1-6-2-1 مراحل آپوپتوز ………………………………………………………………..19

1-6-2-2 مسیر های آپوپتوز………………………………………………………..21

1-6-2-3- عناصر کلیدی مسیرهای آپوپتوز…………………………………21

1-6-2-4- روش های بررسی آپوپتوز …………………………………………..23

1-6-2-4-1- بررسی تغییرات غشاء پلاسمایی در مرگ سول ……………………23

1-6-2-4-1-1- تعیین فسفاتیدیل سرین سطح بیرونی غشاء سلول………………24

1-6-2-4-2- بررسی سیتوتوکسیسیتی …………………………………………24

1-6-2-4-3- بررسی تغییرات مورفولوژی ………………………………………..25

1-6-2-4-3-1- استفاده از میکروسکوپ الکترونی………………………………25

1-6-2-4-3-2- استفاده از میکروسکوپ نوری وفلورسانس……………………25

1-7- منشاء آسیب DNA اسپرم………………………………………………..26

1-7-1- بسته بندی غیرطبیعی كروماتین…………………………………..27

1-8- ساختار کروماتین اسپرم و تأثیر آن بر ناباروری ………………………..28

1-8-1- بررسی ساختار کروماتین اسپرم………………………………………28

1-9- نقش آپوپتوز در آسیب DNA اسپرم…………………………………..29

1-10- استرس اكسیداتیو به واسطه ROS……………………………………..

1-11- تاثیر عوامل محیطی برسلامت DNA و میزان موفقیت روشهای کمک باروری……..31

1-11-1- مصرف سیگار…………………………………………………………….31

1-11-2- مواجهات شغلی…………………………………………………………..32

1-11-3- داروهای شیمی درمانی و رادیوتراپی……………………………….33

1-11-4- سن……………………………………………………………………..33

1-12- تكنیك­های بررسی ساختار كروماتین……………………………………….33

1-12-1- روش­های تعیین آسیب DNA اسپرم انسان………………………….34

1-12-1-1- تست TUNEL…………………………………………………………..

1-12-1-2- روش DBD-FISH………………………………………………………….

1-12-1-3- روش Comet………………………………………………………

1-12-1-4- رنگ­آمیزی CMA3………………………………………………………..

1-12-1-5- تكنیك SCSA…………………………………………………………..

1-12-1-6- تست SCD……………………………………………………………….

1-12-1-7- رنگ­آمیزی آكریدین اورانژ…………………………………………….39

1-12-1-8- رنگ­­آمیزی تولوئیدین بلو…………………………………………….39

1-13- روش مهاجرت اسپرم…………………………………………………………39

1-14- روش سانتریفیوژ شیب غلظت…………………………………………..40

فصل دوم- مواد و روش ها…………………………………………………………41

2-1- مواد و وسایل مورد نیاز……………………………………………………….42

2-1-1- وسایل مورد نیاز………………………………………………………….42

2-1-2- مواد مورد نیاز…………………………………………………………..42

2-2- ساخت محلول های مورد نیاز…………………………………………….45

2-2-1- ساخت محلول Ham’s F10……………………………………………….

2-2-2- محلول های لازم برای تست پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)………….46

2-2-3- ساخت محلول تانل…………………………………………………………46

2-2-4- ساخت محلول (PBS)…………………………………………………….46

2-2-5- ساخت رنگ ائوزین-نیگروزین………………………………………………….47

2-2-6- ساخت رنگ رایت………………………………………………………………..47

2-3- روشها…………………………………………………………………………….48

2-3-1- روش جمع آوری اسپرم……………………………………………. 48

2-3-2- آنالیز مایع انزالی…………………………………………………………….. 48

2-3-2-1- آزمایشات ماکروسکوپی……………………………………………….48

2-3-2-1-1- ظاهر……………………………………………………………………….48

2-3-2-1-2- آبکی کردن………………………………………………………………..48

2-3-2-1-3- حجم…………………………………………………………………..48

2-3-2-1-4- چسبندگی………………………………………………………….48

2-3-2-2- آزمایشات میکروسکوپی……………………………………………………49

2-3-2-2-1- آگلوتیناسیون………………………………………………………….50

2-3-2-2-2- بررسی تعداد اسپرم………………………………………………………50

2-3-2-2-2-1- روش استفاده از MAKLER CHAMBER برای شمارش …………50

2-3-2-2-3- ارزیابی تحرک……………………………………………………….51

2-3-2-2-3-1- روش کار……………………………………………………………52

2-3-2-2-4- ارزیابی قابلیت حیات………………………………………………….53

2-3-2-2-4-1- روش کار رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین………………………….53

2-3-2-2-5- ارزیابی مورفولوژی…………………………………………………54

2-3-2-2-5-1- رنگ آمیزی پاپانیکولا………………………………………….54

2-3-2-2-5-2- روش فیکس کردن………………………………………………54

2-3-2-2-5-3-روش رنگ آمیزی پاپانیکولا…………………………………….55

2-3-3- Direct swim-up……………………………………………………….

2-3-3-1- روش کار………………………………………………………………….57

2-3-4- تست بررسی میزان پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)…………….58

2-3-4-1- روش کار………………………………………………………………..58

2-3-5- روش رنگ آمیزی تانل……………………………………………………60

2-3-6- آنالیز آماری……………………………………………………………….62

فصل سوم- نتایج……………………………………………………………….63

3-1 نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی تحرک اسپرم…………..64

3-2- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قابلیت حیات اسپرم….67

3-3- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی مورفولوژی اسپرم..68

3-4- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم…70

3-5- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم………..72

3-6- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی آپوپتوز اسپرم….75

3-7- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم………..78

3-8- رابطه میزان آپوپتوز اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم………………………..79

3-9- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با میزان آپوپتوز اسپرم……………80

3-10- نتایج کلی……………………………………………………………………………80

فصل چهارم- بحث………………………………………………………………………….81

4-1- تا ثیر روش آماده سازی Dricct Swim up بر روی پارامترهای اسپرم……………83

4-2- تاثیر زمان های مختلف انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد بر روی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم……84

4-3- پیشنهادات…………………………………………………………………………..90

فصل اول: مقدمه

1-1- روش های کمک باروری

امروزه استفاده از روش های كمك باروری ([1]ART) بهترین گزینه برای رفع مشكلات زوج های نابارور است. میزان موفقیت این روش ها به عوامل متعددی از جمله سلامت كامل تخمك و اسپرم بستگی دارد. در این میان سلامت ژنوم پدری اهمیت زیادی در میزان پتانسیل باروری زوج ها دارد. بنابراین آسیب DNA اسپرم یك اختلال ژنومی است كه به میزان متفاوت در مردان نابارور وجود دارد. از زمانی كه اولین گزارش در مورد آسیب DNA اسپرم منتشر شد مطالعات وسیعی در این زمینه انجام گرفته و مشخص شده كه در افراد دارای میزان بالای آسیب DNA، پارامترهای اسپرمی پایین می آید و قدرت باروری نیزكاهش می یابد.

از سالها پیش، استفاده از جراحی برای رفع نقایص ساختمان دستگاه تولید مثل، استفاده از داروهای باروری برای تحریك تخمك­گذاری و روش IUI[2] (انتقال اسپرم متحرك و شسته شده به رحم) از جمله روش­های رایج درمانی بوده و هستند. لیكن این اقدامات تنها برای گروهی از زوج­های نابارور مؤثر است. این در حالی است كه روش­های جدیدی از جمله IVF [3] و ICSI [4] امروزه به عنوان گزینه­هایی مناسب در درمان سایر زوجین نابارور مطرح است.

میزان موفقیتART به سلامت و بلوغ گامت های زوجین وابسته است . طی لقاح طبیعی و روش لقاح آزمایشگاهیIVF احتمال نفوذ اسپرماتوزوای غیربالغ و ناسالم به داخل تخمك توسط سد زوناپلوسیدا به حداقل می رسد در صورتی كه در روش میكرواینجكشن یا تزریق مستقیم اسپرم به داخل سیتوپلاسم تخمك ICSI این سد وجود نداشته و ایمن بودن روش ICSI همیشه مورد نگرانی بوده است . در ضمن تحقیقات نشان داده است كه انتخاب اسپرم با پارامترهای معمولی (غلظت، مورفولوژی، تحرك ) نمی تواند گویای سلامت DNA اسپرم باشد(EI, MI, López-Fernández, Fernández, & Gosálvez, 2007). به تازگی لوئیس و سیمون (2010) اظهار داشتند که هیچ همبستگی بین پارامتر های معمولی اسپرم و آسیب DNA وجود ندارد(S. E. M. Lewis & Simon, 2010).

