1-3-4-4) اختلالات اکتسابی…………………………. 24

1-3-4-5) ارث………………………….. 24

1-3-5) لجن صفراوی…………………………. 24

1-3-6)سنگ کلسترولی…………………………. 26

1-3-6-1) سنگ های پیگمانی…………………………. 26

تشخیص…………………………… 27

1-3-7) علائم بیماری سنگ کیسه صفرا…………………………. 28

1-3-7-1) سیر طبیعی…………………………. 29

درمان…………………………. 30

1-3-7-2) درمان جراحی…………………………. 30

1-3-7-3) درمان طبی- حل کردن سنگ کیسه صفرا …………………………31

1-3-8) کله سیستیت حاد …………………………32

1-3-8-1) مورفولوژی…………………………. 35

1-3-8-2) خصوصیات بالینی کوله سیستیت حاد …………………………36

1-3-8-3) کله سیستیت بدون سنگ…………………………… 36

1-3-9) کله سیستوپاتی بدون سنگ…………………………… 37

1-3-10) کله سیستیت آمفیزماتو…………………………. 38

1-3-11-1) کله سیستیت مزمن…………………………. 38

1-3-11-2) مرفولوژی…………………………. 40

1-3-11-3) خصوصیات بالینی کوله سیستیت مزمن………………………… 40

1-3-11-4) خصوصیات بالینی تشخیص کوله سیستیت حاد و مزمن………. 40

1-4) اختلالات مجاری صفراوی خارج کبدی………………………….41

1-4-1) کوله دوکولیتاز و کلانژیت صعودی…………………………. 41

1-4-2) آترزی صفراوی خارج کبدی…………………………. 42

1-4-2-1) سیر بالینی…………………………. 43

1-4-3) تومورها………………………… 43

1-4-3-1-1) سرطان کیسه صفرا………………………… 43

1-4-3-1-2)مورفولوژی………………………… 44

1-4-3-1-3) خصوصیات بالینی…………………………. 44

1-4-3-2) کارسینوم مجاری صفراوی خارج کبدی، از جمله آمپول واتر……45

1-4-3-2-1) مورفولوژی…………………………. 45

1-4-3-2-2) خصوصیات بالینی…………………………. 46

فصل دوم: سوابق مربوط………………………….. 49

فصل سوم: مواد و روشها………………………… 65

3-1) چکیده روش تحقیق………………………… 66

3-1-2) جامعة مورد مطالعه………………………… 67

3-1-3) منطقه مورد پژوهش…………………………… 68

3-1-4) روش نمونه گیری…………………………. 72

3-2-1) آماده سازی سنگ صفرا برای استخراج DNA………………

3-2-2) آماده سازی لایه مخاطی کیسه صفرا برای استخراج DNA……..

3-2-3) آماده سازی مایع صفراوی برای استخراج DNA………………….

3-3) روش استخراج DNA به روش کیت سینا ژن…………………….. 75

3-4) واکنش زنجیره ای پلیمرازی…………………………. 76

3-4-1)مواد………………………… 77

3-4-1-1) میكروتیوب ها و نوك سمپلرها………………………… 77

3-4-1-2) محلول بافری PCR با غلظت 5X…………………………..

3-4-1-3) Mgcl_{2…………………………}

3-4-1-4) Kcl …………………………

3-4-1-5) Tris Hcl…………………………

3-4-1-6) مخلوط نوكلئوزیدها (dNTPs) …………………………78

3-4-1-7) Taq DNA polymerase………………………….

3-4-1-7-1) DNA polymerase Smart…………………………

3-4-1-8) پرایمرها …………………………79

3-4-1-9) سایز ماركر…………………………. 80

3-4-1-10) اتیدیوم بروماید…………………………. 81

3-4-1-11) Loading Buffer…………………………

3-4-1-12) ژل آگاروز …………………………81

3-4-2) مواد لازم برای تهیه TBE 1X…………………………..

3-4-2-1) طرز تهیه بافر TBE 1X…………………………..

3-4-3) نرم افزارهای مورد استفاده………………………… 82

3-9) ژل الكتروفورز محصولات PCR…………………………..

