1-6-2-1 مراحل آپوپتوز ………………………………………………………………..19

1-6-2-2 مسیر های آپوپتوز………………………………………………………..21

1-6-2-3- عناصر کلیدی مسیرهای آپوپتوز…………………………………21

1-6-2-4- روش های بررسی آپوپتوز …………………………………………..23

1-6-2-4-1- بررسی تغییرات غشاء پلاسمایی در مرگ سول ……………………23

1-6-2-4-1-1- تعیین فسفاتیدیل سرین سطح بیرونی غشاء سلول………………24

1-6-2-4-2- بررسی سیتوتوکسیسیتی …………………………………………24

1-6-2-4-3- بررسی تغییرات مورفولوژی ………………………………………..25

1-6-2-4-3-1- استفاده از میکروسکوپ الکترونی………………………………25

1-6-2-4-3-2- استفاده از میکروسکوپ نوری وفلورسانس……………………25

1-7- منشاء آسیب DNA اسپرم………………………………………………..26

1-7-1- بسته بندی غیرطبیعی كروماتین…………………………………..27

1-8- ساختار کروماتین اسپرم و تأثیر آن بر ناباروری ………………………..28

1-8-1- بررسی ساختار کروماتین اسپرم………………………………………28

1-9- نقش آپوپتوز در آسیب DNA اسپرم…………………………………..29

1-10- استرس اكسیداتیو به واسطه ROS……………………………………..

1-11- تاثیر عوامل محیطی برسلامت DNA و میزان موفقیت روشهای کمک باروری……..31

1-11-1- مصرف سیگار…………………………………………………………….31

1-11-2- مواجهات شغلی…………………………………………………………..32

1-11-3- داروهای شیمی درمانی و رادیوتراپی……………………………….33

1-11-4- سن……………………………………………………………………..33

1-12- تكنیك­های بررسی ساختار كروماتین……………………………………….33

1-12-1- روش­های تعیین آسیب DNA اسپرم انسان………………………….34

1-12-1-1- تست TUNEL…………………………………………………………..

1-12-1-2- روش DBD-FISH………………………………………………………….

1-12-1-3- روش Comet………………………………………………………

1-12-1-4- رنگ­آمیزی CMA3………………………………………………………..

1-12-1-5- تكنیك SCSA…………………………………………………………..

1-12-1-6- تست SCD……………………………………………………………….

1-12-1-7- رنگ­آمیزی آكریدین اورانژ…………………………………………….39

1-12-1-8- رنگ­­آمیزی تولوئیدین بلو…………………………………………….39

1-13- روش مهاجرت اسپرم…………………………………………………………39

1-14- روش سانتریفیوژ شیب غلظت…………………………………………..40

فصل دوم- مواد و روش ها…………………………………………………………41

2-1- مواد و وسایل مورد نیاز……………………………………………………….42

2-1-1- وسایل مورد نیاز………………………………………………………….42

2-1-2- مواد مورد نیاز…………………………………………………………..42

2-2- ساخت محلول های مورد نیاز…………………………………………….45

2-2-1- ساخت محلول Ham’s F10……………………………………………….

2-2-2- محلول های لازم برای تست پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)………….46

2-2-3- ساخت محلول تانل…………………………………………………………46

2-2-4- ساخت محلول (PBS)…………………………………………………….46

2-2-5- ساخت رنگ ائوزین-نیگروزین………………………………………………….47

2-2-6- ساخت رنگ رایت………………………………………………………………..47

2-3- روشها…………………………………………………………………………….48

2-3-1- روش جمع آوری اسپرم……………………………………………. 48

2-3-2- آنالیز مایع انزالی…………………………………………………………….. 48

2-3-2-1- آزمایشات ماکروسکوپی……………………………………………….48

2-3-2-1-1- ظاهر……………………………………………………………………….48

2-3-2-1-2- آبکی کردن………………………………………………………………..48

2-3-2-1-3- حجم…………………………………………………………………..48

2-3-2-1-4- چسبندگی………………………………………………………….48

2-3-2-2- آزمایشات میکروسکوپی……………………………………………………49

2-3-2-2-1- آگلوتیناسیون………………………………………………………….50

2-3-2-2-2- بررسی تعداد اسپرم………………………………………………………50

2-3-2-2-2-1- روش استفاده از MAKLER CHAMBER برای شمارش …………50

2-3-2-2-3- ارزیابی تحرک……………………………………………………….51

2-3-2-2-3-1- روش کار……………………………………………………………52

2-3-2-2-4- ارزیابی قابلیت حیات………………………………………………….53

2-3-2-2-4-1- روش کار رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین………………………….53

2-3-2-2-5- ارزیابی مورفولوژی…………………………………………………54

2-3-2-2-5-1- رنگ آمیزی پاپانیکولا………………………………………….54

2-3-2-2-5-2- روش فیکس کردن………………………………………………54

2-3-2-2-5-3-روش رنگ آمیزی پاپانیکولا…………………………………….55

2-3-3- Direct swim-up……………………………………………………….