یکی از روش های کمک باروری روش تلقیح داخل رحمی (IUI) می باشد. که در این روش مایع انزالی از شوهر گرفته می شود و پس از عمل شستشو و جداسازی ، اسپرم های مرده و بدون تحرک از اسپرم های زنده و دارای تحرک جدا می شوند، سپس اسپرم های زنده و متحرک به وسیله کاتتر توسط متخصص، وارد حفره رحم می گردد.

در آزمایشگاه های ART، بعد از عمل شستشو و جداسازی معمولاَ به بررسی پارامترهای اسپرم که شامل تعداد، میزان تحرک و وضیعت مورفولوژیکی اسپرم و درصد زنده بودن می باشد، می پردازند اما به بررسی پارامترهای درون سلولی که شامل آپوپتوز و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم است پرداخته نمی شود. همچنین در آزمایشگاه های ART معمولاَ انجام روش IUI از 5/0 تا حداکثر 3 ساعت بعد از عمل جداسازی و شستشو اسپرم انجام می دهند و در بعضی از مراکز درمان ناباروری بدون توجه به زمان، عمل تلقیح را انجام می دهند. با توجه به نقش اسپرم در پروسه لقاح در روش IUI، لازم است که علاوه بر توجه به ساختار سلولی اسپرم به بهترین زمان ممکن جهت انجام تزریق اسپرم آماده شده به داخل حفره رحمی توجه شود. لذا با مطالعه ساختار سلولی اسپرم و نیز تعیین زمان دقیق عمل تزریق اسپرم به داخل حفره رحمی می توان میزان لقاح و در نتیجه میزان حاملگی را افزایش داد.

یکی از عواملی که می تواند بر میزان موفقیت درمان زوج های نابارور و همچنین کیفیت گامت ها مهم باشد، کیفیت اسپرم است. در روش IUI بعد از جداسازی اسپرم از مایع منی و آماده سازی اسپرم برای انتقال، می تواند به خاطر انکوباسیون طولانی مدت، قطعه قطعه شدن DNA اسپرم افزایش پیدا کند(Muratori, et al., 2003).

مطالعات بیانگر این مطلب است كه در تخمك های لقاح یافته با اسپرم های دارای آسیب بالای DNA، میزان لانه گزینی و بارداری به طور معنی داری كاهش می یابد . اگرچه ژنوم آسیب دیده پدری، طی رشد جنینی می تواند دستخوش پردازش قرار گیرد، ولی در صورت وجود آسیب های زیاد، احتمال كاهش رشد جنین وجود داشته و اگر میزان نقص ها كمتر باشد، می تواند نقایص بعد از تولد را به همراه داشته باشد. به همین دلیل، در دسته ای از بیماران، نوزادان متولد شده توسط روش ICSI دارای نقص ژنتیكی بیشتری نسبت به نوزادان طبیعی هستند .لازم به ذكر است كه تحقیقات متعدد در این زمینه، نتایج ضد و نقیصی را گزارش كرده اند(Morris, Ilott, Dixon, & Brison, 2002).

تجربیات به دست آمده از روش های كمك باروری نشان می دهد، چنانچه اسپرم با میزان بالایی از آسیب DNA، در روند IVF و ICSI وارد تخمك شود سیستم ترمیمی تخمك ممكن است توانایی ترمیم این آسیب ها را نداشته و در بسیاری از موارد با وجود موفقیت در لقاح، سلول های جنسی توانایی تشكیل جنین یا ادامه تكامل را تا مرحله بعد از 4 تا 8 سلولی كه مصادف با فعال شدن ژنوم است، ندارند . براساس تحقیقات مشخص شده كه توانایی ترمیم تخمك وابسته به سن مادر بوده و تخمك های افراد جوان، از قدرت ترمیم DNA بالایی برخوردارند . به علاوه تحقیقات متعدد در زمینه آسیب DNA بیانگر این هستند كه ارتباط معنی داری بین آسیب DNA و میزان لقاح وجود ندارد ولی بین آسیب DNA اسپرم و تشكیل جنین، بلاستوسیت، رشد جنین و بارداری ارتباط معكوس و معنی داری وجود دارد(Morris, et al., 2002).

پس از آماده سازی اسپرم به طور معمول در 37 درجه سانتی گراد انکوبه می شود تا در ART از آن استفاده شود (Van der Westerlaken, Naaktgeboren, Verburg, Dieben, & Helmerhorst, 2006) ، ولی هنوز زمان بهینه برای انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد قبل از استفاده در ART وجود ندارد. بعضی از محققین سعی برای پیدا کردن اثر گذشت زمان بر پارامترهای اسپرم بعد از انکوبه کردن در دمای 37 درجه سانتی گراد را دارند. اثر انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد نشان داد که بعد از گذشت 24 ساعت می تواند بر روی تحرک و قابلیت حیات اسپرم تاثیر گذار باشد(Calamera, Fernandez, Buffone, Acosta, & Doncel, 2001).

بعد از آماده سازی اسپرم برای استفاده در تکنیک های ART انکوباسیون کوتاه مدت در دمای 37 درجه سانتی گراد می تواند باعث ظرفیت یابی اسپرم شود اما انکوباسیون طولانی مدت می تواند بر روی DNA اسپرم تاثیر داشته باشد(Marı́n-Briggiler, Tezón, Miranda, & Vazquez-Levin, 2002).

مساحت آن­ها شاهد انقراض گونه­های گیاهی و جانوری و در نتیجه کاهش تنوع زیستی در دنیا هستیم. هریک از گونه­ها آن­چنان در اکوسیستم­های جنگلی نقش حیاتی و اساسی را در زنجیره­های غذایی بازی می­کنند که نابودی یک گونه، تعادل حیات را در طبیعت برهم می­زند. برنامه­های زیست محیطی برای هر منطقه بدون شناخت وضعیت پوشش گیاهی آن منطقه و تنوع گونه­ای آن ممکن نیست [3].

شناسایی پوشش گیاهی و بررسی فرم زیستی و جغرافیای گیاهی منطقه، ضمن اینکه اساس بررسی­ها و تحقیقات بوم­شناختی در منطقه بوده و راهکاری مناسب برای تعیین ظرفیت بوم­شناختی منطقه از جنبه­های مختلف است، در عین حال، عامل مؤثری در سنجش و ارزیابی وضعیت کنونی و پیش­بینی وضعیت آینده­ی منطقه به شمار می­رود که برای اعمال مدیریت صحیح، نقش بسزایی دارد [13].

تنوع زیستی جنگل منبع بسیار مهم و با ارزشی است، زیرا گونه­های موجود در جنگل و ذخایر ژنتیکی تشکیل­دهنده­ی آن برای سلامتی و تأمین نیازهای بشر و سایر موجودات، حائز اهمیت بوده و قطعاً فقدان تنوع زیستی تهدید خطرناکی برای بقای انسان و سایر موجودات محسوب می­شود [14].

تنوع زیستی در جنگل­های شمال ایران بالا است. در بین کشورهای هم­عرض ایران، جنگل­های شمال ایران و شمال ترکیه که از عصر یخبندان به سلامت گذشته­اند، دارای بهترین تنوع می­باشند. پس از پایان عصر یخبندان، پیشروی جنگل به سمت اروپا از جنگل­های شمال ایران و ترکیه آغاز شد و همین قدمت بیشتر سبب شده است که تنوع ژنتیکی گونه ­های چوبی شمال ایران بیشتر از اروپا باشد [15].

فصل اول: مروری بر منابع علمی

1-1- تعریف جامعه­ شناسی گیاهی و مروری بر تحقیقات جامعه­ شناسی در جهان

جامعه­شناسی گیاهی معروف به فیتوسوسیولوژی[1] شاخه­ای از علم اکولوژی است که اجتماعات گیاهی را از نظر ترکیب گونه­ای[2]، اکولوژی، پراکنش جغرافیایی[3] و دینامیک مورد مطالعه قرار می­دهد [16]. جامعه­ی گیاهی[4] که برای اولین بار در ابتدای قرن نوزدهم توسط همبولت[5] تشریح شد [17]، اشاره به گونه­های معینی می­نماید که باهم در محل­های معین رشد کرده و وقوع آنها باهم چیزی بیش از شانس و تصادف است [18]. کلمنتز[6] در سال 1916 با توسعه­ی نظریه­ی ارگانیسمی[7]، هر جامعه­ی گیاهی را به مثابه یک واحد زیستی (موجود زنده) معرفی کرده است که هر قسمتی از آن عضو یک پیکر بوده و با سایر قسمت­ها در ارتباط می­باشد. هر جامعه­ی گیاهی به عنوان واحدی منسجم با سیمای ظاهری[8] یکنواخت و ترکیب گونه­ای نسبتاً ثابت هر رویشگاه بوده [19]، مطالعه­ی آن می­تواند مبنای مناسبی برای مدیریت، احیاء[9] و توسعه­ی آن رویشگاه باشد. به دلیل تغییرات شدید در نوع پوشش­گیاهی، شرایط اقلیمی و چگونگی تأثیر انسان در پوشش گیاهی مناطق مختلف، مکاتب و روش­های مختلفی در دانش جامعه­شناسی گیاهی مرسوم گردید [20]. از میان مکاتب موجود، مکتب زوریخ-مونپلیه که توسط براون-بلانکه در سال 1928 پیشنهاد شده است [21]، از اهمیت خاصی برخوردار می­باشد [17]. ویژگی بارز این مکتب، انعطاف کافی آن جهت بررسی پوشش گیاهی از دیدگاه­های مختلف بوده و علاوه بر این با قرار دادن جامعه[10] به­عنوان واحد پایه، یک سلسله­ی رده­بندی را ارائه می­کند که دیگر واحدهای آن، اتحادیه[11]، رده[12] و طبقه[13] می­باشد [22].