3-10) کشت هلیکوباکتر…………………………. 91

3-11-1) بررسی میزان IgG هلیکوباکتر پیلوری در سرم خون……….. 92

3-11-2) شیکر الیزا………………………… 95

3-11-3) شوینده الیزا………………………… 96

3-11-4) خواننده الیزا………………………… 97

3-11-5) مراحل انجام آزمون الیزا که تقریبا در تمام انواع آن مشترک است عبارت است از…98

3-11-6) روش کار با کیت Monobind Anti-H. PyloriIgG…………………………..

3-11-7) مراحل انجام آزمایشH. PyloriIgG…………………………..

فصل چهارم: نتایج………………………….. 102

4-1 ) نتایج مربوط به افراد مورد مطالعه در این پژوهش………………. 103

4-2) نتایج مربوط به حضور ژن hsp60 در بیماران کله سیستیت مزمن……. 114

4-3) نتایج مربوط به حضور ژن hsp60 در بیماران کله سیستیت حاد………. 116

4-4) نتایج مربوط به حضور ژن hsp60 در مایع صفرا گروه شاهد………………. 118

4-5) نتایج مربوط به میزان فراوانی نسبی تست IgG هلیکوباکتر……………. 121

4-6) نتایج مربوط به میزان فراوانی نسبی BMI…………………………

4-7) نتایج مربوط به ژن 16s rRNA هلیکوباکتر بیلیس………………………… 131

4-8) نتایج مربوط به میزان فراوانی نسبی هلیکوباکتر هپاتیکوس…………… 133

4-9) نتایج مربوط به میزان فراوانی نسبی هلیکوباکتر پولوروم…………… 133

4-10) نتایج مربوط به میزان فراوانی نسبی هلیکوباکتر پیلوری، هلیکوباکتر هپاتیکوس، هلیکوباکتر بیلیس و هلیکوباکتر پولوروم در سنگ کیسه صفرا در بیماران کله سیستیت مزمن………………………… 133

4-11) نتایج مربوط به کشت هلیکوباکتر…………………………. 133

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری………………………….. 134

پیشنهادات………………………….. 148

منابع…………………………. 149

چکیده:

زمینه و هدف: سنگ کیسه صفرا یکی از علت های عمده جراحی دستگاه گوارش بوده، علاوه بر این، میزان بیماری های صفراوی و سنگ کیسه صفرا به تدریج رو به افزایش است. اخیرا، نویسندگان متعددی، گزارشاتی مبنی بر حضورDNA هلیکوباکتر پیلوری و هلیکوباکتر های مقاوم به صفرا در درخت صفراوی انسان و کلونیزاسیون در دستگاه صفراوی حیوانات داشته اند. در حال حاضر هدف از این بررسی، طراحی مطالعه مورد-شاهدی برای برسسی حضور گونه های هلیکوباکتر، به خصوص هلیکوباکتر پیلوری، هلیکوباکتر هپاتیکوس، هلیکوباکتر بیلیس و هلیکوباکتر پولوروم، در سنگ، مایع و بافت بیماران مبتلا به بیماری های صفراوی و مایع صفرای بیماران غیر مبتلا به بیماری های صفراوی در بیمارستان الزهرا(س) بوده است.

مواد و روش ها: سرم خون و مایع صفرای 25 بیمار غیر مبتلا به بیماری های صفراوی تحت کلانژیوپانکرانوگراف برگشتی، به عنوان گروه شاهد جمع آوری گردید. سرم خون، مایع، سنگ و بافت کیسه صفرای 52 بیمار تحت کله سیستکتومی لاپراسکوپی، به عنوان گروه مورد جمع آوری گردید؛ از این بین 24 مورد کله سیتیت حاد و 28 مورد کله سیستیت مزمن تشخیص داده شد. هر سه گروه از لحاض ترکیب سن و جنس قابل مقایسه می باشند. در این نمونه ها، حضور هلیکوباکتر پیلوری بوسیله پرایمر اختصاصی ژن hsp60 ، و پرایمر اختصاصی 16s rRNA برای DNA هلیکوباکتر هپاتیکوس، هلیکوباکتر بیلیس و هلیکو باکتر پولوروم بوسیله واکنش های زنجیره ای پلیمرازی مورد ارزیابی قرار گرفت. مایع صفرا در محیط کشت مایع وجامد R (توصیف شده توسط ریچارد و همکاران) کشت داده شد. سرم های خون برای بررسی کمی ایمونوگلوبولین G هلیکوباکتر پیلوری بوسیله تست الیزا مورد ارزیابی گرفت.

