1-2-2-تکنیک های مختلف انجمادی

3

1-2-2-1-انجماد آهسته

4

1-2-2-2-انجماد شیشه ای

5

1-2-3-محلول های انجمادی

5

1-2-3-1-ضدیخ ها

5

1-2-3-2-سرم

7

1-2-4-تاثیرات انجماد بر بافت بیضه

7

3- 1-3-پیوند

9

4- 1-4-کشت

10

5- 1-5-تغییرات ملکولی متاثر از انجماد

11

1-5-1-آپوپتوزیس

12

1-5-1-1-مسیر خارجی آپوپتوز و ژن های دخیل در آن

13

1-5-1-2-مسیرداخلی آپوپتوز و ژنهای دخیل در آن

14

1-5-1-3-P53

16

1-5-1-4-کاسپاز 3

17

1-6-هدف

18

1-7-پرسش پژوهشی

18

1-8-فرضیات

18

فصل دوم: مواد و روش ها

19

2-1-تهیه ی بافت بیضه و گروه های مورد مطالعه

20

2-2-انجماد شیشه ای بافت بیضه

21

2-2-1-روش تهیه محیط پایه

21

2-2-2-روش تهیه محلول های انجماد شیشه ای

21

2-2-2-1-روش آماده سازی محلول انجمادی I

21

2-2-2-2-روش آماده سازی محلول انجمادی II

22

2-2-3-مراحل انجماد شیشه ای

22

2-2-3-1-روش انجمادی I

22

2-2-3-2-روش انجمادی II

23

2-2-4-ذوب بافت بیضه

23

2-2-4-1-روش تهیه محلول های ذوب

23

2-2-4-2-مراحل ذوب

23

2-5-مطالعات میکروسکوپی و بافت شناسی بافت بیضه

24

2-6-بررسی آپوپتوز و بقا سلولی

26

2-6-1-هضم مکانیکی و آنزیمی بافت بیضه

26

2-6-1-1-هضم مکانیکی

27

2-6-1-2-هضم آنزیمی

27

2-6-1-3-خنثی سازی اثر آنزیم و بررسی بقا با استفاده از رنگ PI

27

2-6-2-ارزیابی بقای سلولی به روش فلوسایتومتری

28

2-6-3-بررسی آپوپتوز سلولی

29

2 -7-کشت بافت بیضه

30

2-7-1-آماده سازی آگار

30

2-7-2-آماده سازی محیط کشت

31

2-7-2-1-روش تهیه محیط RPMI

31

2-7-3-کشت بافت بیضه

32

2-8-ارزیابی ژن های آپوپتوزی

32

2-8-1-نگهداری بافت در محلول RNA-later

32

2-8-2-استخراج RNA با استفاده از ترایزول

32

2-8-2-1-هموژن کردن بافت

2-8-2-2-مرحله ی جداسازی

33

33

2-8-2-3-رسوب RNA

33

2-8-2-4-شستشو RNA

33

2-8-3-بررسی کیفی RNA های استخراج شده

34

2-8-4-تیمار نمونه­یRNA با استفاده از DNase1 جهت حذف آلودگی ژنومی

34

2-8-5-سنتز cDNA

35

2-8-6-پرایمر

37

2-8-6-1-آماده سازی پرایمرها

37

2-8-6-2-بررسی جایگاه اتصال پرایمرها

39

2-8-7-الکتروفورز

39

2-8-7-1-روش ساخت بافر50X TAE

39

2-8-7-2-روش ساخت بافر X TAE1

40

2-8-7-3-طرز تهیه ی ژل آگارز

40

2-8-7-4-بررسی آلودگی پرایمر

40

-8-7-4-بررسی کیفیت RNA

41

2-8-8-بررسی گرادیانت دمایی پرایمر

41

2-8-9 Real-Time PCR

42

2-8-9-2-بررسی کمی بیان ژن با استفاده از روش Real-Time PCR

43

2-9-آنالیز آماری داده

44

فصل سوم: نتایج

45

3-1-بررسی مورفولوژی بافت بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین

46

3-2-مقایسه بقای سلولی در گروه کنترل با گروه های انجمادی I و II بلافاصله پس از ذوب

46

3-3-بررسی میزان وقوع آپوپتوز پس از کشت بافت بیضه

47

3-3-1-ارزیابی میزان بقای سلولی طی کشت بافت بیضه

47

3-3-2-آپوپتوز اولیه ی سلولی طی کشت بافت بیضه

47

3-3-3-بررسی میزان وقوع آپوپتوز پس از کشت بافت بیضه

48

3-3-4-نکروز بافتی طی کشت بافت بیضه

48

3-4-بررسی بیان ژن های آپوپتوزی در سطح رونوشت

49

3-4-1-بررسی بیان رونوشت ژن های دخیل در مسیر های آپوپتوزی

49

3-4-2-Bax

49

3-4-3-BCL2

49

3-4-4-نسبت بیان BAX به BCL2

50

3-4-5-Caspase3

50

3-4-6-Fas

50

3-4-7-Fas Ligand

51

3-4-8-P53

51

27- فصل چهارم: بحث

66

4-1-کلیات

67

4-2-بررسی هایمورفولوژیکدر ساعات مختلف کشت در گروه های مورد مطالعه

68

4-3-بررسی بقا و آپوپتوز سلولی در گروه های مورد مطالعه

69

4-4-بررسی بیان ژن های مرتبط با وقوع آپوپتوز در گروه های مورد مطالعه

71

4-5-نتیجه گیری

75

4-6-پیشنهادات

76

 

