1-5 مکانیسم ایجاد تنوع در طول توالی‏های تکراری……………………………. 16

1-5-1 کراسینگ اور نابرابر…………………………………………… 17

1-5-2 عدم جفت شدن ناشی از سرخوردنDNA در طول رشته (خطاهای همانند سازی)…….17

1-6 دامنه تنوع واحدهای تکرارشونده………………………………………….. 19

1-6-1 مدل جهش گام به گام…………………………………………… 19

1-6-2 مدل آللی نا‏محدود…………………………………………… 19

1-7 مارکرهای STR…………………………………………….

1-8 کاربرد مارکرهای STR…………………………………………….

1-8-1 مطالعات شجره‏ای و روابط فامیلی……………………………………………. 20

1-8-2 شناسایی هویت قربانیان حوادث……………………………………………. 21

1-8-3 تعیین هویت در موارد جنایی……………………………………………. 22

1-8-3-1 شناسایی افراد مجهول الهویه…………………………………………… 22

1-8-3-2 ردیابی مجرمین……………………………………………. 22

1-8-4 ردیابی تاریخ بشر و مطالعات جمعیتی……………………………………. 23

1-9 سایر کاربردهای مارکرهای STR…………………………………………….

1-9-1 جمع آوری سلول های جنینی از خون مادر……………………………… 25

1-9-2 نقشه‏ی ژنوم بیماری‏ها………………………………………….. 26

1-9-3 تعیین هویت افراد استفاده کننده از سرنگ مشترک………………………. 26

1-9-4 تشخیص کلون‏های موفق……………………………………………. 26

1-9-5 بررسی و نظارت روی پیوند عضو…………………………………………… 26

1-9-6 تشخیص کایمرهای ژنتیکی……………………………………………. 26

1-9-7 مشخص نمودن خطوط سلولی……………………………………………. 27

1-9-8 تشخیص تومورهای سرطانی……………………………………………. 27

1-10 روش‏های کلی شناسایی هویت افراد در سطح مولکولی……………………. 27

1-10-1 روش انگشت نگاری ژنتیکی از طریق هیبرید کردن با DNA جستجوگر………. 27

1-10-1-1 محدودیت‏های روش انگشت نگاری……………………………………………. 29

1-10-2 روش پروفایلینگ…………………………………………….. 29

1-11 تاریخچه استفاده از مارکرهایSTR…………………………………………….

1-12 CODIS چیست؟…………………………………………… 31

1-13 کیت مورد استفاده در تعیین هویت……………………………………………. 32

1-14 معرفی استان‏ها………………………………………….. 34

1-14-1 استان کرمانشاه………………………………………….. 34

1-14-1-1 موقعیت جغرافیایی……………………………………………. 34

1-14-2 استان یَزد…………………………………………… 35

1-14-2-1 موقعیت جغرافیایی……………………………………………. 36

1-15 هدف از تحقیق………………………………………….. 37

فصل دوم…………………………………………… 38

2-1 نمونه گیری……………………………………………. 39

2-2 استخراج DNA به روش نمک اشباع…………………………………………… 39

2-3 آماده سازی نمونه ها جهت انجام تست DNA Typing…………………………..

۲-3-1 رسوب گذاری با اتانول…………………………………………… 41

2-3-2 تعیین غلظت نمونه های DNA توسط دستگاه Nanodrop……………………

2-3-3 تهیه ی Working Stoke……………………………………………

2-4 تست DNA Typing……………………………………………

2-4-1 Multiplex PCR…………………………………………….

2-5 مواد و تجهیزات مورد نیاز در DNA Typing…………………………………..

2-5-1 آزمایش DNA Typing……………………………………………

2-5-2 جداسازی قطعات……………………………………………. 45

2-5-2-1 تجهیزات لازم…………………………………………… 45

2-5-2-2 آماده سازی دستگاه جهت جداسازی قطعات………………….. 46

2-5-2-3 روش جداسازی قطعات……………………………………………. 46

2-6 آنالیز داده ها………………………………………….. 47

3-1 نمونه ‏ها………………………………………….. 53

3-2 پروفایل ژنتیکی……………………………………………. 53

3-2 نتایج حاصل از آنالیز نمونه‏ ها …………………………………………..55

3-3 نتایج حاصل از آنالیز نمونه‏های کرمانشاه…………………………………. 56

3-4 نتایج حاصل از آنالیز نمونه های یزد…………………………………………… 60

فصل چهارم…………………………………………… 65

4-1 بحث……………………………………………. 66

4-2 نتیجه ‏گیری……………………………………………. 73

4-3 پیشنهادات……………………………………………. 73

منابع انگلیسی……………………………………………. 74

منابع فارسی……………………………………………75

چکیده:

