هیدروکلراید…………………………………………………………………………………..16

1-7-5-3- میترامایسین………………………………………………………………………………………………………………17

1-7-5-4 بلئومایسین سولفات…………………………………………………………………………………………………….19

1-7-5-5- میتومایسین ها……………………………………………………………………………………………………………21

1-7-5-5-1 میترامایسین C………………………………………………………………………………………………………..22

1-7-5-6- استرپتوزوستین…………………………………………………………………………………………………………22

1-8-سرطان ریه………………………………………………………………………………………………………………………..23

1-8-1- علائم سرطان ریه……………………………………………………………………………………………………….. 26

1-8-2- سرطان در ایران…………………………………………………………………………………………………………… 26

1-9-اکتینومیست ها…………………………………………………………………………………………………………………….28

1-9-1-متابولیت های ثانویه ی اکتینومیست ها………………………………………………………………………………….30

1-10-هدف از پژوهش………………………………………………………………………………………………………………33

فصل دوم: پیشنه ی تحقیق

فصل سوم: مواد و روش­ها

3-1- ترکیبات استفاده شده………………………………………………………………………………………………………….39

3-2- دستگاه های استفاده شده……………………………………………………………………………………………………42

3-3- سویه های اکتینومیست………………………………………………………………………………………………………..43

تولید اسپور باکتری………………………………………………………………………….43

3-5- آماده سازی محیط پیش کشت………………………………………………………………………………………………44

3-6- آماده سازی محیط کشت تخمیر……………………………………………………………………………………………44

3-7- احیا و کشت سویه…………………………………………………………………………………………………………….45

3-8- تهیه پیش کشت……………………………………………………………………………………………………………… 45

3-9- تولید متابولیت ها………………………………………………………………………………………………………………45

3-10- استخراج متابولیت ها………………………………………………………………………………………………………45

3-11- نگهداری عصاره ها………………………………………………………………………………………………………..46

3-12-1- کشت آرتمیا……………………………………………………………………………………………………………..46

3-12-2- آزمون ارزیابی سمیت در آرتمیا…………………………………………………………………………………..47

3-13- غربالگری ثانویه، ارزیابی سمیت در کشت سلولی……………………………………………………………..48

3-13-1- انتخاب دودمان سلولی…………………………………………………………………………………………….. 48

3-13-1-1 محیط کشت………………………………………………………………………………………………………….49

3-13-1-1-1- مراحل تهیه محیط کشت دودمان سلولی A549…………………………………………………..49

3-13-1-1-2-تجدیدکشت دودمان سلولی A549……………………………………………………………………..50

3-13-1-1-3- شمارش سلول ها و بررسی میزان فعالیت سلول…………………………………………………..51

3-13-2- تهیه محلول تریپسین………………………………………………………………………………………………….52

3-14- آزمون MTT………………………………………………………………………………………………………………..53

3-15- شمارش سلول برای انجام آزمونMTT……………………………………………………………………………54

ژوهش……………………………………………………………………….54

3-17- بررسی ریخت شناسی سلول ها تیمار شده با عصاره اکتینومیست ها……………………………………..55

3-18- شناسایی سویه های منتخب اکتینومیست………………………………………………………………………….56

3-18-1- بررسی مورفولوژی میکروسکوپی……………………………………………………………………………. 56

3-18-2- بررسی میسلیوم های هوایی و آرایش زنجیره اسپوری……………………………………………………56

3-18-3- بررسی رشد میسلیومی در محیطISP2 broth………………………………………………………………56

3-19- مطالعه شیمیوتاکسونومی………………………………………………………………………………………………56

3-19-1- تهیه بیومس برای تعیین ایزومر دی آمینوپامیلیک اسید(DAP)……………………………………………56

3-20- شناسایی توالی نوکلئوتیدی ژن 16S rRNA سویه های منتخب…………………………………………….. 58

3-20-1- تهیه محیط کشت Luria Broth(LB)……………………………………………………………………………..58

3-20-2- تهیه زیست توده برای مطالعات فیلوژنتیک……………………………………………………………………..59

3-20-3- استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………………59

3-20-4- تائید بررسی کیفیت استخراج DNA………………………………………………………………………………61

3-20-4-1- تهیه ژل آگاروز……………………………………………………………………………………………………..61

3-20-4-1-1- تهیه بافر(TAE)Tris-Acetate-EDTA………………………………………………………………..61

3-20-5- انجام فرایند واکنش زنجیره پلیمراز(PCR)……………………………………………………………………..62

3-20-5-2- شرایط واکنش PCR………………………………………………………………………………………………62

3-20-5-3- بررسی محصولات PCR………………………………………………………………………………………..63

3-20-5-4- خالص سازی محصولات PCR……………………………………………………………………………….63

3-20-6- تعیین توالی نوکلئوتیدی قطعات تکثیر شده از ژن 16S rRNA………………………………………….63

3-20-7- مقایسه توالی نوکلئوتید ژن 16S rRNA سویه های اکتینومایست منتخب…………………………….63

