CSF)…………………………………………………………………………………….13

ژن gcsf………………………………………………………………………………………………………………………….13

پروتئین GCSF………………………………………………………………………………………………………………..13

عملکرد پروتئین GCSF…………………………………………………………………………………………………….14

فصل دوم مواد و روش ها

میکروارگانیسم های مورد استفاده………………………………………………………………………………………..17

محیط های کشت مورد نیاز………………………………………………………………………………………………..17

پلاسمیدهای مورد استفاده…………………………………………………………………………………………………..18

آنزیم ها و کیت ها……………………………………………………………………………………………………………18

آنتی بیوتیک ها…………………………………………………………………………………………………………………18

الکتروفورز افقی محصول PCR و یا نمونه DNA بر روی ژل آگارز………………………………………….19

تخلیص محصول هضم آنزیمی با استفاده از کیت تخلیص از ژل آگارز……………………………………..19

واکنش لیگاسیون قطعات تخلیص شده…………………………………………………………………………………20

تهیه سلول های مستعد ‘E. coli TOP10F به روش تیمار با کلرید کلسیم…………………………………..20

انتقال پلاسمید به سلول های مستعد……………………………………………………………………………………..21

بررسی کلونهای نوترکیب به روش سریع………………………………………………………………………………21

PCR بر روی کلنی های باکتریایی/مخمری…………………………………………………………………………..22

استخراج پلاسمید در مقیاس کم………………………………………………………………………………………….22

استخراج پلاسمید در مقیاس زیاد………………………………………………………………………………………..23

الکتروفورز پروتئین بر روی ژل پلی اکریل آمید(SDS-PAGE)………………………………………………..24

سنتز ژن gcsf…………………………………………………………………………………………………………………..29

PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf……………………………………………………………………………………….30

کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا………………………………………………………………………31

هضم آنزیمی وکتور pGH-gcsf………………………………………………………………………………………….32

هضم آنزیمی وکتوربیانی pHan…………………………………………………………………………………………33

کلون نمودن قطعه gcsf در وکتور بیانی pHan………………………………………………………………………33

بررسی کلون های نوترکیب pHan-gcsf……………………………………………………………………………….34

هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf…………………………………………………………………………………………35

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf……………………………………………..35

PCR اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین……………………………………………………………………35

کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy………………………………………………….37

بررسی کلون های نوترکیب pGEM-zeo……………………………………………………………………………..38

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf………………………………………………39

هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf و pGEM-zeo……………………………………………………………………39

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی تیمار شده با آلکالین فسفاتاز pHan-gcsf………40

بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin………………………………………………………………………41

انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا…………………………………41

هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin………………………………………………………………………41

الکتروپوریشن سلول های هانسونلا پلی مورفا………………………………………………………………………..42

تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony PCR اختصاصی ژن زئوسین………………………..43

بیان پروتئینGCSF در هانسونلا پلی مورفا…………………………………………………………………………..44

کشت سلولهای مخمری……………………………………………………………………………………………………..44

بررسی بیان پروتئین نوترکیب با روش SDS-PAGE………………………………………………………………44

تزریق نمونه پروتئینی به خرگوش………………………………………………………………………………………..45

ایمونوبلاتینگ…………………………………………………………………………………………………………………..46

فصل سوم نتایج

سنتز ژن gcsf…………………………………………………………………………………………………………………..49

PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf………………………………………………………………………………………49

طراحی پرایمر های اختصاصی ژن gcsf……………………………………………………………………………….49

بهینه سازی واکنش PCR برای ژن gcsf……………………………………………………………………………….50

کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا………………………………………………………………………51

هضم آنزیمی وکتور کلونینگ pGH-gcsf و وکتور بیانی pHan……………………………………………….51

بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf…………………………………………………………………………………52

بررسی کلونها به روش سریع……………………………………………………………………………………………..52

انجام PCR ژن gcsf بر روی پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf……………………………………………………52

هضم آنزیمی وکتور تأیید شده pHan-gcsf…………………………………………………………………………..53

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf……………………………………………..54

PCR اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین (Sh ble)…………………………………………………….54

کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy………………………………………………….55

تأیید کلون های نوترکیب pGEM-zeocin……………………………………………………………………………55

بررسی سریع کلونهای نوترکیب…………………………………………………………………………………………..55

هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب pGEM-zeo با BglII……………………………………………………………56

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf………………………………………………57

بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin……………………………………………………………………57