بررسی تنوع ژنتیکی در جمعیت‏ها با استفاده ار تعیین فراوانی آللی و پارامترهای ژنتیکی روش نوینی است که در سال‏های گذشته در بسیاری از جمعیت‏های جهان صورت گرفته و با استفاده از آن شباهت بسیاری از جمعیت‏ها به یکدیگر مشخص گردیده. شباهت جمعیت‏ها نشان دهنده‏ی همسان بودن خزانه‏ی ژنتیکی آنها و احتمالا یکسان بودن آن جمعیت‏ها در گذشته است. پس این احتمال وجود دارد که این جمعیت‏ها در گذشته یک جمعیت بوده باشند و بعد‏ها به دلایل جغرافیایی و یا مهاجرت‏ها از یکدیگر جدا شده باشند. یکی از راه‏های بررسی تنوع ژنتیکی در جمعیت‏ها استفاده از توالی‏های کوتاه تکراری می‏باشد .هدف این مطالعه بررسی تنوع ژنتیکی در دو قوم یزد و کرد (کرمانشاه) از ایران بود. بدین منظور پروفایل ژنتیکی پنجاه فرد غیر خویشاوند از هر یک از جمعیت‏های کرمانشاه و یزد با استفاده از کیت ABIتهیه شد. این کیت حاوی پانزده جایگاه D8S1179،D21S11 ، D7S820،CSF ،D3S1358 ،TH01 ، D13S317، D16S539،D2S1338 ، D19S433، VWA، TPOX،D18S51 ، D5S818،FGA ،VWA ، TPOX و TH01 و ژن آمیلوژنین (برای تعیین جنسیت افراد) می‏باشد. نتایج نشان دادند که به جز دو جایگاه D7S820 وD19S433 در جمعیت کرمانشاه و سه جایگاه D21S11 ,D19S433 و VWA در یزد سایر جایگاه‏ها در تعادل هاردی‏واینبرگ بودند. همچنین پارامترهای پزشکی قانونی شامل PIC,PD,PE,MP در این مطالعه بررسی شدند. سپس دو جمعیت با جمعیت‏های کشورهای همسایه مقایسه شدند. این مطالعه نشان داد که این جایگاه‏ها، جایگاه‏های مناسب برای استفاده در تست‏های تعیین هویت و مطالعات جمعیتی می‏باشند. در نتیجه‏‏ی مقایسات هم دیده شد که هر دو جمعیت یزد و کرمانشاه شباهت زیادی به جمعیت کشور ترکیه داشتند ولی با سایر کشورها متفاوت بودند. از طرفی یزد نسبت به کرمانشاه دارای جمعیت همگن تری بود که این مسئله می‏تواند به علت بکر بودن این جمعیت در طول سالیان مختلف باشد.

فصل اول: مقدمه

1-1- مقدمه

درگذشته مطالعه‏ی تکامل و مهاجرت‏ها از طریق کشف و بررسی بقایای اسکلتی و فسیل‏ها انجام می‏شد. اما از حدود سه دهه‏ی پیش، باستان‏شناسان و زیست‏شناسان با به کار‏گیری آنالیز‏های DNA موفق به کشف‏های بسیار دقیقی شدند که کمک فراوانی به ردیابی تاریخ مهاجرت بشر و تکامل انسان‏ها نموده است. یکی از پر‏کاربرد‏ترین راه‏های آنالیز DNA، بررسی نشان گرهای[1] ژنتیکی افراد است، که از مهم ترین آنها می‏توان به توالی‏های کوتاه تکراری[2] موسوم به STR اشاره کرد. STR‏ها، توالی‏هایی به طول یک تا سیزده نوکلئوتید هستند که در ژنوم موجودات در نواحی غیر کد‏کننده موجود می‏باشند. هر فرد توالی‏های منحصر به فردی دارد و هیچ دو نفری در جهان نیستند که توالی‏های یکسانی داشته باشند. به همین دلیل ازSTR ‏ها می‏توان در مطالعات جمعیتی و بررسی تنوع ژنتیکی در جمعیت‏ها سود جست [1].