2-3-3-1- روش کار………………………………………………………………….57

2-3-4- تست بررسی میزان پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)…………….58

2-3-4-1- روش کار………………………………………………………………..58

2-3-5- روش رنگ آمیزی تانل……………………………………………………60

2-3-6- آنالیز آماری……………………………………………………………….62

فصل سوم- نتایج……………………………………………………………….63

3-1 نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی تحرک اسپرم…………..64

3-2- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قابلیت حیات اسپرم….67

3-3- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی مورفولوژی اسپرم..68

3-4- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم…70

3-5- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم………..72

3-6- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی آپوپتوز اسپرم….75

3-7- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم………..78

3-8- رابطه میزان آپوپتوز اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم………………………..79

3-9- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با میزان آپوپتوز اسپرم……………80

3-10- نتایج کلی……………………………………………………………………………80

فصل چهارم- بحث………………………………………………………………………….81

4-1- تا ثیر روش آماده سازی Dricct Swim up بر روی پارامترهای اسپرم……………83

4-2- تاثیر زمان های مختلف انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد بر روی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم……84

4-3- پیشنهادات…………………………………………………………………………..90

فصل اول: مقدمه

1-1- روش های کمک باروری

امروزه استفاده از روش های كمك باروری ([1]ART) بهترین گزینه برای رفع مشكلات زوج های نابارور است. میزان موفقیت این روش ها به عوامل متعددی از جمله سلامت كامل تخمك و اسپرم بستگی دارد. در این میان سلامت ژنوم پدری اهمیت زیادی در میزان پتانسیل باروری زوج ها دارد. بنابراین آسیب DNA اسپرم یك اختلال ژنومی است كه به میزان متفاوت در مردان نابارور وجود دارد. از زمانی كه اولین گزارش در مورد آسیب DNA اسپرم منتشر شد مطالعات وسیعی در این زمینه انجام گرفته و مشخص شده كه در افراد دارای میزان بالای آسیب DNA، پارامترهای اسپرمی پایین می آید و قدرت باروری نیزكاهش می یابد.

از سالها پیش، استفاده از جراحی برای رفع نقایص ساختمان دستگاه تولید مثل، استفاده از داروهای باروری برای تحریك تخمك­گذاری و روش IUI[2] (انتقال اسپرم متحرك و شسته شده به رحم) از جمله روش­های رایج درمانی بوده و هستند. لیكن این اقدامات تنها برای گروهی از زوج­های نابارور مؤثر است. این در حالی است كه روش­های جدیدی از جمله IVF [3] و ICSI [4] امروزه به عنوان گزینه­هایی مناسب در درمان سایر زوجین نابارور مطرح است.

میزان موفقیتART به سلامت و بلوغ گامت های زوجین وابسته است . طی لقاح طبیعی و روش لقاح آزمایشگاهیIVF احتمال نفوذ اسپرماتوزوای غیربالغ و ناسالم به داخل تخمك توسط سد زوناپلوسیدا به حداقل می رسد در صورتی كه در روش میكرواینجكشن یا تزریق مستقیم اسپرم به داخل سیتوپلاسم تخمك ICSI این سد وجود نداشته و ایمن بودن روش ICSI همیشه مورد نگرانی بوده است . در ضمن تحقیقات نشان داده است كه انتخاب اسپرم با پارامترهای معمولی (غلظت، مورفولوژی، تحرك ) نمی تواند گویای سلامت DNA اسپرم باشد(EI, MI, López-Fernández, Fernández, & Gosálvez, 2007). به تازگی لوئیس و سیمون (2010) اظهار داشتند که هیچ همبستگی بین پارامتر های معمولی اسپرم و آسیب DNA وجود ندارد(S. E. M. Lewis & Simon, 2010).

یکی از روش های کمک باروری روش تلقیح داخل رحمی (IUI) می باشد. که در این روش مایع انزالی از شوهر گرفته می شود و پس از عمل شستشو و جداسازی ، اسپرم های مرده و بدون تحرک از اسپرم های زنده و دارای تحرک جدا می شوند، سپس اسپرم های زنده و متحرک به وسیله کاتتر توسط متخصص، وارد حفره رحم می گردد.

