگا نام نهادند. در سال 1983 SLT خالص گردید و نشان دادند كه توكسین شیگا تولید شده بوسیله شیگلادیسانتریه و SLT تولید شده بوسیله اشریشیاكلی ازنظر خصوصیات فیزیكوشیمیایی و فعالیت های بیولوژی مشابهند (22).