علاوه بر مطالعات جمعیتی ازSTR ‏ها می‏توان در موارد تعیین هویت‏، تعیین ابویت، تست‏های پزشکی‏قانونی و سایر موارد استفاده کرد. به طور معمول STRهایی که برای تعیین هویت و مطالعات ژنتیکی جمعیت به کار می‏روند، یکسان هستند و شامل پانزده جایگاه به نام‏های D8S1179،D21S11 ، D7S820،CSF ،D3S1358 ،TH01 ، D13S317، D16S539،D2S1338 ، D19S433، VWA، TPOX،D18S51 ، D5S818،FGA ،VWA ، TPOXو TH01 می‏باشند [1].

هم چنین از روش مشترکی موسوم به تعیین الگوی DNA در این زمینه‏ها استفاده می‏شود. هر فرد دارای الگوی DNA منحصر به فرد است که تا پایان عمر تغییر نخواهد کرد. محققان دریافتند که افراد یک جمعیت در الگوهای ژنتیکی خود دارای تشابهاتی هستند که منحصر به همان جمعیت است و با الگوی افراد جمعیت‏های دیگر متفاوت است. از این تفاوت‏ها می‏توان برای ردیابی تاریخ مهاجرت و تکامل انسان‏ها استفاده نمود (1).

2-1- نشانگر چیست؟

صفاتی را که می‏توانند به عنوان نشانه‏ای برای شناسایی افراد حامل آن صفت مورد استفاده قرار گیرند، نشان گر می‏نامند. مندل نخستین کسی بود که از نشان گرهای ظاهری برای مطالعه چگونگی توارث صفات در نخود فرنگی استفاده کرد. اما گاهی صفات به سادگی و با چشم غیر مسلح قابل مشاهده نیستند، مانند گروه خونی. برای مشاهده چنین صفاتی باید آزمایش‏های خاصی صورت گیرد. به طور کلی هر صفتی که بین افراد متفاوت باشد، ناشی از تفاوت موجود میان محتوای ژنوم آنها می‏باشد. حتی بروز صفات به صورت متفاوت در میان افراد (در شرایط محیطی یکسان)، به علت تفاوت‏ در ژنوم آنها است. این تفاوت‏ها می‏توانند به عنوان نشانه یا نشان گر ژنتیک به کار گرفته شوند. به طور کلی برای آنکه صفتی به عنوان نشان گر ژنتیک مورد استفاده قرار گیرد، باید دست کم دو ویژگی داشته باشد :

1-در بین دو فرد متفاوت باشد (چند شکلی)

2-به توارث برسد (2).

3-1- انواع نشانگرهای ژنتیکی

نشان گرهای ژنتیکی عبارتند از:

1-نشان گرهای مورفولوژیک

2-نشان گرهای پروتئینی

3-نشان گرهای مولکولی در سطح DNA و RNA

1-3-1- نشان گرهای مورفولوژیک

کاربرد نشان گرهای مورفولوژیک به ده‏ها سال پیش از کشف DNA مربوط می‏شود. نشان گرهای مورفولوژیکی که پیامد جهش‏های قابل رویت در مورفولوژی هسته، از ابتدای این سده مورد استفاده قرار گرفتند. صفات مورفولوژیکی که عمدتا توسط یک ژن کنترل می‏شوند، می‏توانند به عنوان نشان گر مورد استفاده قرار گیرند. این نشان گرها شامل دامنه وسیعی از ژن‏های کنترل کننده صفات فنوتیپی هستند و جز نخستین نشان گرها به شمار می آیند و از زمان‏های بسیار دور یعنی از زمانی که محل ژن‏ها روی کروموزوم مشخص شد، مورد استفاده قرار می‏گرفتند (2).

معایب نشان گرهای مورفولوژیک

– اغلب دارای توارث غالب و مغلوب بوده و اثرات اپیستازی و پلیوتروپی دارند.

– تحت تاثیر شرایط محیطی و مرحله رشد موجود قرار می‏گیرند.

– فراوانی و تنوع کمی دارند.

– گاهی برای مشاهده و ثبت آنها باید منتظر ظهور آنها ماند.

– اساس ژنتیک بسیاری از نشان گرهای مورفولوژیک هنوز مشخص نشده است (2).

2-3-1- نشان گرهای پروتئینی