فصل چهارم: نتایج

4-1- شرایط پیش تخمیر و تخمیر و میزان متابولیت تولید شده توسط40 سویه اکتینومیست بررسی شده در این پژوهش………………………………………………………………………………………………………………………………65

4-2- نتایج حاصل از تست ارزیابی سمیت متابولیت های ثانویه………………………………………………………..68

4-3- نتایج مربوط به بررسی ریخت شناسی سلول ها در تست سمیت سلولی………………………………….. 71

4-4- نتایج مربوط به تست سمیت سلولی با روش MTT……………………………………………………………….72

4-5- بررسی ریخت شناسی سلول ها پس از تیمار با عصاره سویه ی اکتینومیست های منتخب………………74

4-6- شناسایی اکتینومیست های منتخب………………………………………………………………………………………..74

4-6-1- بررسی ریخت شناسی اکتینومیست های منتخب…………………………………………………………………74

4-6-3- بررسی فیلوژنتیکی اکتینومیست های منتخب………………………………………………………………………77

4-6-3-1- تائید استخراجDNA اکتینومیست های منتخب………………………………………………………………77

4-6-4- تائید استخراج ژن16S rRNA از ژل آگاروز……………………………………………………………………..77

4-6-4-1- نتایج مربوط به توالی خوانی ژن 16S rRNA……………………………………………………………….78

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

منابع……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 91

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………101

پیوست ها………………………………………………………………………………………………………………………….102

فهرست جداول

عنوان صفحه

جدول ‏1‑1: میزان شیوع و مرگ و میر ناشی از انواع سرطان در هر دو جنس زن ومرد. 25

جدول ‏1‑2: تغییرات تنوع سرطان در ایران در طی سال های 1376-1318.. 27

جدول ‏1‑3:گروه های مختلف اکتینومیست ها 29

جدول ‏1‑4: تعدادی از متابولیت های استخراج شده توسط اکتینومیست ها 32

جدول ‏3‑1:مواد شیمایی استفاده شده 39

جدول ‏3‑2:دستگاه های استفاده شده 42

جدول ‏3‑3:ترکیبات محیط کشت ISP2 اصلاح شده 44

جدول ‏3‑4:ترکیبات محیط پیش تخمیر. 45

جدول ‏3‑5:نمک های مورد نیاز برای تهیه آب نمک دریایی مصنوعی.. 46

جدول ‏3‑6:ترکیبات مورد استفاده درتهیه محیط کشت دودمان A549. 49

جدول ‏3‑7:ترکیبات محیط کشت… 58

جدول ‏4‑1:نتایج حاصل از مرحله ی تولید واستخراج متابولیت های ثانویه. 64

جدول ‏4‑2:درصد کشندگی در عصاره ها با محدوده اثری بین 40-59% (محدوده اثر خوب). 67

جدول ‏4‑3:درصد کشندگی در عصاره ها با محدوده اثری بین 39-20% (محدوده اثر متوسط). 69

جدول ‏4‑4:درصد کشندگی در عصاره ها با محدوده اثری بین 0-19% (محدوده اثرضعیف). 70

جدول ‏4‑5: نتایج مربوط به بررسی مرفولوژی سلول پس از تیمار با عصاره ها 70

جدول ‏4‑6: نتایج مربوط به مقایسه مقدار جذب بین عصاره ها با شاهد…………………………………………….. 72

جدول ‏4‑7: شماره دسترسی در Gene Bank ومیزان تشابه اکتینومیست های منتخب با اکتینومیست های ثبت شده براساس ترادف نوکلئوتید های ژن 16S rRNAدر ژنوم…………………………………………………………… 80

فهرست نمودارها

عنوان صفحه

نمودار ‏4‑1:مقایسه میانگین مقدار جذب بین عصاره های سویه هایی که 05/0≥p داشتندبا شاهد(A549). 73

فهرست اشکال صفحه

شکل ‏1‑1: ساختمان شیمیایی داکتینومایسین.. 12

شکل ‏1‑2: ساختمان شیمیایی دانوروبیسین.. 14

شکل ‏1‑3: ساختمان شیمیایی دوکسوروبیسین.. 16

شکل ‏1‑4: ساختمان شیمیایی میترامایسین.. 17

شکل ‏1‑5:ساختمان شیمیایی بلئومایسین.. 18

شکل ‏1‑6:ساختمان شیمیایی میتومایسین.. 20

شکل ‏1‑7: ساختمان شیمیایی استرپتوزوستین.. 22

شکل ‏3‑1: این تصاویر به عنوان نمونه از میزان آسیب می باشد که برای درک بهتر هر مفهوم آسیب دیدگی……………………………………………………………………………………………………………………………………….54

شکل ‏4‑1: تصاویر مربوط به بررسی ریخت شناسی سلول ها پس از تیمار سلول A549 با عصاره باکتری ها…………………………………………………………………………………………………………………………………….73

شکل ‏4‑2: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 863. 74

شکل ‏4‑3: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 919. 74

شکل ‏4‑4: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 877. 74

شکل ‏4‑5: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 676. 75