فهرست جداول

عنوان صفحه

جدول 2-1-مراحل رنگ آمیزی هماتوکسیلین ایوزین	26
جدول2-2-مشخصات پرایمرهای مورد استفاده	39
جدول 2-3-برنامه ی مورد استفاده جهت بررسی گرادیانت دمایی پرایمرها	42
جدول 3-1- میانگین بقای سلولی درگروه های کنترل، انجمادی I و انجمادی II	53
جدول3-2- میانگین بقای سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف	53
جدول 3-3- میانگین درصد آپوپتوز اولیه ی سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	54
جدول 3-4-میانگین درصد آپوپتوز ثانویه ی سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	54
جدول 3-5- میانگین درصد سلول های نکروتیک در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	55
جدول 3-6-میزان بیان ژن Bax در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	55
جدول 3-7-میزان بیان ژن BCL2 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت53	56
جدول3-8-نسبت بیان BAX به BCL2 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	56
جدول3-9-میزان بیان ژن Caspase3 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	57
جدول 3-10-میزان بیان ژن Fas در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	57
جدول 3-11-میزان بیان ژنLigand Fas در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	58
جدول 3-12- میزان بیان ژن P53 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	58

فهرست اشکال

عنوان صفحه

ی نوشته‌ها

هیپرپرولاکتینمی…………………………………………………………………………………………….. 31

2-6-3- بالا بودن غلظت استروژن به طور مزمن……………………………………………………………………. 31

2-6-4- نقص در فوران LH……………………………………………………………………………………………. 32

2-7- بیماری های موضعی تخمدان……………………………………………………………………………………… 33

2-7-1- سندرم تخمدان چند کیستی…………………………………………………………………………………… 33

2-7-1-1- زنان با یک مشخصه ی منحصر تخمدان های پلی کیستیک………………………………………….. 36

2-7-1-2- تعریف حاضر از تخمدان پلی کیستیک…………………………………………………………………. 36

2-7-1-3- ویژگی های بالینی و بیوشیمیایی PCOS……………………………………………………………….. 39

2-7-1-3-1- گنادوتروپین ها در PCOS……………………………………………………………………………. 39

2-7-1-3-1-1- ترشح نامناسب گنادوتروپین……………………………………………………………………… 39

2-7-1-3-2- تولید استروئید در زنان PCOS………………………………………………………………………. 40

2-7-1-3-2-1- ترشح آندروژن………………………………………………………………………………………. 40

2-7-1-3-2-2- تولید استروئید در تخمدان………………………………………………………………………… 40

2-7-1-3-2-3- هیپرآندروژنمی………………………………………………………………………………………. 43

2-7-1-3-2-3-1- هیپرآندروژنیسم بالینی…………………………………………………………………………. 45

2-7-1-3-3- اختلالات تیروئیدی…………………………………………………………………………………….. 46

2-7-1-3-4- هیپرپرولاکتینمی…………………………………………………………………………………………. 46

2-7-1-3-5- خصوصیات متابولیکی در PCOS…………………………………………………………………… 46

2-7-1-3-5-1- تحمل گلوکز…………………………………………………………………………………………. 46

2-7-1-3-5-2- مقاومت به انسولین…………………………………………………………………………………. 47

2-7-1-3-5-3- کلیرانس و ترشح انسولین………………………………………………………………………… 49

2-7-1-3-5-4- مقاومت انسولینی در زنان PCO………………………………………………………………… 50

2-7-1-3-5-5- فاکتورهای رشد شبه انسولینی در PCOS………………………………………………………. 50

2-7-1-3-6- لپتین و PCOS………………………………………………………………………………………….. 52

2-7-1-3-7- لیپیدها و PCOS………………………………………………………………………………………… 54

2-7-1-3-7-1- دیس لیپیدمی…………………………………………………………………………………………. 55

2-7-1-3-8- تنظیم وزن و انرژی…………………………………………………………………………………….. 55

2-7-1-3-9- هیرسوتیسم………………………………………………………………………………………………. 56

2-7-1-3-9-1- هیرسوتیسم ایدیوپاتیک……………………………………………………………………………. 57

2-7-1-3-10- اختلالات قاعدگی و خطر ابتلا به سرطان آندومتر…………………………………………….. 58

2-7-1-3-11- ژنتیک PCOS…………………………………………………………………………………………. 59

2-7-1-3-12- مدیریت بالینی………………………………………………………………………………………… 60

2-7-1-3-13- تغییرات نحوه ی زندگی……………………………………………………………………………… 61

2-8- ناهنجاری های متابولیک و خطرات سلامت همراه با آن ها…………………………………………………. 62

2-9- معیارهای تشخیص PCOS………………………………………………………………………………………. 64

فصل سوم: مواد و روش ها

3- 1- منشور اخلاقی……………………………………………………………………………………………………… 66

3- 2- جامعه ی مورد مطالعه……………………………………………………………………………………………… 66

3- 3- نمونه گیری…………………………………………………………………………………………………………… 67

3-3-1- خون گیری وریدی………………………………………………………………………………………………. 67

3-4- آزمایش های بیوشمیایی……………………………………………………………………………………………. 67

3-4-1- اندازه گیری گلوکز………………………………………………………………………………………………. 67

3-4-2- اندازه گیری پروفایل لیپیدی…………………………………………………………………………………… 68

3-4-3- اندازه گیری تری گلیسرید………………………………………………………………………………………. 68

3-4-4- اندازه گیری کلسترول…………………………………………………………………………………………… 69

3-4-5- اندازه گیری لیپوپروتئین………………………………………………………………………………………… 70

3-4-5-1- اندازه گیری لیپوپروتئین با دانسیته ی بالا به روش مستقیم…………………………………………… 70