نتایج:

21 از 24 (87.5 ٪) بیماران مبتلا به بیماری های کوله سیستیت حاد و 25 از28 مورد (89.2 ٪) در بیماران مبتلا به بیماری های کوله سیستیت مزمن ، و 20 از 25 (80 ٪) نفر در گروه شاهد، نشان دهنده افزایش سطح ایمونوگلوبولین G خاص هلیکوباکتر پیلوری بوده اند.

به ترتیب DNA هلیکوباکتر پیلوری در 6 از 24 (25 ٪) مایع صفرا کوله سیستیت حاد و 2 از 28(7%) مایع صفرا کوله سیستیت و 1 از 24 (4.2 ٪) مخاط کیسه صفرا کوله سیستیت حاد و 1 از 28 (3.5٪) مخاط کیسه صفرا کوله سیستیت مزمن مزمن تشخیص داده شد. DNA هلیکوباکتر bilis در 1از 24(4.2%)مایع صفرا کوله سیستیت حاد، و 1 از 28 (3.5 ٪) مایع صفرا کوله سیستیت مزمن تشخیص داده شد. هیچ گونه هلیکوباکتر از کشت صفرا بدست نیامد. تمامی نمونه های استخراج شده DNA از لحاظ هلیکوباکتر هپاتیکوس و هلیکوباکتر پولوروم منفی می باشد. تمامی DNA های استخراج شده از مایع صفرای گروه کنترل از لحاظ هلیکوباکتر پیلوری، هلیکوباکتر هپاتیکوس، هلیکوباکتر بیلیس و هلیکوباکتر پولوروم منفی بوده اند. تمامی DNA استخراج شده از سنگ صفرا از لحاظ حضور ِDNA هلیکوباکتر منفی بوده ند.

نتیجه گیری:

نتایج این مطالعه نشان دهنده حضور DNA هلیکوباکتر پیلوری و هلیکوباکتر بیلیس در کیسه صفرا بیماران مبتلا به کله سیستیت حاد و مزمن بوده، و ارتباط احتمالی بین DNA هلیکوباکتر یافت شده با بیماری های صفراوی وجود دارد.

فصل اول: کلیات تحقیق

1-1-1- جنس هلیکوباکتر

جنس هلیکوباکتر جزء باکتری های گرم منفی با سرعت رشد بالا در بین میکروارگانیزم های گرم منفی است که توانایی مهاجرت مداوم در بین میزبانان متنوع در پستانداران را دارا می باشد و در برخی موارد ممکن است باعث بیماری سخت بالینی همچون سرطان شود، در این بین بیشترین مطالعه تا کنون بر روی هلیکوباکتر پیلوری[1] صورت گرفته است که عامل ایجاد زخم معده و سرطان معده در انسان می باشد[1]، اهمیت بالینی جنس هلیکوباکتر با توجه به در معرض آلودگی قرار داشتن بیش از نیمی از جمعیت بشری جهان در برابر گونه هلیکوباکتر پیلوری امروزه بسیار روشن بوده،امروزه این جنس به طور رسمی حداقل شامل32 نام گونه می باشد[2]، این جنس را تقریبا می توان به دو گروه هلیکوباکتر های معده ای و هلیکوباکترهای انتروهپاتیک[2] تقسیم کرد[3, 4]. برخی از گونه های هلیکوباکتر معده ای بیشتر از هر میکرو ارگانیسم شناخته شده دیگری دارای فعالیت قوی اوره آزی بوده و از آن برای زنده ماندن و مدیریت فشار وارد شده توسط اسید معده استفاده می کنند[1, 5, 6]. هلیکوباکتر های انتروهپاتیک به طور معمول در مخاط معده کلونیزه نمی شوند ،اما دارای ویژگی های مشابه فراساختاری و فیزیولوژی مشابه ی با گونه های معده ای می باشند، تا به امروز این عوامل باکتریایی در دستگاه گوارشی و کبد انسان ،پستانداران و پرندگان جدا و شناسایی شده اند[4, 7, 8]. در مجموع اطلاعات بدست آمده از مطالعات انجام شده در بیماری های صفراوی ، نشان می دهد که صفرا حاوی گونه هلیکوباکتر، ممکن است عفونت مزمن با دگرگونی بدخیم القاء کنند. این که آیا آنها واقعا در پیدایش بیماری صفراوی شرکت دارند نیاز به مطالعات بیشتر را می طلبد ، با این حال در برخی بررسی ها شواهدی مبنی بر حضور هر دو گروه هلیکوباکتر های معده ای و روده ای در صفرای بیماران صفراوی می باشد[9, 10].