بررسی سریع کلونهای نوترکیب…………………………………………………………………………………………..57

بررسی کلونها به روش Colony-PCR…………………………………………………………………………………58

برش آنزیمی وکتور نوترکیب pHan-gcsf-zeo………………………………………………………………………58

انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا…………………………………59

هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin و انتقال به سلول هانسونلا………………………………….59

تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony-PCR ژن زئوسین……………………………………….59

بیان پروتئینGCSF در هانسونلا پلی مورفا………………………………………………………………………….60

تأیید پروتئین نوترکیب تولید شده با روش Immuno-Blotting……………………………………………….61

فصل چهارم :بحث و پیشنهادات

رویکرد کلی پژوهش…………………………………………………………………………………………………………63

فصل پنجم : منابع و پیوست

فهرست منابع و مواخذ……………………………………………………………………………………………………….66

پیوست ها…………………………………………………………………………………………………………………………75

مقدمه

تولید پروتئین های نوترکیب یک بازار میلیارد دلاری دارا می باشد. از طرف دیگر تولید یک محصول نوترکیب جدید با انتخاب یک میزبان مناسب شروع می شود. در میان سیستم های بیانی مختلف، سلولهای مخمری به عنوان تک سلولی های تولید کننده با ویژگی دستکاری های ژنتیکی ساده و داشتن مسیرهای ترشحی اختصاصی که در تولید پروتئین کامل و فعال و انتقال آن به خارج از سلول مؤثر می باشند، یکی از بهترین انواع سیستم های شناخته شده می باشند. ساکارومیسس سرویزیه، پیکیا پاستوریس و هانسونلا پلی مورفا در اکثر مطالعات به عنوان سلولهای مخمری میزبانی مورد استفاده قرار گرفته اند که دارای مسیر مشترک بیوشیمیایی در متابولیسم متانول می باشند. در حال حاضر تکنولوژی هانسونلا به دلیل میزان بیان بالا مورد توجه جهانی قرار گرفته است. از جمله اقلام دارویی تولید شده در این سلولها میتوان به واکسن هپاتیت B، انسولین و اینترفرون آلفا و بتا اشاره نمود.

هدف از این مطالعه ، استفاده از وکتور بیانی طراحی شده جهت بیان فاکتور رشد کلنی گرانولوسیتی (GCSF) نوترکیب به عنوان پروتئین کاندید می باشد.

مواد و روش ها

cDNA کد کننده ژن فاکتور محرک رشد کلونی گرانولوسیتی در وکتور بیانی طراحی شده مربوط به هانسونلا پلی مورفا که شامل پروموتر، توالی سیگنال پپتید، توالی خاتمه دهنده رونویسی و شاخص انتخابی اوکسوتروفی می باشد کلون گردید و بدین ترتیب وکتور بیانی مورد نظر ساخته شد. هضم های آنزیمی به منظور تأیید قطعات کلون شده در وکتور بیانی طراحی شده انجام شد. القاء بیان پروتئین نوترکیب در این سیستم با متانول صورت گرفت و ایمونوبلاتینگ جهت تأیید پروتئین تولید شده نوترکیب صورت گرفت.

نتایج

ماهیت توالیهای کلون شده در وکتور بیانی از طریق هضم های آنزیمی با استفاده از سایتهای طراحی شده در توالی سنتز شده و مشاهده قطعات مورد نظر در ژل آگارز ارزیابی شد. وکتور نوترکیب به فرم خطی با روش الکتروپوریشن به سلول مستعد هانسونلا پلی مورفا انتقال داده شد و القاء بیان پروتئین با متانول صورت پذیرفت. پروتئینی حدوداً 20 کیلو دالتونی بر روی ژل SDS-PAGE مشاهده گردید که با ایمونوبلاتینگ پروتئین تولید شده به عنوان GCSF تأیید شد.

بحث

پروتئین تولید شده با روش بلاتینگ تأیید گردید. در ادامه بایستی عملکرد این پروتئین در واکنشهای ایمونولوژیکی مورد بررسی قرار گیرد. از طرف دیگر عملکرد این پروتئین در مقایسه با فرم تولید شده در E. coli مقایسه شود.

کلید واژه ها

هانسونلا پلی مورفا، فاکتور محرک رشد کلونی گرانولوسیتی (GCSF)، مهندسی ژنتیک

فصل اول : مقدمه

در طول چند دهه اخیر به سه دلیل زیر مطالعات زیادی بر روی مخمر هانسونلا پلی مورفا صورت گرفته است:

1. رشد سریع این مخمر با مصرف متانول به عنوان تنها منبع کربن و انرژی،