3-4-5-2- اندازه گیری لیپوپروتئین با دانسیته ی پایین……………………………………………………………… 70

3-4-6- سنجش هورمونی……………………………………………………………………………………………….. 71

3-4-6-1- اندازه گیری هورمون LH در سرم………………………………………………………………………… 71

3-4-6-2- اندازه گیری هورمون FSH در سرم………………………………………………………………………. 72

3-4-6-3- اندازه گیری هورمون تستوسترون در سرم………………………………………………………………. 73

3-4-6-4- اندازه گیری هورمون DHEA-S………………………………………………………………………….. 74

3-4-6-5- اندازه گیری هورمون پرولاکتین در سرم………………………………………………………………… 75

3-4-6-6- اندازه گیری هورمون آندروستندیون……………………………………………………………………… 76

3-4-6-7- اندازه گیری هورمون پروژسترون در سرم………………………………………………………………. 76

3-4-6-8- اندازه گیری هورمون استروژن در سرم………………………………………………………………….. 77

3-4-6-9- اندازه گیری هورمون TSH در سرم………………………………………………………………………. 78

3-5- تکمیل پرسش نامه ها………………………………………………………………………………………………… 79

3-5-1- پرسش نامه ی کیفیت زندگی…………………………………………………………………………………… 79

3-5-2- پرسش نامه ی دموگرافیک……………………………………………………………………………………… 79

3-6- تجزیه و تحلیل های آماری……………………………………………………………………………………….. 79

فصل چهارم: نتایج

4-1- بررسی ویژگی های جمعیت شناختی زنان مورد مطالعه……………………………………………………… 81

4-2- مقایسه ی هورمون ها در زنان PCOS با زنان سالم…………………………………………………………… 82

4-3- مقایسه ی عوامل خونی در زنان PCOS با زنان سالم……………………………………………………….. 87

4-4- مقایسه ی عوامل بالینی در زنان PCOS با زنان سالم………………………………………………………… 89

4-5- بررسی ارتباط نمایه ی توده ی بدنی با پارامترهای مورد مطالعه……………………………………………. 90

4-5-1- بررسی ارتباط نمایه ی توده ی بدنی با هورمون های مورد مطالعه………………………………………. 90

4-5-2- بررسی ارتباط نمایه ی توده ی بدنی با عوامل خونی مورد مطالعه……………………………………… 91

4-6- بررسی ارتباط سن با پارامترهای مورد مطالعه………………………………………………………………… 92

4-6-1- بررسی ارتباط سن با هورمون های مورد مطالعه………………………………………………………….. 92

4-6-2- بررسی ارتباط سن با عوامل خونی مورد مطالعه…………………………………………………………. 92

4-7- بررسی ارتباط سطوح هورمون ها با تشخیص نهایی (PCOS- سالم)……………………………………. 94

4-8- بررسی ارتباط سطوح عوامل خونی با تشخیص نهایی (PCOS- سالم)………………………………… 96

4-9- بررسی ارتباط بین هورمون های مورد مطالعه………………………………………………………………….. 98

4-10- بررسی ارتباط بین عوامل خونی مورد مطالعه………………………………………………………………. 98

4-11- بررسی ارتباط بین عوامل خونی و هورمون های مورد مطالعه……………………………………………. 100

فصل پنجم: بحث

5-1- شایع ترین علایم بالینی در افراد مبتلا به PCOS…………………………………………………………….. 101

5-2- شایع ترین عوامل خونی غیر طبیعی در افراد PCOS………………………………………………………… 104

5-3- تغییرات هورمونی افراد PCOS………………………………………………………………………………….. 105

5-4- متغیرهای دموگرافیک در بیماران PCOS……………………………………………………………………… 106

5-4-1- رابطه ی توده ی بدنی با هورمون ها و عوامل خونی در بیماران PCOS……………………………….. 106

5-4-1-1- رابطه ی توده ی بدنی و هورمون ها……………………………………………………………………….. 106

5-4-2- رابطه ی توده ی بدنی با عوامل خونی……………………………………………………………………….. 107

5-4-3- رابطه ی سن با هورمون ها و عوامل خونی در بیماران PCOS…………………………………………. 107

5-4-3-1- رابطه ی سن با هورمون ها………………………………………………………………………………….. 107

5-4-3-2- رابطه ی سن با عوامل خونی………………………………………………………………………………. 108

5-5- اثرات متقابل متغیرهای دموگرافیکی، هورمونی و خونی در بیماران PCOS……………………………. 109