هلیکوباکتر پیلوری، باکتری باسیل گرم منفی مارپیچی[3]، دارای فرم خمیده و میکروائروفیلیک بوده که به عنوان مهمترین پاتوژن معده انسان شناخته شده، وارن و مارشال[4] برای اولین بار این باکتری را در سال 1983 جداسازی و خالص سازی نمودند،[11]، دو فرم مرفولوژیک باسیل مارپیچی و کوکوئید[5] برای این باکتری شناخته شده است، فرم باسیل مارپیچی این باکتری، فرم فعال و قابل کلونیزاسیون این باکتری بوده، فرم کوکوئید در واقع فرم موجود اما غیر قابل کشت این باکتری بوده، و بیشتر به فرم در حال استراحت هلیکوباکتر پیلوری مشهور است[12, 13]، علی رغم اثبات حضور فرم کوکوئید هلیکو باکتر پیلوری، تلاش های بسیار برای کشت آن تا کنون نتیجه مطلوب نداشته است، از این رو این موضوع خود به تنهایی بسیار مورد بحث پژوهشگران بوده ، اعتقاد برخی محققان بر این استوار می باشد که فرم کوکوئید این باکتری فرم مرده بوده،[14, 15]؛ و در مقابل برخی از محققان دیگر اعتقاد داشته که این فرم از باکتری زنده بوده و در حال حاضر امکان کشت آن با تکنیک ها و روش های موجود وجود ندارد[13, 16, 17]. تغییر فرممورفولوژیکاز باسیل مارپیچی به کوکوئید را می توان بوسیله کشت مجدد در محیط کشت با شرایط غذایی ضعیف، کشت همراه با استرس همچون آنتی بیوتیک و اکسیژن، و یا استرس کاهش pH و یا افزایش دما مشاهده کرد[18] . فرم باسیل مارپیچی باکتری هلیکوباکتر پیلوری به نسبت فرم کوکوئید آن مقدار بسیار زیادی از پروتیین های مختلف را بیان می کند، که به عنوان مثال می توان به پروتیین های موثر در تکثیر سلولی و ساختمان سلولی، پروتیین های موثر در اتصال یا چسبنده ها[6] و پروتیین های موثر در کلونیزاسیون باکتری اشاره کرد، اما در فرم کوکوئید، بیان پروتیین ها به طور معنا داری کاهش پیدا کرده و بیشتر به حفاظت از فعالیت های متابولیک باکتری همچون تنفس سلولی، حفظ ساختار کلی سلول و سنتز DNA محدود میگردد[14, 19, 20]. بنابراین به طور گسترده این اعتقاد وجود داشته که فرم کوکوئید این باکتری نقش به سزایی در انتقال و گسترش عفونت با هلیکو باکتر پیلوری یا پاسخ های متفاوت و ناکارامد سلول در برابر عفونت با این باکتری بوده[16, 21-23] و از آن سو نقش عمده فرم باسیل مارپیچی این باکتری در بیماری زایی و بیان عوامل حدت[7] می باشد .

Chunhong Shao و همکارانش برای اولین بار پاسخ هلیکوباکتر پیلوری را به شرایط اسیدی متفاوت مایع صفرای انسان را بررسی نمودند، توانایی تحمل این شرایط برای کلونیزاسیون این باکتری در دستگاه گوارش انسان بسیار با اهمیت است؛ نتایج حاصل از این تحقیق نشان دهنده مسیر های پیچیده پیام دهی برای تحمل این شرایط بوده، نتایج این تحقیق نشان دهنده تغییر در بیان و فرم برخی از پروتیین ها از قبیل چاپرون ها، پروتیین های موثر در جابجایی آهن، آنزیم های موثر در چرخه تولید انرژی، متابولیسم و پروتیین های فلاژلا بوده است.[24]