مطالعه­ی فیتوسوسیولوژی به روش براون-بلانکه توسط محققینی چون پور[14] [23]، پاولوسکی[15] [24]، بکینگ[16] [25]، شیمول[17] [26]، مولر-دومبویس[18] و النبرگ[19] [27]، واندرمارل[20] [28] تشریح شده و روش­های اجرایی آن مورد بررسی قرار گرفت [17].

2-1- مروری بر بررسی­های فلوریستیکی و جامعه­ شناسی پوشش ­گیاهی در جنگل­های هیرکانی

بررسی­های جامعه شناسی گیاهی در ایران به صورت كلی با مطالعات زوهری [29] آغاز شده است. جزیره ای [30] عناصر فیتوژئوگرافیكی جنگل­های خزری را تشریح نموده است. تره گوبو [31]، مصدق [32] و درستكار [33] جامعه های گیاهی جنگل­های شمال ایران را بررسی نموده اند. ثابتی [34]، جامعه های گیاهی متعددی برای مناطق مختلف ایران ذكر كرده است. راستین [35] جامعه های جنگلی پست حوزه­ی هیركانی و اسداللهی [36] جامعه های گیاهی راشستان­های اسالم را مورد مطالعه قرار داده اند و البرز مركزی توسط کلن [37] مطالعه شده است.

حجازی و ثابتی[1] در سال 1961 چندین جامعه­ی جنگلی از شمال ایران معرفی نمودند [38]. جزیره­ای[2] در سال­های 1964 و 1965 عناصر فیتوژئوگرافی جنگل­های هیرکانی را تشریح و جوامعی از این جنگل­ها را مورد مطالعه قرار داد [30، 39]. ثابتی در سال 1344 جوامع مختلف گیاهی جنگل­های شمال ایران را مطالعه کرده ­است[40]. خاوری­نژاد در سال 1345 در پایان­نامه­ی کارشناسی­ارشد خود جوامع­گیاهی جنگل­های جنوب شرق چالوس را مورد مطالعه قرار داد[41]. ترگوبو[3] در سال 1967 جوامع گیاهی منطقه­ی هیرکانی را معرفی کرد [31]. ترگوبو و مبین[4] در سال 1970 نقشه­ی پوشش گیاهی ایران را با مقیاس 1:2500000 تهیه کردند [42]. زوهری[5] در سال­های 1963 و 1973 پوشش گیاهی ایران، به ویژه جنگل­های هیرکانی را از جنبه­های جغرافیایی و جامعه­شناسی گیاهی بررسی کرده است [6، 29]. درستکار[6] در سال 1974 در تز دکترای خود [43] و درستکار و نویرفالیس[7] در سال 1976 [33] جنگل­های شرق دریای خزر را مورد مطالعه قرار داده­اند. ثابتی در سال 1355 درختان و درختچه­های ایران را بررسی کرده است [34]. اسداللهی[8] در سال 1980 در رساله­ی دکترای خود، جوامع­گیاهی راشستان­های حوزه­ی اسالم [44] و در سال 1366 جغرافیای گیاهی و جوامع­گیاهی جنگل­های شمال غربی هیرکانی را در سمینار جنگل و جنگل­داری گرگان ارائه نموده است [36]. در سال 1982 اسداللهی و همکاران، اکوسیستم­های جنگلی ایران را از دیدگاه جامعه­شناسی مورد مطالعه قرار داده­اند [45]. مصدق[9] در سال 1981 جوامع­گیاهی جنگل­های شمال ایران را بررسی کرده است [46]. راستین[10] در سال­های 1980 و 1983 جوامع جنگلی پست منطقه­ی هیرکانی را مورد مطالعه قرار داده است [35، 47]. فرای[11] و همکاران در سال 1985 نقشه­ی پوشش گیاهی بخش مرکزی کوه­های البرز را با مقیاس 1:500000 تهیه کردند [48]. فرای و پرابست[12] در سال 1986 طرح طبقه­بندی پوشش گیاهی ایران بر اساس معیارهای فیزیونومی-اکولوژی را ارائه کردند [4]. اسدی در سال 1364 در پایان­نامه­ی کارشناسی­ارشد خود، جوامع گیاهی سری پاتم خیرود­کنار را بررسی نموده است [49]. طبری در سال 1371 در پایان­نامه­ی کارشناسی­ارشد خود، شرایط زیست و مختصات جنگل­شناسی و جوامع­گیاهی درخت زبان­گنجشک را در جنگل­های شمال تشریح نموده است [50]. حمزۀ در سال 1373، جوامع گیاهی و عناصر تشکیل­دهنده­ی جنگل­های لساکوتی در جنوب شرقی تنکابن را مورد بررسی قرار داده است [51]. سعیدی­مهرورز در سال 1373 در پایان­نامه­ی کارشناسی­ارشد خود، فلور و پوشش­گیاهی مناطق ایسپیلی-دیلمان و نواحی اطراف آن را بررسی نموده است [52]. یزدیان در سال 1374 در پایان­نامه­ی کارشناسی­ارشد خود، مهم­ترین شرایط اکولوژیکی و تیپ­های رویشی درخت آزاد را در جنگل­های شمال بررسی کرده است [53]. حسینی در سال 1375 در پایان­نامه­ی کارشناسی­ارشد خود، با عنوان تهیه­ی نقشه­ی فیزیونومیك – فلورستیك پوشش­گیاهی بخش نم خانه­ی جنگل خیرودكنار، جوامع جنگلی این بخش را با معرفی گونه­های معرف هر جامعه، مشخص نموده است [54]. آخانی[13] در سال 1998، تنوع زیستی پارک ملی گلستان [55] و آخانی و زیگلر[14] در سال 2002 پوشش گیاهی صخره­ای و جوامع علفی پارک ملی گلستان را بررسی کردند [56]. کلن[15] در سال 1982 [57] و 1984 [58] و در سال 1991 [37] در تز دکترای خود جوامع گیاهی البرز مرکزی را مورد مطالعه قرار داده است. نظریان[16] و همکاران در سال 2004 به معرفی جوامع جنگلی بخشی از شمال ایران پرداختند [59]. قهرمان[17] و همکاران در سال 2006 به بررسی فلوریستیک جنگل­های توسکای قشلاقی در مناطق پست خزری پرداخته­اند[60]. دانشور[18] و همکاران در سال 2007 تنوع ساختاری در راشستان آمیخته (مطالعه موردی جنگل شصت­کلاته، گرگان) را مورد بررسی قرار دادند [61]. حمزۀ[19] و همکاران در سال 2008 به بررسی جوامع توسکای قشلاقی در شمال ایران پرداخته­اند [8]. جعفری و آخانی[20] در سال 2008 گیاهان منطقه حفاظت شده جهان­نما در استان گلستان را مورد مطالعه قرار دادند [62]. نقی­نژاد[21] و همکاران در سال 2008 ارتباط محیط و پوشش­گیاهی را در اجتماعات توسکای قشلاقی مناطق پست جنگل­های شمال بررسی نمودند [7]. رمضانی[22] و همکاران در سال 2008، تاریخچه­ی پوشش گیاهی جنگل­های هیرکانی مرکزی را مورد بررسی قرار داده­اند [63]. سیادتی و مرادی در سال 1389 [64، 3] در پایان­نامه­ی کارشناسی ارشد خود و همچنین سیادتی[23] و همکاران در سال 2010 [9]، تغییرات فلوریستیکی را در طول شیب ارتفاعی در منطقه جنگلی خیرود بررسی کردند.