5-6- کیفیت زندگی بیماران PCOS……………………………………………………………………………………. 110

5-7- نتیجه گیری کلی……………………………………………………………………………………………………… 111

6- منابع……………………………………………………………………………………………………………………….. 114

7- پیوست ها…………………………………………………………………………………………………………………. 127

8- چکیده ی انگلیسی………………………………………………………………………………………………………. 129

فهرستجدول ها

عنوان صفحه

جدول 2-1- خلاصه ای از مطالعاتی نشان دهنده ی میزان شیوع تخمدان پلی کیستیک PCO به کمک اولتراسونوگرافی (برگرفته از Koivunen, 2001)…………………………………………………………………………………………… 36

جدول 2-2- مشخصات بافت شناسی تخمدان پلی کیستیک (برگرفته از Koivunen, 2001)……………….. 37

جدول 2-3- معیار اولتراسونوگرافی برای تشخیص PCO (برگرفته از Koivunen, 2001)………………… 37

جدول 2-4- کرایتریای تشخیصی برای سندرم تخمدان پلی کیستیک برطبق تعاریف مختلف منتشر شده، برگرفته از Conder & Escobar-Morreale, 2007 )………………………………………………………………………………. 65

جدول3-1- تعداد افراد مورد مطالعه…………………………………………………………………………………… 67

جدول 3-2- مقادیر مورد انتظار برای سیستم تست LH به روش ELISA……………………………………. 72

جدول 3-3- مقادیر مورد انتظار برای سیستم تست FSH به روش ELISA………………………………….. 73

جدول 3-4- مقادیر مورد انتظار برای سیستم تست تستوسترون به روش ELISA………………………….. 74

جدول 3-5- مقادیر مورد انتظار برای سیستم تست پرولاکتین به روش ELISA…………………………….. 76

جدول 4-1- مقایسه ی ویژگی های جمعیت شناختی زنان مبتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک و زنان سالم (کنترل) 82

جدول 4-2- مقایسه ی هورمون های مورد بررسی زنان مبتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک و زنان سالم (کنترل) 83

جدول 4-3- مقایسه عوامل خونی زنان مبتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک و زنان سالم (کنترل)……….. 87

جدول 4-4- مقایسه ی عوامل بالینی زنان مبتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک و زنان سالم (کنترل)…….. 89

جدول 4-5- ضریب همبستگی اسپیرمن بین نمایه ی توده ی بدنی با هورمون های مورد بررسی در دو گروه زنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS…………………………………………………………………………………………………………… 91

جدول 4-6- ضریب همبستگی اسپیرمن بین نمایه ی توده ی بدنی با عوامل خونی مورد بررسی در دو گروه زنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS…………………………………………………………………………………………………………… 92

جدول 4-7- ضریب همبستگی اسپیرمن بین سن با هورمون های مورد بررسی در دو گروه زنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS………………………………………………………………………………………………………………………………….. 93

جدول 4-8- ضریب همبستگی اسپیرمن بین سن با عوامل خونی مورد بررسی در دو گروه زنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS………………………………………………………………………………………………………………………………….. 93

جدول 4-9- مقادیر حساسیت، ویژگی، ارزش اخباری مثبت و ارزش اخباری منفی هورمون های مورد بررسی در نقطه ی برش تعیین شده……………………………………………………………………………………………………………… 96

جدول 4-10- مقادیر حساسیت، ویژگی، ارزش اخباری مثبت و ارزش اخباری منفی عوامل خونی مورد بررسی در نقطه ی برش تعیین شده……………………………………………………………………………………………………………… 97

جدول 4-11- ضریب همبستگی اسپیرمن بین هورمون های مورد مطالعه در دو گروه زنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS 99

جدول 4-12- ضریب همبستگی اسپیرمن بین عوامل خونی مورد مطالعه در دو گروه زنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS 98

جدول 4-13- ضریب همبستگی اسپیرمن بین عوامل خونی و هورمون های مورد مطالعه در دو گروه زنان مبتلا و غیر مبتلا به PCOS …………………………………………………………………………………………………………………….. 100

فهرستنمودارها

عنوان صفحه

نمودار 4-1- مقایسه ی هورمون LH زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای……………… 83

نمودار 4-2- مقایسه ی هورمون FSH زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای……………. 84

نمودار 4-3- مقایسه ی نسبت LH/FSH زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای………… 84

نمودار 4-4- مقایسه ی هورمون تستوسترون زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای……. 84

نمودار 4-5- مقایسه ی هورمون DHEA-S زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای…….. 85

نمودار 4-6- مقایسه ی هورمون پرولاکتین زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای……… 85

نمودار 4-7- مقایسه ی هورمون آندروستندیون زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای… 85

نمودار 4-8- مقایسه ی هورمون پروژسترون زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای……. 86

نمودار 4-9- مقایسه ی هورمون استروژن زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای……….. 86

نمودار 4-10- مقایسه ی هورمون TSH زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای…………. 86

نمودار 4-11- مقایسه ی گلوکز زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای…………………… 87

نمودار 4-12- مقایسه ی کلسترول زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای……………….. 88

نمودار 4-13- مقایسه ی LDL زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای……………………. 88

نمودار 4-14- مقایسه ی HDL زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای…………………… 88

نمودار 4-15- مقایسه ی تری گلیسرید زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای…………… 89

نمودار 4-16- مقایسه عوامل بالینی درزنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS…………………………………………. 90

نمودار 4-17- منحنی مشخصه ی عملکرد (ROC) در نقاط برش مختلف هورمون های مورد مطالعه در دو گروه زنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS………………………………………………………………………………………………………… 94