2-1-1- عوامل حدت هلیکوباکتر پیلوری

اوره آز خودش به تنهایی کموتاکسی فاگوسیت ها را باعث می شود و سلول های ایمنی را فعال می کند و محصولات سیتوتوکسین را افزایش می دهد. اتصال هلیكوباكتر پیلوری به اپتیلیوم معده و ترشح اینترلوكینها یك مرحله مهم در القاء التهاب فعال لایه مخاطی می باشد كه می تواند به تولید زخم منجر شود. سیتوتوكسین واكوئله كنندهA[1] (vac A) به کلنیزه شدن هلیکوباکتر پیلوری در مخاط كمك می كند كه به نظر می رسد نتیجه آن تعدیل سیستم ایمنی میزبان باشد [25]. پلی مرفیسمهای موجود در ژن سایتوكاینها ی میزبان نیز ممكن است كه عامل مهمی در مقدار سایتوكاینها ی تولیدی و در نتیجه تفاوت در الگو و شدت پاسخهای التهابی باشند[26].براساس تنوع ژنتیكی ممكن است كه این پلی مرفیسمها از یك نا حیه جغرافیایی به ناحیه دیگر متفاوت باشند كه می تواند احتمال حضور ژنوتیپهای خاص در جمعیت های مناطق خاص جغرافیایی كه آنها را نسبت به عفونت با سوش هلیكوباكترپیلوری دارای ژن vacA مستعد می سازد را توضیح دهد. در میان عوامل بیماریزای هلیکو باکتر پیلوری،عامل اتصال به سلول های پوششی برای شروع پاسخ التهاب ضروری است.[27, 28] برخی از سویه های هلیکوباکتر پیلوری ،دارای یک ناحیه پاتوژنیسیته 40k bp به نام جزیره بیماریزایی[2] cag هستند که حاوی 31 ژن بوده و تولید و تجمع سیستم ترشحی تیپ IV را هدایت می کند.در مدل های حیوانی سویه هایی که جزیره پاتوژنیسیتی cag را دارند، از سویه های فاقد این جزیره بیماریزا تر می باشند.[29] برخی بررسی ها نشان داده است که سویه های دارای ژن cagA از قدرت بیماریزایی بیشتری برخوردار می باشند[30] ، سویه های cagA مثبت باعث القای سیتوتوکسیتی بیشتری نسبت به سویه های فاقد این ژن می باشند[31] ، سویه های cagA مثبت می توانند باعث تولید IL-8[3] شوند[32] ،همچنین پروتیین CagA یک مولکول ایمونولوژیک می باشد که به عنوان یکی از کاندید های ساخت واکسن علیه باکتری هلیکوباکتر پیلوری مطرح است[33] ، همچنین پروتیین CagA پس از ورود به سلول میزبان باعث تغیرات ساختار اکتین و اختلال در سیکل سلولی ،القای بیان انکوژن های c-fos و c-jun و در نهایت آسیب سلولی می شود و خطر ایجاد سرطان را افزایش می دهد[34]. یكی از مهمترین ملكولهای چسبان در هلیكوباكتر پیلوری پروتئین است كه توسط ژن babA2 کد می شود و Blood group bindin antigen نام دارد، تحقیقات متعددی نشان داده است که این مولکول چسبان، عامل اتصال هلیکوباکتر پیلوری به آنتی ژنهای گروه خونی لوئیس b می باشد.این آنتی ژن های فوکوزیله شده روی سطح سلول های پوششی معده قرار دارند، پروتیین Bab A یکی از پروتیین های غشا خارجی هلیکوباکتر پیلوری است، توانائی اتصال این پروتئین به آنتی ژنهای گروه خونی لوئیس b استقرار باكتری را در معده تسهیل ، و ممكن است مستقیمًا در بیماریزائی نقش داشته باشد[35, 36] ؛ پروتیین Bab A 75 کیلو دالتون وزن دارد،دو آلل ژن bab A شناسایی شده اند که عبارتند از: bab A1 و bab A2 ، از این بین تنها آلل bab A2 فعال بوده و پروتیین Bab A را رمز دهی می نماید. [37] طبق تحقیقات صورت گرفته، مشخص شده است كه بین وجود این ژن و بعضی بیماریهای دستگاه گوارش از جمله زخم اثنی عشر ارتباط وجود دارد. [38-41]