[1] Sabeti & Hejazi

[2] Djazirei

[3] Tregubov

[4] Tregubov & Mobayen

[5] Zohary

[6] Dorostkar

[7] Dorostkar & Noirfalise

[8] Assadollahi

[9] Mossadegh

[10] Rastin

[11] Frey

[12] Frey & Probst

[13] Akhani

[14] Akhani & Ziegler

[15] Klein

[16] Nazarian

[17] Ghahreman

[18] Daneshvar

[19] Hamzehꞌee

[20] Jafari & Akhani

[21] Naqinezhad

[22] Ramezani

[23] Siadati

Phytosociology

Floristic

Chorology

Plant association

Homboldt

Clements

Organismic Concept

………………………………………………….. 11

1-14 اندامگان بی هوازی ……………………………………………………………………………………… 11

1-15 متابولیسم بی هوازی …………………………………………………………………………………….. 12

1-16 بیوسورفکتانت …………………………………………………………………………………………….. 13

1-17 تعریف بیوسورفکتانت ها …………………………………………………………………………….. 13

1-18 بیوسورفکتانت ها از نظر وزن مولکولی …………………………………………………………. 13

1-18-1 بیوسورفکتانت های با وزن مولکولی پایین …………………………………………………. 13

1-18-2 بیوسورفکتانت های با وزن مولکولی بالا ……………………………………………………. 14

1-19 تولید بیوسورفکتانت ها ………………………………………………………………………………… 14

1-20 اثر فاکتورهای مختلف بر تولید بیوسورفکتانت ………………………………………………..14

1-20-1 اثر منبع کربن بر تولید بیوسورفکتانت …………………………………………………………15

1-20-2 اثر منبع نیتروژن بر تولید بیوسورفکتانت …………………………………………………….. 15

1-20-3 اثر فاکتورهای محیطی بر تولید بیوسورفکتانت ……………………………………………. 15

1-21 تقسیم بندی بیوسورفکتانت ها ……………………………………………………………………… 16

1-22 انواع بیوسورفکتانت ……………………………………………………………………………………… 16

1-23 مزیت های استفاده از بیوسورفکتانت ………………………………………………………………. 17

1-24 مزیت بیوسورفکتانت ها به سورفکتانت های شیمیایی ………………………………………. 18

1-25 کاربردهای بیوسورفکتانت ها …………………………………………………………………………. 19

1-25-1 کاربردهای بیوسورفکتانت ها در صنعت نفت ………………………………………………. 19

1-25-2 کاربردهای بیوسورفکتانت ها در صنایع غذایی ……………………………………………. 20

1-26 نقش های طبیعی و فیزیولوژیکی بیوسورفکتانت ها ………………………………………….. 20

1-27 افزایش سطح تماس ناحیه هیدروفوبی سوبستراها …………………………………………….. 20

1-28 هالوفیل ها …………………………………………………………………………………………………….. 20

1-29 اهداف تحقیق ………………………………………………………………………………………………. 21

1-30 سوالات تحقیق …………………………………………………………………………………………….. 22

1-31 فرضیه های تحقیق ………………………………………………………………………………………… 22

فصل دوم: پیشینه پژوهش

2-1 بیوتکنولوژی و اهمیت بیوتکنولوژی نفت ………………………………………………………… 24

2-2 بیوتکنولوژی در خدمت صنعت و نفت …………………………………………………………….. 24

2-3 استخراج نفت ………………………………………………………………………………………………… 26

2-4 حفر چاه ………………………………………………………………………………………………………… 27

2-5 روش های استخراج نفت ……………………………………………………………………………….. 27

2-6 مزایای بیوسورفکتانت ها در استخراج نفت ثالثیه ……………………………………………… 31

2-7 پیشینه تحقیق …………………………………………………………………………………………………. 32

فصل سوم

روش کار

3-1 دستگاههای مورد استفاده ……………………………………………………………………………….. 39

3-2 وسایل مورد نیاز …………………………………………………………………………………………….. 39

3-3 مواد مورد استفاده ………………………………………………………………………………………….. 40

3-4 مراحل انجام آزمایش …………………………………………………………………………………….. 40

3-4-1 نمونه برداری …………………………………………………………………………………………….. 41

3-4-2 غربالگری و غنی سازی بی هوازی باکتری های نفتی …………………………………… 41

3-4-3روش تهیه لام …………………………………………………………………………………………….. 43

3-4-4 رنگ آمیزی گرم ………………………………………………………………………………………. 43

3-4-5 رنگ آمیزی منفی ……………………………………………………………………………………… 44

3-4-6 شناسایی و تخلیص ……………………………………………………………………………………. 44

3-4-7 تست احیای نیترات ………………………………………………………………………………….. 46

3-4-8 تست CHNS……………………………………………………………………………………………

3-4-9 آزمایش های وجود بیوسورفکتانت در نمونه های آزمایش شده ……………………. 48

فصل چهارم: نتایج

4-1 مشاهده میکروسکوپی ………………………………………………………………………………………. 54

4-2 نتایج مرحله شناسایی و تخلیص ……………………………………………………………………….. 54

4-3 نتایج تست احیای نیترات …………………………………………………………………………………. 54

4-4 نتایج تست CHNS ……………………………………………………………………………………….. 55

4-5 نتایج آزمایش های وجود بیوسورفکتانت در نمونه های آزمایش شده …………………….57

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1 مقدمه ……………………………………………………………………………………………………………. 59

5-2 بحث ……………………………………………………………………………………………………………. 61

5-3 نتیجه گیری …………………………………………………………………………………………………… 63

5-4 پیشنهادات ……………………………………………………………………………………………………… 64

پیوست الف ………………………………………………………………………………………………………….. 65

منابع فارسی …………………………………………………………………………………………………………… 66

منابع لاتین …………………………………………………………………………………………………………….. 66

چکیده:

 

مبحث حضور باكتریها در اعماق زمین در اوایل قرن 21 مطرح شد. یكی از اولین تحقیقاتی كه در مورد میكروبیولوژی اعماق زمین انجام شد منتج به جداسازی باكتریهای احیا كنندة سولفات از چاه نفت شد. باکتری های احیا کننده سولفات، اصلی ترین باکتریهایی هستند که باعث ترش و اسیدی شدن نفت شده و در نتیجه افت کیفیت نفت خام را به بار خواهند آورد. رقابت بین SRB ها و باکتریهای بیهوازی احیا کننده نیترات برای کسب سوبسترای هیدروکربنی امروزه به عنوان یکی از راه­حلهای بالقوه بیوتکنولوژیک در جهت ارتقا کیفیت API نفت خام مطرح می­شود. لذا تحقیق در مورد یافتن NRBهای بومی نفت خام هر منطقه جغرافیایی تبدیل به یکی از موضوعات مورد توجه دانشمندان صنعت نفت در دهه اخیر شده است. از مهمترین ویژگیهای یک باکتری مفید در بیوتکنولوژی نفت توانایی تحمل شرایط فیزیکو شیمیایی دشوار مخزنی و تولید بیو سورفکتانت جهت افزایش دسترسی میکروبی می­باشد. لذا در این تحقیق باکتریهای بی­هوازی هالوفیل، احیاکننده نیترات و مولد بیوسورفکتانت بومی نفت خام ایران بررسی شدند. نمونه نفتهایی از برخی مخازن ایران با هدف بررسی حضور باکتریهای احیاکننده نیترات بومی مورد مطالعه قرار گرفت. تمامی کشتها به روش Hungate در ویالهای crimped seal شده و تنظیم اتمسفر بی هوازی، تحت شرایط کاملا بی هوازی در دمای 40درجه سانتیگرادصورت گرفت. در تمامی مراحل هالوفیل بودن باکتریهای جدا شده با افزودن NaCl به محیطهای کشت لحاظ شد. از محیط نوترینت براث و BSM فاقد منبع گوگرد که حاوی نفت خام استریل به عنوان تنها منبع کربن و انرژی بود، به منظور حذف SRB رقیب و غنی سازی اولیه استفاده شد. در مرحله بعد، نیترات براث برای جداسازی و خالص سازی باکتریهای هدف مورد استفاده قرار گرفت، سپس در محیط MSM تجدید کشت شد. جهت بررسی توانایی NRB های بومی جداشده در تولید بیوسورفکتانت از محیط کشت Blood Agar ، BHI و تکنیک پخش شدن نفت بکار برده شد. در نهایت برای حصول اطمینان از اینکه باکتریهای بی هوازی جدا شده از نفت خام قطعا از ازت نفت خام برای تامین نیاز خود استفاده میکنند، تست احیای نیترات و تست NCH که جهت بررسی کاهش ازت بود، انجام گرفت.نتایج حاصل نشان داد که نفت خام ایران دارای NRB های به شدت بی هوازی هستند که علاوه بر احیا نیترات و رقابت با SRBها، می­توانند از آن به عنوان تنها منبع کربن استفاده نمایند. این باکتریها با توانایی تحمل شوری، دما و نیز تولید بیو سورفکتانت میتوانند از کاربردی ترین باکتریها در صنعت نفت در فرایندهایی مثل ارتقائ کیفیت نفت به روش بیولوژیک، کاهش آلودگیهای محیطی و یا ازدیاد برداشت میکروبی نفت (MEOR) در شرایط بیهوازی باشند، که پیشنهاد می شود کاربرد آنها در کاهش ترشی و اسیدیته نفت خام نیز بررسی شود.