نمودار 4-17- ادامه………………………………………………………………………………………………………… 95

نمودار 4-18- منحنی مشخصه ی عملکرد (ROC) در نقاط برش مختلف عوامل خونی مورد مطالعه در دو گروه زنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS………………………………………………………………………………………………………… 98

نمودار 4-18- ادامه………………………………………………………………………………………………………… 98

فهرستشکل ها

عنوان صفحه

شکل 2-1- برش عرضی تخمدان (برگرفته از Chedumbarum Pillay, 2009)………………………………. 12

شکل 2-2- تصویر سونوگرافی یک تخمدان پلی کیستیک (برگرفته از Koivunen, 2001)…………………. 38

شکل 2-3- مسیرهای ساخته شدن استروئیدها در فولیکول انترال تخمدان بر اساس دو گنادوتروپین (برگرفته از Koivunen, 2001)………………………………………………………………………………………………………….. 42

1-2-8-2 اصول پایه ای.. 13

1-2-9- هیبریداسیون در محل فلورسنتی (FISH) 15

1-2-9-1 تاریخچه. 15

1-2-9-2 اصول بنیادی.. 15

1-2-9-3 استفاده از FISH در پژوهش های ستوژنتیک حیوانات اهلی.. 16

1-2-9-4 استفاده از مكان یابی فیزیكی ژن ها با تكنیك FISH برای تایید صحت گردآوری های ژنوم موجودات.. 17

1-2-9-5 استفاده از مكان یابی فیزیكی ژن ها با تكنیك FISH برای اتصال نقشه های لینكاژی و RH روی كروموزوم ها 19

1-2-9-6 استفاده از مكان یابی فیزیكی ژن ها با تكنیك FISH در رهیافت كلونینگ موقعیتی ژن ها و QTLها 20

1-2-10 انواع پروب های کلون DNA ژنومی استفاده شده در FISH.. 21

1-2-11 ایمونوفلوروسنس… 21

1-2-12 ویژگی های متافاز ها و نقشه های سیتوژنتیك خانواده گاو سانان. 22

1-2-12-1 آتوزوم ها و نقشه های سیتوژنتیك… 22

1-2-12-2 كروموزوم های جنسی.. 26

1-2-13 بررسی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9. 27

1-2-13-1 ژن برولا (FecB) 27

) 28

1-2-13-3 ژن BMP15 (FecX) 29

1-2-13-4 اثر متقابل بین جهش های موثر بر باروری.. 30

فصل دوم. 32

بررسی منابع. 32

2-1 سابقه مطالعات سیتوژنتیک و نقشه یابی ژن ها با تكنیك FISH در حیوانات مزرعه ای.. 33

2-2 سابقه مطالعه ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در حیوانات مزرعه ای.. 37

فصل سوم. 40

مواد و روش ها 40

3- مواد و روش ها 41

3 – 1 تهیه نمونه های خون و کشت سلول های خونی.. 41

3 – 1- 1 تهیه ی نمونه های خون. 41

3 – 1- 2 کشت سلول های خونی با روش RB و انتخاب اسلاید های مناسب برای FISH.. 41

3-2 انتخاب و سفارش كلون های BAC.. 42

3-2-1 شناسایی كلون های BAC حاوی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9. 44

3-2-1-1 ژن BMPR1B.. 45

3-2-1-2 ژن BMP15. 46

3-2-1-3 ژن GDF9. 47

3-3 كشت باكتری های حاوی كلون های BAC و استخراج DNA.. 48

3-4 نشاندارسازی DNA استخراج شده از كلون های BAC.. 51

3-5 تهیه كاریوتایپ گاو، گاومیش رودخانه ای، گوسفند و بز. 51

3-6 هیبریداسیون در محل فلورسنتی (FISH) 51

3-7 مراحل بعد از FISH.. 52

3-7-1 آشكار سازی سیگنال های FITC.. 53

3-7-2 RBPI- باندینگ… 53

3-8 بررسی میكروسكوپی اسلایدها و ردیابی سیگنال های FITC.. 53

3-9 تعیین محل دقیق (باند كروموزومی) ژن های مورد مطالعه روی كروموزوم ها 54

فصل چهارم. 55

نتایج.. 55

4- نتایج.. 56

4-1 كیفیت DNA استخراج شده از كلون های BAC.. 56

4-2 نتایج حاصل از كشت سلولی و كاریوتایپ های تهیه شده برای گاو، گاو میش رودخانه ای، گوسفند و بز با روش RBA- باندینگ 56

) 56

) 56

) 56

) 57

4-3 جایگاه فیزیكی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 با استفاده از تكنیك FISH روی كروموزوم های RBPI- باندینگ گونه های مورد مطالعه. 57

) 57

) 57

) 57

) 58

4-4 مقایسه جایگاه فیزیكی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در گاو، گاو میش رودخانه ای، گوسفند و بز با انسان. 58