در آزمایشگاه های ART، بعد از عمل شستشو و جداسازی معمولاَ به بررسی پارامترهای اسپرم که شامل تعداد، میزان تحرک و وضیعت مورفولوژیکی اسپرم و درصد زنده بودن می باشد، می پردازند اما به بررسی پارامترهای درون سلولی که شامل آپوپتوز و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم است پرداخته نمی شود. همچنین در آزمایشگاه های ART معمولاَ انجام روش IUI از 5/0 تا حداکثر 3 ساعت بعد از عمل جداسازی و شستشو اسپرم انجام می دهند و در بعضی از مراکز درمان ناباروری بدون توجه به زمان، عمل تلقیح را انجام می دهند. با توجه به نقش اسپرم در پروسه لقاح در روش IUI، لازم است که علاوه بر توجه به ساختار سلولی اسپرم به بهترین زمان ممکن جهت انجام تزریق اسپرم آماده شده به داخل حفره رحمی توجه شود. لذا با مطالعه ساختار سلولی اسپرم و نیز تعیین زمان دقیق عمل تزریق اسپرم به داخل حفره رحمی می توان میزان لقاح و در نتیجه میزان حاملگی را افزایش داد.

یکی از عواملی که می تواند بر میزان موفقیت درمان زوج های نابارور و همچنین کیفیت گامت ها مهم باشد، کیفیت اسپرم است. در روش IUI بعد از جداسازی اسپرم از مایع منی و آماده سازی اسپرم برای انتقال، می تواند به خاطر انکوباسیون طولانی مدت، قطعه قطعه شدن DNA اسپرم افزایش پیدا کند(Muratori, et al., 2003).

مطالعات بیانگر این مطلب است كه در تخمك های لقاح یافته با اسپرم های دارای آسیب بالای DNA، میزان لانه گزینی و بارداری به طور معنی داری كاهش می یابد . اگرچه ژنوم آسیب دیده پدری، طی رشد جنینی می تواند دستخوش پردازش قرار گیرد، ولی در صورت وجود آسیب های زیاد، احتمال كاهش رشد جنین وجود داشته و اگر میزان نقص ها كمتر باشد، می تواند نقایص بعد از تولد را به همراه داشته باشد. به همین دلیل، در دسته ای از بیماران، نوزادان متولد شده توسط روش ICSI دارای نقص ژنتیكی بیشتری نسبت به نوزادان طبیعی هستند .لازم به ذكر است كه تحقیقات متعدد در این زمینه، نتایج ضد و نقیصی را گزارش كرده اند(Morris, Ilott, Dixon, & Brison, 2002).

تجربیات به دست آمده از روش های كمك باروری نشان می دهد، چنانچه اسپرم با میزان بالایی از آسیب DNA، در روند IVF و ICSI وارد تخمك شود سیستم ترمیمی تخمك ممكن است توانایی ترمیم این آسیب ها را نداشته و در بسیاری از موارد با وجود موفقیت در لقاح، سلول های جنسی توانایی تشكیل جنین یا ادامه تكامل را تا مرحله بعد از 4 تا 8 سلولی كه مصادف با فعال شدن ژنوم است، ندارند . براساس تحقیقات مشخص شده كه توانایی ترمیم تخمك وابسته به سن مادر بوده و تخمك های افراد جوان، از قدرت ترمیم DNA بالایی برخوردارند . به علاوه تحقیقات متعدد در زمینه آسیب DNA بیانگر این هستند كه ارتباط معنی داری بین آسیب DNA و میزان لقاح وجود ندارد ولی بین آسیب DNA اسپرم و تشكیل جنین، بلاستوسیت، رشد جنین و بارداری ارتباط معكوس و معنی داری وجود دارد(Morris, et al., 2002).

پس از آماده سازی اسپرم به طور معمول در 37 درجه سانتی گراد انکوبه می شود تا در ART از آن استفاده شود (Van der Westerlaken, Naaktgeboren, Verburg, Dieben, & Helmerhorst, 2006) ، ولی هنوز زمان بهینه برای انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد قبل از استفاده در ART وجود ندارد. بعضی از محققین سعی برای پیدا کردن اثر گذشت زمان بر پارامترهای اسپرم بعد از انکوبه کردن در دمای 37 درجه سانتی گراد را دارند. اثر انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد نشان داد که بعد از گذشت 24 ساعت می تواند بر روی تحرک و قابلیت حیات اسپرم تاثیر گذار باشد(Calamera, Fernandez, Buffone, Acosta, & Doncel, 2001).

بعد از آماده سازی اسپرم برای استفاده در تکنیک های ART انکوباسیون کوتاه مدت در دمای 37 درجه سانتی گراد می تواند باعث ظرفیت یابی اسپرم شود اما انکوباسیون طولانی مدت می تواند بر روی DNA اسپرم تاثیر داشته باشد(Marı́n-Briggiler, Tezón, Miranda, & Vazquez-Levin, 2002).