فصل اول: کلیات

1-1- مقدمه

نفت که در زبان انگلیسی Petroleum نامیده میشود، از دو کلمهPetra و Oleumکه در زبان یونانی به معنی سنگ روغن و یک نوع روغن میباشد، تشکیل شده است که در زبان فارسی معادل مناسبی ندارد. نفت و سایر مواد سوختنی هیدروکربنی به صورتی که ما امروزه آن را میشناسیم، در مخازنی در اعماق زمین وجود دارند. نفت به عنوان یک منبع انرژی در جهان محسوب می شود و با وجود منابع انرژی دیگر هنوز هم منبع انرژی غالب و در دسترس و قابل اطمینان جایگزین آن نشده است(9).

پترولیوم می تواند به صورت فازهای مختلف، از جمله فاز گازی نظیر گاز طبیعی (Natural Gas )، فاز مایع نظیر نفت خام ( Crude Oil ) و فاز جامد مثل قیر ( Asphaltene ) در خلل و فرج و شکستگی های سنگ تجمع می یابد. مهمترین منبعهیدروکربنها، نفت خام است. نفت خام شامل مقدار کمی ترکیبات آلی اکسیژن دار، نیتروژن دار و گوگردی و نیز فلزاتی است که به طور شیمیایی به مولکول های آلی متصلند. انباشته شدن مواد هیدروکربنی در زیر سطح زمین در سنگ هایی صورت می گیرد که توانایی نگه داری و انتقال سیالات را داشته باشند. معمولا نفت خام زیر پوششی از سنگ های غیر قابل نفوذ در محفظه های سنگ های متخلخل به نام مخازن یا (rReservoi) که منحصرا در حوضچه های رسوبی قرار دارند، محبوس است (10).

تجمع مواد هیدروکربنی به صورت اقتصادی در سنگ مخزن منوط به وجود عوامل متعددی است. به طور کلی وجود پنج عامل برای تجمع اقتصادی نفت و گاز لازم و ضروری است، این پنج عامل عبارتند از :

1-سنگ منشأ بالغ (Mature Source Rock) که تولید هیدروکربن کرده باشد.

2-سنگ مخزن ( Resevoir Rock) که بتواند هیدروکربن را در داخل خود جای دهد.

3-مهاجرت هیدروکربن بین سنگ منشأ و سنگ مخزن ( Migration Pathway) عملی باشد.

2-4- انجام تست Nesslerization به منظور بررسی مقدار آمونیاک آزاد شده ……… 36

2-4-1- کشت کلنی ها ……………………………………………………………………. 36

2-4-2- تعیین غلظت آمونیاک آزاد شده در محلول واکنش توسط ال-آسپاراژیناز کلنی ها….. 37

2-4-3- محلول های لازم برای سنجش میزان فعالیت آنزیم ال-آسپاراژیناز کلنی ها…. 38

2-5- استخراج DNA………………………………………………………………………….

2-5-1- کشت باکتری به منظور استخراج DNA…………………………………………..

2-5-2- استخراج DNA ژنومی ………………………………………………………………. 41

2-6- واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR) ………………………………………………….. 42

2-7- الکتروفورز بر روی ژل آگارز ……………………………………………………… 43

2-8- خالص سازی محصول PCR …………………………………………………………

2-9- استخراج پلاسمید ……………………………………………………………………. 46

2-10- هضم آنزیمی و کلون کردن قطعه در داخل وکتور ……………………………. 47

2-10-1- الگوی برش آنزیمی ژن ال-آسپاراژیناز ll ……………………………………………

2-10-2- برش و آماده سازی وکتور pET23a(+) ……………………………………….

2-10-3- واکنش الحاق وکتور pET23a(+) با قطعه ژنی ال-آسپاراژینازll ………….

2-11-ایجاد سلول های Competant و انتقال پلاسمید …………………………….. 49

2-12-انتخاب کلون های مثبت …………………………………………………….. 50

2-13- تأیید کلنی های نوترکیب با PCR و هضم آنزیمی ……………………………. 51

2-13-1-PCR ……………………………………………………………………………

2-13-2- هضم آنزیمی ……………………………………………………………… 52

2-14- بیان و استخراج پروتئین بیان شونده توسط ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز ll …….

2-14-1- القاء بیان پروتئین آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll………………………………….

2-14-2- استخراج پروتئین های آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll و ال-آسپاراژیناز l ………..

2-15- بررسی اولیه بیان پروتئین نوترکیب ال-آسپاراژیناز ll و پروتئین ال-آسپاراژیناز l با SDS-PAGE……….

2-16- تعیین فعالیت آنزیمی یا فعالیت کلّی( IU ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز ……….. 58

2-17- تعیین پروتئین کلّی ( mg ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز ……………………………. 59

2-18- تعیین فعالیت ویژه( IU/mg ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز ………………………… 62

2-19- کشت سلول انسانی …………………………………………………………….. 62

2-19-1- تهیه محیط كشت RPMI1640 ……………………………………………..

2-20- تاثیر آنزیم ال-آسپاراژیناز ll (نوترکیب)،ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول های سرطانی انسانی…… 63

2-20-1- MTT Assay ………………………………………………………………

2-21- تست تغییرات سیتوپلاسمی سلول های سرطانی بعد از انجام تست MTT ………

فصل سوم نتایج ………………………………………………………… 67

3-1- بررسی و شماره گذاری کلنی ها …………………………………….. 68

3-2- نتایج اعداد جذب محلول های استاندارد سولفات آمونیوم در طول موج nm490……

3-3- بررسی اعداد جذب آمونیاک آزاد شده در محلول های به دست آمده از کلنی های جهش یافته…………. 70

3-4- جداسازی و تکثیر ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز ll ……………………………………

3-5- تعیین توالی قطعه ژنیl-aspsraginase ll…………………………………..

3-6- وارد کردن قطعه ژنیl-asparaginase ll در وکتور pET23a و تأیید آن …. 76

3-7- نتیجه SDS-PAGE نمونه های آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll , l و استاندارد ……. 79

3-8- محاسبۀ فعالیت آنزیمی(IU) ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و ال-آسپاراژیناز استاندارد.. 80

3-9- تعیین پروتئین کلّی (mg) آنزیم های ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و ال-آسپاراژیناز استاندارد……. 82

3-10- تعیین فعالیت ویژه( IU/mg ) آنزیم های ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و ال-آسپاراژیناز استاندارد…… 84

3-11- بررسی تأثیر آنزیم ال-آسپاراژینازll (نوترکیب)، ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول های سرطانی HeLa …………….

3-12- بررسی تأثیر آنزیم ال-آسپاراژینازll (نوترکیب)، ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول های سرطانی LCL…………….

3-13- بررسی تغییرات سیتوپلاسمی سلول های سرطانی بعد از انجام تست MTT ………..

فصل چهارم بحث و پیشنهادات ……………………………………………….. 98

منابع …………………………………………………………………………………….. 108

چکیده:

ال- آسپاراژیناز آنزیمی است که موجب هیدرولیز آسپاراژین به اسید آسپاراتیک و آمونیاک می شود . نام دیگر آن ال-آسپار است . این آنزیم امروزه جهت درمان بیماری سرطان خون و برخی تومور ها استفاده می شود. بطور کلی سلولهای سرطانی قادر به سنتز اسید آمینه غیر ضروری آسپاراژین نیستند در حالی که سلولهای نرمال خودشان این اسید آمینه را می سازند لذا سلولهای سرطانی نیازمند به مقادیر بالا از آسپاراژین در حال گردش می باشند . ال- آسپاراژیناز با تجزیۀ ال-آسپاراژین مانع از دسترسی سلولهای سرطانی به منابع این اسیدآمینه می شود . مهمترین اثر جانبی این دارو حالت آلرژی یا واکنش افزایش حساسیت است . هدف ما از این تحقیق 1- تهیه پروتئین آنزیم ال-آسپاراژیناز از باکتری جهش یافتهE. coli. 2- تاثیر این پروتئین بر روی یک رده سلولی سرطانی به منظور ارزیابی فعالیت آن و 3- دستیابی به آنزیم ال-آسپاراژیناز موثرتر ، با کارایی بالا و عوارض جانبی کمتر بوده است. لذا به منظور رسیدن به اهداف فوق مراحل آزمایشگاهی زیر انجام شد: 1- قرار دادن باکتریE. coliدر معرض نور UV . 2- تخلیص DNA و انجام PCR به منظور تکثیر ژن آنزیم. 3- قرار دادن سکانس در داخل پلاسمید pET23a(+) و انتقال بهE. coli.4- خالص سازی پروتئین و تعیین مقدار آن. 5- تاثیر بر روی یک لاین سرطانی و تعیین مقدار تاثیر آن. به این ترتیب بعد از ایجاد جهش و سنجش میزان تولید و فعالیت آنزیم ال-آسپاراژیناز در کلنی های جهش یافته و تخلیص و تکثیر ژن این آنزیم از باکتری هایی که ال-آسپار را بیش از حد معمول تولید می کردند، محصول PCR این ژن ها برای تعیین توالی ارسال گردید و پس از تعیین توالی و مطابقت با بانک ژن بین المللی ncbi ، سکانس قطعه ژنیال-آسپاراژینازIIاز باکتریE. coliKIAU B1 به عنوان یک سکانس جدید در بانک ژن با کدGenBank: HQ116626.1 به ثبت رسید. ژن مذکور در وکتورpET23a(+)کلون و سپس پلاسمید نوترکیب حاصل در سلول هایE. coliBL21 ترانسفر شد. . از سلول های ترانسفر شده ،پروتئین نوترکیب ال-آسپاراژیناز استخراج شد و پس از سنجش این پروتئین آنزیمی با تست های نسلریزاسیون و برادفورد، میزان فعالیت آنزیمی(IU) و پروتئین کلّی(mg) آن مشخص و با نمونۀ استاندارد مقایسه شد. همچنین از نظر تأثیر بر سلول های سرطانی HeLa و LCL ، با نوع استاندارد قیاس شد. نتایج نشان داد که فعالیت ویژه ال-آسپاراژیناز نوترکیب برابر باIU/mg 178 می باشد، در حالی که فعالیت ویژه ال-آسپاراژیناز استانداردIU/mgr 77 به دست آمد. همچنین، آنزیم نوترکیب علاوه بر آن که از نظر سکانس و قدرت آنزیمی با نوع استاندارد تفاوت نشان می دهد ، نسبت به آن به نحو موثرتری بر رده های سلولی سرطانی HeLa و LCL تاثیر می گذارد.

مقدمه:

با توجه به شیوع روز افزون انواع سرطان به عنوان یکی از مهمترین بیماری های تهدید کنندۀ سلامت انسان، دستیابی به روش های موثرتر در درمان سرطان به ویژه انتخاب ترکیبات دارویی با عوارض جانبی کمتر بیش از گذشته مورد توجه محققین قرار گرفته است.

آنزیم ال-آسپاراژیناز به صورت اختصاصی اسیدآمینه ال-آسپاراژین را به ال-آسپارتات و آمونیاک کاتالیز کرده و نقش مهمی را در متابولیسم همه ارگانیسم های زنده و نیز در داروشناسی بازی می کند(2). دو نوع ترکیب از ال-آسپاراژیناز وجود دارد : ال-آسپاراژیناز l، یک آنزیمconstitutive داخلی، و ال-آسپاراژیناز ll، یک آنزیم خارجی می باشد. این دو آنزیم از لحاظ بیوشیمیایی و ساختار ژنتیکی متفاوتند. ال-آسپاراژیناز ll به صورت گسترده در سلول هایپروکاریوتیو یوکاریوتی وجود دارد و بیش از پنج دهه مورد مطالعه فراوان قرار گرفته است(66). این آنزیم از منابع گوناگون مانند سلول های گیاهی و حیوانی، قارچ ها، مخمرها و باکتری ها جدا شده است(61).

ال-آسپاراژینازll یک عامل شیمی درمانی مهم می باشد که برای درمان نوعی از اختلالات لنفوپرولیفراتیو و لنفوما، به ویژه لوکمی لنفوبلاستیک حاد یا ALL[1] بکار برده می شود. این آنزیم بخش اصلی ترکیب پروتوکل های شیمی درمانی است که در درمان ALL اطفال به مدت تقریباً 30 سال استفاده می شود(6،5،4،3،2،1). بر این اساس، همچنین این آنزیم در جدیدترین رژیم های درمانی چند عاملی برای ALL بالغین قرار دارد(8،7). ال-آسپاراژیناز به عنوان یک دارو، اثربخشی خود را در درمان و مراحل بعدی استراتژی های مختلف شیمی درمانی اثبات کرده است. بزرگ ترین محدودیت استفاده از ال-آسپاراژیناز حساسیت شدید بالینی در دز اثر بخشی است، که در 78-3 درصد بیماران تحت درمان با فرم های اصلاح نشده آنزیم ظاهر می شود(11،10،9،3). با گذشت بیش از 10 سال به نظر می رسد پگ-ال-آسپاراژیناز به عنوان یک ترکیب جانشین برای ال-آسپاراژیناز ، مشکلات ناشی از انواع ترکیبات طبیعی را اصلاح کرده است(13،12). در این تحقیق سعی بر این شد تا با ایجاد جهش در باکتریKIAU E. coli، ارزیابی میزان تولید آنزیم ال-آسپاراژینازll در سویه جهش یافته، و دستیابی به ترتیب توالی جدید در ژن این آنزیم و کلون کردن آن، بتوان ال-آسپاراژینازی استخراج کرد که از نظر فعالیت ویژه و اختصاصیت در سطح بالاتری نسبت به نوع استاندارد قرار داشته باشد. همچنین با تاثیر این پروتئین آنزیمی بر رده سلولی سرطانی و ارزیابی فعالیت و درصد کشندگی آن بر این سلول ها، بتوان به آنزیم ال-آسپاراژیناز موثرتر، با کارایی بالا و عوارض جانبی کمتر دست یافت.

فصل اول: کلیات

1-1-5- هزینه های حوادث……………………………….. 8
1-2- مروری بر فجایع عظیم صنعتی در گذشته………………………………. 9
1-2-1- حادثه عظیم نیروگاه هسته ای چرنوبیل……………………………….. 9
1-2-2- آتش سوزی در مجتمع پتروشیمی پردیس یک عسلویه……………………. 11
1-2-3- انفجار فیسین فرانسه……………………………… 11
1-2-4- آتش سوزی و انفجار در سکوی تولید نفت دریای شمال، پایپر آلفا………. 11
1-2-5- حادثه بوپال هندوستان……………………………….. 12
1-2-6- انفجار در مجتمع پتروشیمی خارک………………………………… 12
1-3 تعاریف………………………………… 13
1-3-1- ریسك………………………………… 13
1-3-2- مخاطره……………………………… 13
1-3-3- واقعه………………………………. 13
1-3-4- حادثه………………………………. 14
1-3-5- ایمنی……………………………….. 14
1-3-6-ریسك قابل تحمل……………………………….. 14
1-4- معیار اندازه گیری ریسك………………………………… 14
1-4-1- شاخص ریسك………………………………… 14
1-4-2- شدت متوسط تلفات……………………………….. 15
1-4-3- ریسك شخصی……………………………….. 15
1-4-4- ریسك جمعی……………………………….. 15
1-5- ارزیابی ریسك………………………………… 15
1-6- شناسایی مخاطرات……………………………….. 16
1-6-1- مرور ایمنی……………………………….. 17
1-6-2-آنالیز چک لیست………………………………… 18
1-6-3- آنالیز پرسش…………………………………. 18
1-6-4- تحلیل مواد موجود در فرآیند وشرایط بحرانی………………… 19
1-6-5- تجزیه و تحلیل مقدماتی خطر(PHA) …………………………19
1-6-6- مطالعه مخاطرات و راهبری (HAZOP)………………………. 20
1-6-7- تحلیل مخاطرات……………………………….. 20
1-6-8-تحلیل عیب ها و اثرات……………………………….. 21
1-7- مدل سازی پیامد………………………………. 21
1-9- محاسبه ریسک………………………………… 22
1-9-1- منحنی F-N………………………………
1-9-2- معیارهای پذیرش ریسک………………………………… 24
1-10- کاهش ریسک………………………………… 25
1-11- نتیجه گیری……………………………….. 26
فصل دوم: تجزیه و تحلیل مخاطرات و راهبری سیستم…………….28
2-1- مقدمه………………………………. 29
2-2- تعریف HAZOP……………………………….
2-3- دلایل فراگیر شدن روش HAZOP……………………………….
2-4- شرح فعالیت ها در روش HAZOP……………………………….
2-5- اطلاعات شروع به کار……………………………… 30
2-6- مراحل HAZOP……………………………….
2-7- گروه HAZOP……………………………….
2-8- جدول HAZOP……………………………….
2-8-1- ورودی های جدول HAZOP……………………………….
2-9- نرم افزارهای کاربردی و دلایل استفاده از آنها………………. 38
2-10- معایب عمده روش HAZOP……………………………….
2-11- ماتریس ریسک………………………………… 40
2-12 – انتگراسیونمدل ریاضیبه عنوان راهکار پیشنهادی جهت بهبود معایب روش HAZOP…………
2-13– نتیجه گیری………………………………42
فصل سوم: شناخت کلی واحد utility مجتمع گازپارس جنوبی……………. 44
3-1- مقدمه………………………………. 45
3-1-1- شرکت مجتمع گاز پارس جنوبی……………………………… 46
3-2-1- واحد 100: سیلابه گیر، تجهیزات دریافت و HP separator…………..
3-2-2- واحد 101: شیرین سازی گاز……………………………… 49
3-2-3- واحد 102: احیاء گلایكل……………………………….. 49
3-2-4- واحد 103: تثبیت میعانات گازی……………………………….. 50
3-2-5- واحد 104: نم زدایی و حذف جیوه……………………………… 50
3-2-6- واحد 105: بازیافت اتان……………………………….. 51
3-2-7- واحد 106: صادرات گاز……………………………… 52
3-2-8- واحد 107: جداسازی گاز مایع………………………………. 53
3-2-9- واحد 108: بازیافت گوگرد………………………………. 53
3-2-9-1- مرحله كلوس (Clause) ………………………………54
3-2-9-2- مرحله گاز زدایی……………………………….. 54
3-2-9-3- آشغال سوز (Incinerator)……………………………… 55
3-2-10- واحد 109: جداسازی گازهای اسیدی و هیدروكربن ها از آب………55
3-2-11- واحد 110: پشتیبان واحد 103………………………………. 56
3-2-12-واحد 111: پروپان خنك كننده……………………………… 56
3-2-13- واحد 113: احیا كاستیك………………………………… 57
3-2-14- واحد 114: فرآوری پروپان……………………………….. 58
3-2-15- واحد 115: فرآوری بوتان……………………………….. 59
3-2-16- واحد 116: فرآوری اتان……………………………….. 59
3-2-16-1- بخش جذب (Absorber)……………………………… 60
3-2-16-2- بخش احیا (Regeneration) ………………………………60