فصل پنجم. 96

بحث و نتیجه گیری.. 96

5- بحث.. 97

5-1 نقشه های ژنتیکی.. 97

5-2 تفاوت های نقشه های فیزیكی و لینكاژی.. 98

5-3 ژنومیکس مقایسه ای.. 99

5-4 نتیجه گیری نهایی.. 103

5-5 پیشنهادات.. 103

واژه نامه. 104

منابع و مآخذ. 106

Abstract 121

فهرست جداول

جدول 3-1. مواد استفاده شده در كشت سلول های لنفوسیت خون در پژوهش حاضر. 43

جدول 3-2. مشخصات كتابخانه BAC ژنوم گاوی موسسه INRA فرانسه. 44

جدول 3-3. مشخصات كامل كلون های BAC استفاده شده در پژوهش حاضر.44

جدول 3-4. تركیبات محلول های P1، P2 و P3 استفاده شده در استخراج DNA.. 50

جدول 4-1. جایگاه های ژنی نقشه یابی شده، کلون های BAC شناسایی شده

فهرست شکل ها

شکل 2-1. مقایسه ایمونوفلوروسنس مستقیم و غیر مستقیم. 22

شکل 3-1. اطلاعات كلون BtINRA-152G11استفاده شده به عنوان پروب در مكان یابی ژن BMPR1B.. 45

شکل 3-2. اطلاعات كلون BtINRA-745D07 استفاده شده به عنوان پروب در مكان یابی ژن BMPR1B. 46

شکل 3-3. اطلاعات كلون BtINRA-320H10 استفاده شده به عنوان پروب در مكان یابی ژن BMP15. 47

شکل 3-4. اطلاعات كلون BtINRA-748C10 استفاده شده به عنوان پروب در مكان یابی ژن BMP15. 48

شکل 3-5. اطلاعات كلون BtINRA-544F11 استفاده شده به عنوان پروب در مكان یابی ژن GDF9. 49

شکل 3-6. اطلاعات كلون BtINRA-444D9 استفاده شده به عنوان پروب در مكان یابی ژن GDF9. 50

شکل 3-7. مراحل نشاندار سازی DNA با روش Nick Translation. 52

شکل 4-1. نتایج حاصل از استخراج DNA از كلون های BAC استفاده شده در پژوهش حاضر. 60

شکل 4-2. كاریوتایپ RBA- باندینگ تهیه شده برای گاو (BTA) در پژوهش حاضر. 61

شکل 4-3. آیدیوگرام های G- باندینگ (چپ) و R- باندینگ (راست) گاو 62

شکل 4-4. كاریوتایپ RBA- باندینگ تهیه شده برای گاومیش رودخانه ای (BBU) در پژوهش حاضر. 63

شکل 4-5. آیدیوگرام های G- باندینگ (چپ) و R- باندینگ (راست) گاو میش رودخانه ای.. 64

شکل 4-6. كاریوتایپ RBA- باندینگ تهیه شده برای گوسفند (OAR) در پژوهش حاضر. 65

شکل 4-7. آیدیوگرام های G- باندینگ (چپ) و R- باندینگ (راست) گوسفند. 66

شکل 4-8. كاریوتایپ RBA- باندینگ تهیه شده برای بز (CHI) در پژوهش حاضر. 67

شکل 4-9. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMPR1B با استفاده ازتکنیک FISHو کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاو (BTA). 68

شکل 4-10. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMPR1B روی كروموزوم شماره 6 گاو (BTA) 69

شکل 4-11. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMP15 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاو (BTA). 70

شکل 4-12. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMP15 روی كروموزوم X گاو (BTA) 71

شکل 4-13. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن GDF9 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاو (BTA). 72

شکل 4-14. موقعیت دقیق کروموزومی ژن GDF9 روی كروموزوم شماره 7 گاو (BTA) 73

شکل 4-15. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMPR1B با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاومیش رودخانه ای (BBU). 74

شکل 4-16. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMPR1B روی كروموزوم شماره 7 گاو میش رودخانه ای (BBU) 75

شکل 4-17. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMP15 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاومیش (BBU). 76

شکل 4-18. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMP15 روی كروموزوم X گاو میش رودخانه ای (BBU) 77

شکل 4-19. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن GDF9 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاومیش (BBU). 78

شکل 4-20. موقعیت دقیق کروموزومی ژن GDF9 روی كروموزوم شماره 9 گاو میش رودخانه ای (BBU) 79

شکل 4-21. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMPR1B با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گوسفند (OAR). 80

شکل 4-22. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMPR1B روی كروموزوم شماره 6 گوسفند (OAR) 81

شکل 4-23. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMP15 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گوسفند (OAR). 82

شکل 4-24. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMP15 روی كروموزوم X گوسفند (OAR) 83

شکل 4-25. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن GDF9 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گوسفند (OAR). 84

شکل 4-26. موقعیت دقیق کروموزومی ژن GDF9 روی كروموزوم شماره 5 گوسفند (OAR) 85

شکل 4-27. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMPR1B با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در بز (CHI). 86

شکل 4-28. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMPR1B روی كروموزوم شماره 6 بز (CHI) 87

شکل 4-29. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMP15 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در بز (CHI). 88

شکل 4-30. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMP15 روی كروموزوم شماره X بز (CHI) 89

شکل 4-31. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن GDF9 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در بز (CHI). 90

شکل 4-32. موقعیت دقیق کروموزومی ژن GDF9 روی كروموزوم شماره 7 بز (CHI) 91

شکل 4-33. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاو (BTA)، گاومیش رودخانه ای (BBU)، گوسفند (OAR) و بز (CHI). 92

شکل 4-34. جایگاه فیزیکی ژن BMPR1B روی کروموزوم های R-باندینگ در گاو (BTA)، گاومیش رودخانه ای (BBU)، گوسفند (OAR) و بز (CHI) و مقایسه آن با انسان (HSA). 93