3-2-16-3-بخش آبگیری (Dehydration)……………………………… 60
3-2 -17- واحد 121: تولید بخار آب……………………………….. 61
3-2-18- واحد122: گاز سوخت (fuel gas)……………………………… 62
3-2-19- واحد 123: تولید هوای ابزاردقیق……………………………….. 63
3-2-20- واحد124: تولید نیتروژن……………………………….. 64
3-2-21- واحد 125: تأمین آب……………………………….. 65
3-2-22- واحد 126: شیرین سازی آب……………………………….. 66
3-2-23- واحد 127: تولید آب بدون املاح………………………………. 67
3-2-24- واحد 128: تولیدآب آشامیدنی(potable water)…………… 67
3-2-25- واحد 129: تصفیه پسابهای صنعتی…………………………. 68
3-2-25-1- تصفیه آب روغنی و هیدرو كربن ها ……………………..68
3-2-25-2- تصفیه آب های شیمیایی……………………………….. 68
3-2-25-3- تصفیه فاضلاب انسانی……………………………….. 69
3-2-26- واحد130: آب آتش نشانی……………………………….. 70
3-2-27- واحد 131: تأمین سوخت مصرف كننده های دیزلی………….. 71
3-2-28- واحد132: آب خنك كن……………………………….. 71
3-2-29- واحد 140: مشعل ها (flares)……………………………… 72
3-2-30- واحد 141: مخزن درین……………………………….. 72
3-2-31- واحد 142: حوضچه سوزان (Burn Pit)……………………………… 73
3-2-32- واحد 143: مخازن میعانات گازی……………………………….. 73
3-2-33- واحد 144: جامد سازی گوگرد………………………………. 74
3-2-34- واحد 145: ذخیره پروپان جهت سردسازی……………………. 74
3-2-35- واحد 146: ذخیره مواد شیمیایی……………………………….. 74
3-2-36- واحد 147: ذخیره سازی پروپان صادرات………………………… 75
3-2-37- واحد 148: ذخیره سازی بوتان صادرات……………………….. 76
فصل چهارم: مطالعات HAZOP واحد Utility پالایشگاه پنجم مجتمع گاز پارس جنوبی……77
4-1- مقدمه………………………………. 78
4-2- مدارک مطالعات HAZOP واحد Utility پالایشگاه پنجم………………. 79
4-2-1- اعضای تیم HAZOP……………………………….
4-2-2- لیست شماره نقشه های به کار رفته درHAZOP……………………
4-2-3- لیست گره ها……………………………… 80
4-2-4- بررسی انحرافات در هر گره……………………………… 83
4-2-5- جداول HAZOP : شامل کلیه جداول نهایی شده می باشد. (Worksheet)……. 83
4-2-5-1- تفسیر جدول الف-61-کاهش/قطع جریان در سیستم ورودی آب دریا به مخزن101….84
4-2-6- لیست پیشنهادات ارائه شده در جلسات HAZOP………………………
4-3- فرضیات و ملاحظات در انجام مطالعات HAZOP…………………………….
4-4- راه کارهای مؤثر برای کاهش ریسک در واحد Utility پالایشگاه پنجم……….. 86
4-4-1- تجهیزات حفاظت فردی………………………………86
4-4-2- مواد فرآیندی……………………………….. 86
4-4-3- بهداشت کار……………………………… 87
4-4-4- حوادث……………………………….. 87
4-4-5- آموزش………………………………… 87
4-4-6- تعمیرات و نگهداری……………………………….. 87
4-4-7- فرآیند………………………………. 88
4-4-8- ایمنی……………………………….. 88
4-4-9- مدیریت………………………………… 88
4-5- نتیجه گیری……………………………….. 88
فصل: پنجم نتیجه گیری و پیشنهادات………………………………… 89
5-1- مقدمه………………………………. 90
5-2- پیشنهادات عمومی……………………………….. 90
5-3- نتایج حاصل از مطالعه مخاطرات و راهبری (HAZOP)……………. 91
5-3-1- پیشنهادات سخت افزاری……………………………….. 92
5-3-2- پیشنهادات دستورالعملی و توصیه ها……………………………… 95
5-3-3- پیشنهادات مطالعاتی و تحقیقاتی……………………………….. 97
5-4- پیشنهاداتی برای كارهای آینده ………………………………97
مراجع………………………………. 98
پیوست ها ………………………………101
پیوست (الف): مدارک HAZOP……………………………….
پیوست (ب): گره بندی انجام شده بر روی نقشه های p&id واحدUtility پالایشگاه پنجم…….132
پیوست (ج): پرسش نامه HSE……………………………….
چکیده:
توجه به مسئله ایمنی در تأسیسات صنعتی و شیمیایی از اهمیت بسیاری برخوردار است. به گواهی آمار و ارقام، میزان خسارات و صدمات انسانی اقتصادی و زیست محیطی ناشی از حوادث صنعتی همه ساله در جهان بسیار بالا است. افزون بر اینکه برخی از این خسارات اساساً غیرقابل جبران هستند. بنابراین برای پیشگیری از این صدمات و کشف مخاطراتی که منجر به بروز حوادث می شود و نیز آنالیز ریسک واحد صنعتی به تدابیر خاص و روش سامان نیاز است. در این مطالعه، ارزیابی خطرات و آنالیز ریسک واحد Utility پالایشگاه پنجم مجتمع گاز پارس جنوبی مورد بررسی قرار گرفته است. برای شناسایی خطرات این واحد از تکنیک (HAZOP) استفاده شده است که در آن به کشف مشکلات فرایندی نیز پرداخته می شود در این راستا انحراف موجود توسط تیم HAZOP بررسی شده است. نتیجه این پژوهش ارائه پیشنهاد ها کارشناسی حاصل از روش HAZOP برای کاهش ریسک و بالا بردن ضریب ایمنی و عملیاتی واحد است. براساس کارشناسی های صورت گرفته راندمان واحد Utility به شدت وابسته به جریان و فشار ناشی از آن در واحد می باشد، زیرا جریان ورودی به واحد ابتدا در مخزن ذخیره شده سپس با فشار متناسب آن واحد توزیع می گردد پس هرچه بتوان این پارامترها را کنترل و از افزایش­ و کاهش آن ها جلوگیری نمود. جریان با یک فشار عملیاتی نرمال در سیستم گردش داشته و از خسارات احتمالی که از جمله آن ها می توان به شکسته شدن لاین ها به دلیل حساسیت در مقابل تنش های زیاد و توقف پمپ و از سرویس خارج شدن واحد به دلیل کاهش جریان جلوگیری نمود.
مهم­ترین پیشنهادات ارائه شده در این مطالعه شامل نصب هشداردهنده های دما و فشار در واحد می باشد. همچنین براساس نتایج این مطالعه دستورالعمل راه­اندازی واحد اصلاح گردید.
پیشگفتار:
امروزه ایجاد محیطی ایمن که در آن تمامی عوامل آسیب رسان شناسایی، ارزیابی، حذف یا کنترل گردیده تا سلامت افراد و تأسیسات را تضمین نماید از اولویت های مدیریت های صنعتی می باشد، علم ایمنی نیز همانند نگرش سنتی به ایمنی عکس العملی بوده است یعنی تا هنگامی که حوادث رخ نمی داد مدیران به فکر یافتن اشکالات و رفع آنها بر نمی آمدند. در دهه های اخیر ملاحظات وجدانی و اخلاقی صاحبان صنایع در کنار الزامات قانونی و تعهدات بیمه ای، توجه به علم ایمنی را در جایگاهی ویژه قرار داده است. در این میان از تأثیر زیاد ایمنی بر سود آوری و افزایش رقابت با همکاران نیز نباید غافل شد. بنابراین توجه به ایمنی با نگرش پیشگیرانه نسبت به حوادث به خصوص در صنایع نفت، گاز و پتروشیمی که پتانسیل بالایی جهت ایجاد سوانح انسانی و زیست محیطی دارند، محور توجه قرار گرفته است.