شکل 4-35. جایگاه فیزیکی ژن BMP15 روی کروموزوم های R-باندینگ در گاو (BTA)، گاومیش رودخانه ای (BBU)، گوسفند (OAR) و بز (CHI) و مقایسه آن با انسان (HSA). 94

شکل 4-36. جایگاه فیزیکی ژن GDF9 روی کروموزوم های R-باندینگ در گاو (BTA)، گاومیش رودخانه ای (BBU)، گوسفند (OAR) و بز (CHI) و مقایسه آن با انسان (HSA). 95

چکیده

آلومتری………………………………………………………………………………………………………………. 20

1-18- کاربرد آنالیزهای آلومتری شکل و ریخت سنجی هندسی…………………………………………… 23

1-19- شبکه تغییرات شکلی…………………………………………………………………………………………… 23

فهرست مطالب

عنوان صفحه

فصل دوم: مروری بر منابع

2-1- مطالعات انجام شده………………………………………………………………………………………………… 27

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1- نمونه برداری…………………………………………………………………………………………………………. 35

3-2-آماده سازینمونه هابرایآنالیزهایریخت سنجی…………………………………………………………………. 36

3-3- ریخت سنجی هندسی……………………………………………………………………………………………… 36

3-4- رشد آلومتری…………………………………………………………………………………………………………. 37

3-5- آلومتری چند متغیره……………………………………………………………………………………………….. 38

3-6- آنالیز CVA………………………………………………………………………………………………………….. 38

فصل چهارم: نتایج

4-1-نتایج بررسی های ریخت ظاهری ماهی……………………………………………………………………….. 43

4-2-آلومتری رشد………………………………………………………………………………………………………….. 46

4-3- آزمون کلاستر یا پراکندگی………………………………………………………………………………………. 58

4-4-ریخت سنجی هندسی……………………………………………………………………………………………….. 60

فصل پنجم: بحث

5-1- آلومتری رشد…………………………………………………………………………………………………………. 72

5-2- ضرایب رشد………………………………………………………………………………………………………….. 74

5-3- ریخت سنجی هندسی……………………………………………………………………………………………… 75

منابع……………………………………………………………………………………………………………………………….. 81

فهرست جدول ها

عنوان صفحه

جدول1-1- اصطلاحات کلیدی و مترادف آنها…………………………………………………………………… 18

جدول3-1- سن، بیومتری و تعداد نمونه های جمع آوری شده……………………………………………… 39

جدول 4-1- ضرایب رشد (طول پوزه، طول سر، طول تنه، طول دم، قطر، ارتفاع بدنماهی کلمه قبل و بعد از نقطه عطف 56

جدول 4-2- ضرایب رشد (طول پوزه، طول سر، طول تنه، طول دم، قطر چشم، ارتفاع بدن ماهی کلمه قبل و بعد از جذب کیسه زرده………………………………………………………………………………………………………………………………………. 56

جدول 4-3- ضریب رشد طول پوزه، طول سر، طول تنه، طول دم، قطر چشم، ارتفاع بدن…….. 57

جدول 4-4- ضرایب رشد الگوی آلومتری چند متغیره……………………………………………………….. 58

فهرست شكل ها

عنوان صفحه

شكل 1-1- مراحل مختلف حذف تفاوت ها در شکل………………………………………………………….. 14

شکل 3-1- ترتیب لندمارک گذاری در پیکره 9 لندمارکی…………………………………………………… 37

شکل 4-1- طول کل در مراحل تمایز پس از تفریخ ماهی کلمه……………………………………………. 46

شکل 4-2- روند تغییرات ضرایب رشد قسمت های مختلف بدن…………………………………………. 54

شکل 4-3- زمان نقاط عطف ضرایب رشد ماهی کلمه………………………………………………………… 55

شکل 4-4- طول کل مربوط به نقاط عطف ضرایب رشد ماهی کلمه…………………………………….. 55

شکل 4-5- طرح­های استخراجی از TPS Spline با توجه به Consensus مختصات پیکره­ی نه لندمارکی 67
شکل 4-6- تصاویر ماهی کلمه به ترتیب ازa تا e روز تفریخ، سه روز، سی روز، چهل و یک، و هشتاد روز پس از تفریخ 68