صنعت گاز در ایران به دلیل وجود ذخایر عظیم گازی در این کشور از اهمیت ویژه ای برخوردار است. پالایشگاه های گاز یکی از مهم ترین قسمت های این صنعت به شمار می روند و لزوم افزایش ایمنی در این بخش ها از مهم ترین موارد مورد توجه همه می باشد زیرا کوچک ترین مشکلی در این صنعت علاوه بر فجایع عظیم زیست محیطی و انسانی ممکن است مسایل اقتصادی جبران ناپذیری را به کشور تحمیل نماید.
روش های متعددی جهت افزایش فرایندهای جاری در صنایع گازی مورد استفاده قرار می گیرند که مطالعه مخاطرات و راهبری فرآیند[1] یکی از بهترین این روش ها است. استفاده از این روش در کشورهای صنعتی به صورت یک الزام مطرح می شود اجرای این سیستم در کشورهای رو به توسعه شدیداً توصیه شده و در بسیاری از صنایع نفت، گاز و پتروشیمی مورد استفاده قرار می گیرد. اجرای سیستم HAZOP در پالایشگاه های ایران به منظور افزایش ایمنی سیستم ها به یکی از مهم ترین کارهای قابل انجام در این کارخانجات تبدیل شده و تاکنون در بسیاری از صنایع مرتبط با نفت، گاز و پتروشیمی مورد استفاده قرار می گیرد.
از کارهای انجام شده در این صنایع می توان به مطالعه HAZOP و ارزیابی ریسک برای واحد اوره مجتمع پتروشیمی شیراز، واحدهای شیرین سازی مجتمع پتروشیمی رازی، واحد تولید اکسید اتلین مجتمع پتروشیمی اراک، واحد تولید فلور- UCF اصفهان واحد های بی کربنات سدیم مجتمع پتروشیمی شیراز، واحد بازیافت LPG پالایشگاه گاز کنگان، واحد تولید پلی استایرن پتروشیمی تبریز، واحد های بالادستی منطقه دهران و دانان، واحد آبگیری از دریا در پتروشیمی مبین و واحد آیزوماکس شرکت پالایش نفت بندرعباس اشاره نمود. البته فعالیت های انجام شده در این زمینه بسیار زیاد و رو به پیشرفت است و هر روز واحدهای بیشتری از مجتمع پتروشیمی تحت این مطالعه قرار می گیرند[1].
دلایل ضرورت و توجیه اجرای پروژه در واحد Utility پالایشگاه پنجم مجتمع گاز پارس جنوبی:
1- با توجه به اینکه بیش از 5 سال از زمان نصب و راه اندازی این واحد می گذرد و این در حالی است که در واحد Utility هیچ گونه مطالعات HAZOP موجود و در دسترس نمی باشد و پس از بهره برداری واحد، مطالعات شناسایی مخاطرات از طریق مطالعات HAZOP انجام نگردیده است.
2- حجم سرمایه گذاری بالا به همراه اهمیت بعد استراتژیک تأمین سوخت و انرژی مستمر و مداوم ایجاب می کند عوامل مخاطره آمیز و عواملی که باعث کاهش نرخ تولید و یا برهم زننده کیفیت محصول می گردد، شناسایی و تدابیر لازم برای حذف آن ها اتخاذ گردد.
3- مراکز دولتی و افراد همیشه در مقابل تغییرات مقاومت نشان می دهند. ارائه راهکار های علمی، مدون و مستدل از طریق گروهی متخصص و زبده با کمک تجربیات پرسنل خود مجتمع، راه را برای بهبود هر چه سریع تر سطح ایمنی و عملیاتی سیستم هموارتر می نماید.
هزینه های مستقیم و غیرمستقیم ناشی از حوادث هر ساله صدمات مالی و جانی قابل توجهی را متوجه صنایع کشور و علی الخصوص صنعت پالایش گاز به دلیل ماهیت فعالیت های این صنعت به عنوان یکی از صنایع پرمخاطره کشور می سازد، لذا برای جلوگیری از وقوع چنین حوادثی، استفاده از یک روش سیستماتیک برای شناسایی مخاطرات پنهان موجود در واحدهای صنعتی و بازبینی مستمر آن ضروری است.
بسیاری از مدیران و کارشناسان توجه به مسائل ایمنی را صرفه جویی در وقت و سرمایه قلمداد می کنند. پیاده سازی برنامه های ایمنی در واحدهای صنعتی، شناسایی پتانسیل های خطر و ارائه راهکارهای اجرایی برای پیشگیری و کاهش صدمات ناشی از حوادث، می تواند مزایای بسیاری را به لحاظ اقتصادی و استفاده بهینه از زمان در برداشته باشد. از جمله این مزایا می توان به موارد زیر اشاره نمود:
کاهش هزینه های مربوط به:
– تخریب تجهیزات
– وقفه در کار
– راه اندازی مجدد و رسیدن به حالت یکنواختی در فرآیندهای پیوسته
– اتلاف مواد
– غیبت کارکنان صدمه دیده در حوادث
– انتقال و معالجه مصدومین
– آموزش نفرات جدید
– افزایش بازده در استفاده از منابع و به تبع آن بالا رفتن سودآوری اقتصادی شرکت
– افزایش راندمان تولید
– بالا بردن کیفیت محصولات
– نشان دادن تعهد مدیریت سازمان نسبت به موارد ایمنی و بهبود مستمر
– افزایش اعتبار سازمان در مورد رعایت اصول ایمنی و بهداشت کار
این پایان نامه مشتمل بر 5 فصل می باشد که در فصل اول تعاریفی مرتبط با ایمنی و شرح اجمالی از روش های مختلف و متعارف شناسایی مخاطرات آمده است. در ادامه و در فصل دوم روش HAZOP به طور كامل و مطابق با استاندارد های موجود و به منظور آشنایی خوانندگان و همكاران محترم پروژه بیان گردیده است. در فصل سوم فرآیند Utility پالایشگاه پنجم مجتمع گاز پارس جنوبی به همراه توضیحات بخش ورودی واحد و مباحث كنترلی آنها به تفصیل شرح داده شده است. در فصل چهارم نحوه ی انجام مطالعات HAZOP در واحد Utility پالایشگاه پنجم مجتمع گاز پارس جنوبی و فرضیات و ملاحظات انجام كار بیان شده است و در فصل پنجم نتیجه گیری و پیشنهادات از كل پروژه به طور مفصل شرح داده شده است.
فصل اول: مقدمه ای بر ایمنی و روش های شناسایی مخاطرات
1-1- تاریخچه ایمنی در صنعت
2-1-1- سلامت و جنبش ایمنی، از گذشته تا حال
از دیرباز معمولاً لزوم ارتقاء ایمنی زمانی احساس می شد که فقدان ایمنی منجر به وقوع شرایطی با پیامدهای ناگوار اجتماعی یا اقتصادی می گردید. وقوع حوادث در تأسیسات صنعتی و سیستم های تکنولوژیک لزوم تداوم تحول در تحقیقات ایمنی در زمینه استانداردهای ایمنی، ریشه یابی رویدادها و حوادث، اصلاح روش های ارزیابی ایمنی و شناخت مخاطرات، نقش عوامل موثر بر ایمنی را نشان می دهد. معمولاً در پی شوک وقوع یک حادثه، مدیریت تأسیسات صنعتی و سیستم های تکنولوژیک، تصمیم به ریشه یابی عوامل به وجود آورنده شرایط ناگوار مذکور می کند. چنانچه این ارزیابی ها به درستی انجام نشوند ریشه های فعال به وجودآورنده حوادث بدون تغییر در سیستم باقی می مانند و در فرصت های دیگر و در ترکیب با شرایط خاص بهره برداری، خرابی های سخت افزاری، خطاهای انسانی و نقایص سازمانی به شکل یک حادثه دیگر سر بیرون می آورد.