فهرست نمودار ها

عنوان صفحه

نمودار4-1- ارتباط بین طول کل و وزن ماهی کلمه…………………………………………………………….. 47

نمودار4-2- روند تغییرات طول سر نسبت به طول کل ماهی کلمه……………………………………….. 48

نمودار 4-3- روند تغییرات طول تنه نسبت به طول کل ماهی کلمه………………………………………. 49

نمودار 4-4- روند تغییرات طول پوزه نسبت به طول کل ماهی کلمه نمودار…………………………. 50

نمودار 4-5- روند تغییرات طول دم نسبت به طول کل ماهی کلمه………………………………………. 51

1-8-4- باکتریوسین­ها 17

1-8-5- دی­اکسید­کربن 18

1-8-6- دی­استیل 18

1-9- رنگ سوسیس تخمیری 19

1-10- فواید غذاهای تخمیری 19

1-11- فرضیات پژوهش 20

1-12- اهداف پژوهش 20

فصل دوم:بررسی منابع

مروری بر تحقیقات انجام شده 22

فصل سوم : مواد و روش ها

3-1- تهیه فیله ماهی 28

3-2- آماده سازی باکتری­ها 28

3-3- تهیه سوسیس ماهی 28

3-4- آنالیز میکروبی 29

3-5- اندازه­گیری pH 29

3-6- اندازه­گیری درصد پروتئین 30

3-7- اندازه­گیری چربی 31

3-8- اندازه­گیری درصد رطوبت 31

3-9- اندازه­گیری خاکستر 32

3-10- اندازه­گیری ظرفیت نگهداری آب (Whc) 32

3-11- سنجش مجموع بازهای نیتروژنی فرار (TVB-N) 33

3-12- اندازه­گیری مقدار پپتید های محلول 33

3-13- آنالیز پروفیل بافت TPA 34

3-14- اندازه­گیری رنگ 34

3-15- آنالیز آماری 35

فصل چهارم: نتایج

4-1- آنالیز تقریبی 37

4-2- نتایج pH 38

4-3- مقادیر مجموع بازهای نیتروژنی فرار (TVB-N) 39

4-4- پپتید های محلول – TCA 40

4-5- نتایج آزمایشات میکروبی 41

4-5-1- شمارش جمعیت باکتری­های اسید لاکتیک (LAB) سوسیس تخمیری ماهی 41

4-5-2- مقادیر کل باکتری­های سودوموناس در سوسیس تخمیری ماهی 42

4-5-3- مقادیر جمعیت انتروباکتریاسه در سوسیس تخمیری ماهی 43

4-5-4- مقادیر کل باکتری­های هوازی و بی هوازی اختیاری 44

4-6- ظرفیت نگهداری آب 45

4-7- آنالیز پروفیل بافت 46

4-8- پارامترهای رنگ 47

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1- آنالیز تقریبی 49

5-2- نتایج pH 49

5-3- مقادیر مجموع بازهای نیتروژنی فرار (TVB-N) 50

5-4- پپتید­های محلول –TCA 51

5-5- نتایج آزمایشی میکروبی 52

5-5-1- شمارش جمعیت باکتری­های اسید لاکتیک (LAB) سوسیس تخمیری ماهی 52

5-5-2- مقادیر کل جمعیت باکتری­های سودوموناس در سوسیس تخمیری ماهی 53

5-5-3- مقادیر جمعیت انتروباکتریاسه در سوسیس تخمیری ماهی 54

5-5-4- مقادیر کل باکتری­های هوازی و بی­هوازی اختیاری در سوسیس تخمیری ماهی 55

5-6- نتایج آنالیز پروفیل بافت 55

5-7- ظرفیت نگهداری آب 56

5-8- پارامترهای رنگ 57

5-9- نتیجه­گیری 59

5-10- پیشنهادات 60

منابع و مآخذ 62

فهرست جداول

عنوانشماره صفحه

جدول 1-1- مهمترین محصولات تولید شده از تخمیر کربوهیدرات ها به وسیله باکتری­های

موجود در فرآورده های عمل آوری شده9

جدول 1-2- سیستم های تاثیر میکروارگانیسم­ها بر پروتئین محصولات گوشتی 14

جدول 1-3- پتانسیل سوسیس تخمیری 19

جدول 4-1- آنالیز تقریبی سوسیس تخمیری ماهی در دو گروه شاهد و تلقیح شده 37

جدول 4-2- تغییرات pH سوسیس تخمیری ماهی در دو گروه شاهد و تلقیح شده 38

جدول 4-3- نتایج سنجش مقادیر مجموع بازهای نیتروژنی فرار (TVB-N) سوسیس تخمیری

شاهد و تلقیح شده با کشت ترکیبی 39

جدول 4-5- تغییرات پپتید­های محلول – TCA در سوسیس­های شاهد و تلقیح شده با

کشت ترکیبی 40

جدول 4-6 – تغییرات ظرفیت نگهداری آب در سوسیس­های شاهد و تلقیح شده با

کشت ترکیبی 45

جدول 4-7- تغییرات پارامترهای بافت در سوسیس­های شاهد و تلقیح­شده با کشت ترکیبی 46

جدول4-8- نتایج مربوط به سنجش رنگ سوسیس تخمیری شاهد و تلقیح شده با کشت

ترکیبی 47

فهرست اشکال

عنوان شماره صفحه

شکل 1-1: مسیر­های اصلی متابولیک برای تولید اسید لاکتیک توسط باکتری­های تولید کننده

اسید لاکتیک 10

شکل4-1: تغییرات باکتری های اسید لاکتیک (LAB)در دو گروه شاهد (Control) و تلقیح

شده با کشت ترکیبی (Mix) در بازه ی زمانی 48 ساعت 41

شکل4-2:تغییرات باکتری­های سودوموناس در دو گروه شاهد(Control) و تلقیح­شده با

کشت ترکیبی(Mix) در بازه ی زمانی 48 ساعت 42

شکل4-3:تغییرات باکتری­های انتروباکتریاسه در دو گروه شاهد (Control) و تلقیح شده با

کشت ترکیبی(Mix) در بازه زمانی 48 ساعت 43

شکل4-4:تغییرات باکتری های هوازی و بی هوازی اختیاری در دو گروه شاهد (Control)

و تلقیح­شده با کشت ترکیبی(Mix) در بازه زمانی 48 ساعت 44

چکیده: