به دام افتاده در آنها را آزاد میکند………………………………………………………………………………..22

2-5-3 تولید گازهایی از قبیل متان، دی اکسیدکربن،هیدروژن و نیتروژن که نفت را از فضاهای

مرده به خارج می رانند………………………………………………………………………………………………22

2-6 تجزیه بیولوژیک نفت………………………………………………………………………………………….23

2-7 اثرات سوء آلودگی های نفتی تحت تاثیر برخی عوامل مهم به شرح زیر قرار میگیرند………23

2-7-1 حجم نفت……………………………………………………………………………………………………..23

2-7-2 نوع نفت………………………………………………………………………………………………………..24

2-8 آلودگی های نفتی………………………………………………………………………………………………24

فصل سوم

روش کار

3-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………………26

3-2 هدف کاربردی این بخش……………………………………………………………………………………27

3-3 دستگاه ها و وسایل مورد استفاده…………………………………………………………………………..27

3-4 مواد مورد استفاده………………………………………………………………………………………………28

3-5 روش کار…………………………………………………………………………………………………………29

3-5-1 مرحله اول……………………………………………………………………………………………………31

3-5-2 مرحله دوم روش تلقیح و کشت باکتری ……………………………………………………………32

3-5-3 مرحله سوم روش رنگ آمیزی منفی…………………………………………………………………33

3-5-4 مرحله چهارم روش رنگ امیزی گرم………………………………………………………………..34

3-5-5 مرحله پنجم شروع غربالگری پس از هفته هشتم………………………………………………….34

3-5-6 مرحله ششم محیط کشت اختصاصی جامد برای جداسازی باکتری احیا کننده نیترات .35

3-5-7 مرحله هفتم روش تهیه سریال رقت…………………………………………………………………..35

3-6 تست احیای نیترات……………………………………………………………………………………………37

3-7 تست CHN ……………………………………………………………………………………………………37

3-7-1 خلاصه ای از ویژگی های تست CHN ……………………………………………………………38

3-8 غربالگری در محیط کشت غنی شده BHI ……………………………………………………………39

فصل چهارم

نتایج

4-1مشاهدات میکروسکوپی……………………………………………………………………………………41

4-2 غنی سازی……………………………………………………………………………………………………..41

4-3 نتایج کشت اختصاصی نیترات براث……………………………………………………………………42

4-4 نتایج تست احیای نیترات………………………………………………………………………………….42

4-5 نتایج کشت در محیط BHI………………………………………………………………………………43

4-6 نتایج تست CHN …………………………………………………………………………………………..44

4-7 تفسیر نتایج تست CHN ………………………………………………………………………………….45

فصل پنجم

بحث و نتیجه گیری

5-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………….48

5-2 بیوتکنولوژی و اهمیت بیوتکنولوژی نفت…………………………………………………………..48

5-3 بحث…………………………………………………………………………………………………………..52

5-4 نتیجه گیری………………………………………………………………………………………………..55

5-5 پیشنهادات………………………………………………………………………………………………….56

پیوست الف ………………………………………………………………………………………………………57

منابع فارسی……………………………………………………………………………………………………….58

منابع انگلیسی……………………………………………………………………………………………………..58

فهرست جداول

جدول 1-1 نسبت ترکیبی نفت خام………………………………………………………………………………………………………..3

جدول 4-1 مقادیر آنالیز عنصری در نمونه شاهد…………………………………………………………………………………..44

جدول 4-2 مقادیر آنالیز عنصری در نمونه MSM ……………………………………………………………………………..45

فهرست نمودار

نمودار1-1 قیمت های نفت خام به صورت واقعی و صوری …………………………………………………………………10

چکیده

حضور وسیع باكتریهای بی هوازی و آركی ها در سیستم نفتی زیرزمین به وسیله بسیاری از مطالعات مورد بررسی قرار گرفته است. فرآیندهای آرام بی هوازی در زیر زمین فراوان می باشد كه به همراه تجزیه زیرزمینی هیدروكربن ها كه در ارتباط با احیای نیترات و متانوژنز و یا در مخازن نفتی در جائیكه وفور سولفات وجود دارد، به همراه احیای سولفات است. میكروارگانیزم هایی كه قادر به استفاده از نفت خام به عنوان تنها منبع انرژی و كربن می باشند، با تولید یكسری محصولات جانبی و یا با شكستن تركیبات هیدروكربنی سنگین كمك شایانی در رفع مشكلات موجود در صنعت نفت کرده اند.

در این مطالعه باکتری هایی از منطقه ی لاوان ، سکوی سلمان واقع در استان خوزستان جداسازی شدند که دارای قابلیت استفاده ازهیدروکربنهای ازته به عنوان تنها منبع کربن، ازت و انرژی بطور موثر بود. تحقیقات نشان می دهد که این باکتریهای بی هوازی قادرند برخی ترکیبات کمپلکس ، حلقوی و خطی نفت خام را تجزیه کرده و از ازت موجود در این ترکیبات استفاده کنند. هدف از این مطالعه بررسی باکتری های مصرف کننده نفت خام به عنوان تنها منبع انرژی ، ازت و کربن و تجزیه ی آن به مواد قابل بازیافت و تعیین شرایط بهینه ی رشد آنها می باشد. نمونه ها پس از نمونه گیری در کمترین زمان ممکن به آزمایشگاه منتقل شدند و در محیط های رشد مناسب کشت داده شدند. در ابتدا برای بی هوازی کردن محیط کشت از روش Hungate استفاده کرده و با استفاده از serum bottle وcrimped seal کردن و در نهایت تنظیم گاز، محیط رشد باکتری ها به صورت بی هوازی تهیه شدند. نمونه ها در محیط کشت BSM کشت داده شدند سپس به دلیل fastidious بودن باکتری های بی هوازی در محیط کشت MSM که یک محیط حداقل نمکی می باشد و حاوی 1٪ نفت خام استریل به عنوان منبع کربن بود کشت صورت گرفت. غنی سازی نمونه ها با افزودن 0.01٪ گلوکز و نیز محلول ویتامین ها و Trace mineral به محیط کشت انجام شد. استفاده از محیط کشت اختصاصی نیترات براث برای کشت باکتری ها در این مرحله صورت گرفت تا از سایر باکتری های بی هوازی رشد کرده در محیط جدا شوند. در محیط نیترات براث پس از مشاهده ی تغییر رنگ محیط کشت از وجود باکتری های تجزیه کننده ی نیترات (NRB ) اطمینان حاصل شد. در مراحل بعد برای جدا کردن کلنی به دلیل عدم دسترسی به گلاو باکس میکروبی کشت در محیط کشت شیب دار با استفاده از serum bottle و جوشاندن محیط کشت برای خارج کردن اکسیژن محلول در آن و تنظیم گاز با purge کردن گاز ازت در آن به صورت بی هوازی کشت انجام شد. اضافه کردن محلول ویتامین ها نیز در همه مراحل کشت انجام شد. تست احیای نیترات جهت انتخاب بهترین سویه در شرایط بی هوازی و رشد در محیط غنی شده انجام شد و جهت بررسی عملکرد باکتری روی ساختار نفت و چگونگی تغییرات ایجاد شده در ساختار نفت توسط باکتری های NRB جدا شده، از تست CHN استفاده شد تا کاهش مقدار ازت مشخص گردد.

کلمات کلیدی : نفت خام،باکتری احیا کننده نیترات ، بی هوازی ، پر نیاز ، باکتری احیا کننده سولفات

فصل اول

کلیات

• مقدمه

نفت خام کمپلکس ترکیبی است که بطور عمده از هیدروکربن های متغیر اشباع شده و اشباع نشده تشکیل شده است. بیوتکنولوژی نفت مجموعه ای از متد و روش ها برای تولید، تغییر و اصلاح فراورده ها و تولید میکروارگانیسم ها برای کاربردهای ویژه است. مثلا تحقیقات در زمینه ی MEOR (Microbial Enhanced Oil Recovery) بمنظور افزایش برداشت از چاه های نفت به روش های میکروبی به منظور استخراج بیشتر نفت می باشد . میکروارگانیسم ها ابزار اصلی تحقیق در زمینه ی بیوتکنولوژی هستند که شامل باکتری ها، قارچ ها، جلبک ها ومیکروب هایی که در حوزه ی نفت در فرآیندهای پالایش-انتقال-تغییر و تبدیل مواد ،محیط زیست و خوردگی از ابزارهای اصلی بشمار می روند می باشند. که این منوط به حفظ و نگهداری میکروارگانیسم ها بدون کمترین تغییر ژنتیکی میباشد. در بخش مطالعات مخزن در ایران برای اولین بار مطالعه ی مخزن آزادگان با یک شرکت نروژی Sintef انجام شده روی سه میدان بزرگ نفت مارون، بی بی حکیمه و اهواز مشترک با شرکت نروژی استات اویل مطالعه شده. از 6/3 میلیون بشکه نفت 5/1 میلیون بشکه از این سه میدان تامین شده است. مطالعه جامع میدان (F.F.S ) و توسعه ی میدان ( M.D.D ) روی این زمینه فعالیت می کنند. مطالعه ی دیگر با شرکت روسی تاتنفت در زمینه ی ازدیاد برداشت به روش میکروبی میباشد که کار بزرگ و منحصر به فردی است. در ایران 3 منطقه ی نفتی وجود دارد: زاگرس ، منطقه ی ایران مرکزی و منطقه ی کپه داغ که ایران مرکزی در فارس و شمال بندر عباس و کپه داغ در شرق گرگان و شمال شرق ایران قرار دارد. نفت خام ایران متشکل از مواد آلی است که قسمت اعظم آن کربن و هیدروژن همراه با مقادیر کم گوگرد ، ازت ، اکسیژن و مقادیر جزئی فلزات از جمله نیکل ، وانادیوم و…. میباشد. ( جدول 1-1 )

(جدول 1-1) نسبت ترکیبی نفت خام

ی نوشته‌ها

فصل دوم (مروری بر ادبیات تحقیق و پیشینه آن)……………………………………………………………………………….7

2-1-کلیات (تاریخچه سابقه مطالعه و تحقیق کفزیان در ایران و جهان ………………………………………………….8

2-2-معرفی استان سمنان…………………………………………………………………………………………………………………9

2-3-چشمه های استان سمنان ……………………………………………………………………………………………………….11

2-4-معرفی مهم ترین راسته ها و خانواده های ماکروبنتوزهای آبهای شیرین ایران………………………………….12

2-5-راسته بهاره ها (پلکوپترا)……………………………………………………………………………………………………….12

2-6-راسته یکروزه ها(افموپترا)………………………………………………………………………………………………………16

2-7-راسته دوبالان (دیپترا)…………………………………………………………………………………………………………….23

2-8-بال موداران(تریکوپترا)…………………………………………………………………………………………………………..32

2-9-راسته ناجورپایان(آمفی پودا)…………………………………………………………………………………………………..37

2-10-رده تورکیان……………………………………………………………………………………………………………………….38

فصل سوم (مواد و روش کار)………………………………………………………………………………………………………….40

3-1-نمونه برداری………………………………………………………………………………………………………………………..41

3-2-وسایل نمونه برداری کفزیان…………………………………………………………………………………………………..41

3-3-نگهداری نمونه ها ………………………………………………………………………………………………………………..43

3-4-شناسایی ماکروبنتوزها……………………………………………………………………………………………………………43

3-5-دانه بندی رسوبات و تعیین موادآلی………………………………………………………………………………………….43

3-6-تعیین موقعیت ایستگاههای مطالعاتی………………………………………………………………………………………..44

3-7-منطقه مورد بررسی………………………………………………………………………………………………………………..47

3-8-عملیات آزمایشگاهی……………………………………………………………………………………………………………..52

3-9-سنجه یا معیار جمعیتی………………………………………………………………………………………………………….52

3-10-شاخص ها…………………………………………………………………………………………………………………………53

فصل چهارم (نتایج)……………………………………………………………………………………………………………………….56

4-1-رده بندی نمونه های موجود……………………………………………………………………………………………………57

فصل پنجم (بحث)………………………………………………………………………………………………………………………99

5-1-بحث و نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………………..100

5-2-پیشنهادها…………………………………………………………………………………………………………………………..107

منابع…………………………………………………………………………………………………………………………………………109

منابع فارسی ………………………………………………………………………………………………………………………………109

منابع لاتین………………………………………………………………………………………………………………………………….113

چکیده انگلیسی …………………………………………………………………………………………………………………………121

………………………………………………………………………………………………… 23

2-2-1. دسته بندی روش های کروماتوگرافی …………………………………………………………………. 24

2-2-1-1. کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)…………………………………………………….. 24

2-2-1-2. دستگاه های کروماتوگرافی مایع …………………………………………………………………… 26

2-2-1-2-1.مخزن فاز متحرک…………………………………………………………………………………. 26

2-2-1-2-2. سیستم های پمپ کننده ………………………………………………………………………….. 27

2-2-1-2-3. سیستم های تزریق نمونه ………………………………………………………………………… 28

2-2-1-2-4. ستون های کروماتوگرافی مایع …………………………………………………………………. 28

2-2-1-2-4-1. انواع پر کننده های ستون ……………………………………………………………………. 29

2-2-1-2-5. دمای ستون ……………………………………………………………………………………….. 29

2-2-1-2-6. آشکارسازها ………………………………………………………………………………………. 30

2-2-1-2-6-1.آشکارساز فتومتریک …………………………………………………………………………. 31

2-2-1-2-6-2.آشکارساز جذب فرابنفش (UV)………………………………………………………….. 32

2-3.بررسی مطالعات دیگران در این زمینه ……………………………………………………………………. 33

2-4.بررسی داروی مورد مطالعه …………………………………………………………………………………. 36

2-4-1.مکانیسم اثر فارماکوکینتیک دارو………………………………………………………………………… 36

2-4-2.مکانیسم اثر………………………………………………………………………………………………….. 37

2-4-3. موارد مصرف …………………………………………………………………………………………….. 37

2-4-4.منع مصرف و احتیاط ……………………………………………………………………………………. 37

2-4-5.عوارض جانبی …………………………………………………………………………………………….. 38

2-4-6. تداخل ها …………………………………………………………………………………………………… 38

2-4-7.دوز مصرفی ……………………………………………………………………………………………….. 38

2-5. میکرواستخراج سه فازی بر پایه استفاده از فیبر توخالی متخلخل………………………………….. 38

2-5-1.از دلایل انتخاب این روش………………………………………………………………………………. 39

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1.مواد شیمیایی و تجهیزات دستگاهی……………………………………………………………………….. 41

3-2-1. مواد شیمیایی، استانداردها و نمونه های حقیقی …………………………………………………….. 41

3-2-2.تجهیزات دستگاهی ………………………………………………………………………………………. 41

3-3.روش استخراج ………………………………………………………………………………………………… 42

3-3-1.استخراج به اختصار طی مراحل زیر انجام گرفت…………………………………………………… 42

3-3-2. مراحل بهینه سازی ……………………………………………………………………………………….. 43

3-3-2-1. بهینه سازی شرایط جداسازی……………………………………………………………………….. 43

3-3-2-2. بهینه سازی شرایط استخراج ……………………………………………………………………….. 43

3-3-2-2-1.نوع حلال آلی …………………………………………………………………………………….. 44

3-3-2-2-2.اثرpHفاز دهنده ……………………………………………………………………………………. 44

3-3-2-2-3.اثرpHفاز گیرنده …………………………………………………………………………………… 44

3-3-2-2-4.اثر قدرت یونی فاز دهنده ………………………………………………………………………. 44

3-3-2-2-5.اثر هم زدن محلول آنالیت ………………………………………………………………………. 44

3-3-2-2-6.اثر زمان استخراج …………………………………………………………………………………. 44

3-3-3. ارزیابی کارایی روش استخراج ……………………………………………………………………….. 45

3-3-3-1. منحنی درجه بندی ……………………………………………………………………………………. 45

3-3-3-2.تعیین فاکتور پیش تغلیظ (PF) ……………………………………………………………………. 45

3-3-3-3. تعیین تکرارپذیری (RSD) ………………………………………………………………………… 46

3-3-4.آنالیز نمونه حقیقی ……………………………………………………………………………………….. 46

فصل چهارم: نتایج

4-1. میکرواستخراج سه فازی بر پایه استفاده از فیبر توخالی متخلخل …………………………………. 48

4-2. مراحل بهینه سازی…………………………………………………………………………………………….. 48

4-2-1. بهینه سازی شرایط HPLC………………………………………………………………………………. 48

4-2-2. بهینه سازی شرایط استخراج ……………………………………………………………………………. 49

4-2-2-1.نوع حلال آلی………………………………………………………………………………………….. 49

4-2-2-2.طراحی آزمایش………………………………………………………………………………………… 51

4-2-2-2-1. غربال گری …………………………………………………………………………………………. 51

4-2-2-2-2. طراحی بهینه سازی ………………………………………………………………………………. 55

4-2-2-2-3. خلاصه نتایج بهینه سازی ……………………………………………………………………….. 59

4-3. تعیین پارامترهای تجزیه ای روش استخراج …………………………………………………………….. 59

4-3-1.تهیه منحنی درجه بندی …………………………………………………………………………………… 59

4-3-2.فاکتور پیش تغلیظ (PF) و درصد بازیابی (R%) …………………………………………………. 60

4-3-3.تعیین حد تشخیص (LOD) …………………………………………………………………………… 61

4-3-4. تکرارپذیری روش (RSD) ……………………………………………………………………………. 62

4-4.آنالیز نمونه ادرار و پلاسما ………………………………………………………………………………….. 62

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

5-1. بحث و نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………… 66

5-2. پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………… 69

منابع……………………………………………………………………………………………………………………..70

خلاصه انگلیسی ……………………………………………………………………………………………………..82

ضمایم………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….82

فهرست جداول

عنوان صفحه

جدول 2-1. کاربردهای کروماتوگرافی تقسیمی ……………………………………………………………… 25

جدول 2-2. کاربردهای اخیر HF-LPME در استخراج گونه های مختلف ……………………………… 33

جدول 4-1. سطوح پایین و بالای مربوط به فاکتورهای بررسی شده ……………………………………. 52

جدول 4-2. آزمایشات طراحی شده پلاکت- بورمان جهت شناسایی فاکتورهای مهم تاثیرگذار بر روی نتایج SBME-HPLC برای جداسازی و اندازه گیریdonepezil…………………….. 52

جدول 4-3. آزمایشات طراحی شده باکس- بهکن جهت بهینه سازی فاکتورهای موثر بر SBME…. 55

جدول 4-4. خلاصه نتایج بهینه سازی استخراج……………………………………………………………….. 59

جدول 4-5. ارقام شایستگی SBME داروی دونپزیل……………………………………………………….. 62

جدول 5-1. مقایسه روش ارائه شده با سایر روش های استخراجی……………………………………….. 66

فهرست اشکال

عنوان صفحه

شکل ( الف ). روش های استخراج و میکرواستخراج ………………………………………………………….. 3

شکل 2-1. نمای جانبی از سیستم میکرواستخراج با حلال با استفاده از میله تفلونی …………………. 11

شکل 2-2. نمای جانبی از سیستم میکرواستخراج با تک قطره الف)استخراج مستقیم ازدرون محلول

ب)استخراج از فضای فوقانی ……………………………………………………………………………………………. 13

شکل 2-3. اصول استخراج HF-LPME (الف) دو فازی (ب) سه فازی ………………………………. 14

شکل 2-4. (الف) سیستم HF-LPME بر اساس پیکربندی (ب) پیکربندی میله ای U………………… 17

شکل 2-5. طرح شماتیک از سیستم HF-LPME…………………………………………………………….. 18

شکل 2-6. (الف): شمایی از سیستم HF-LPME از حجم زیاد (ب) سیستم نیمه خودکار …………. 19

شکل 2-7. طرح شماتیک میکرواستخراج فاز مایع به روش مستقیم (الف) و (ب) فضای فوقانی .. 21

شکل 2-8. شمایی از یک دستگاه HPLC……………………………………………………………………… 26

شکل 2-9. یک حلقه نمونه برداری کروماتوگرافی مایع …………………………………………………….. 28

شکل 2-10. سلول آشکارساز فرابنفش برای HPLC………………………………………………………… 32

شکل 2-11. ساختار شیمیایی دونپزیل …………………………………………………………………………. 36

شکل 4-1.کروماتو گرام تزریق مستقیم 1میلی گرم بر لیتر محلول ابی دونپزیل ………………………… 49

شکل 4-2. بررسی نوع حلال پر کننده منافذ فیبر ……………………………………………………………. 50

شکل 4-3. نمودار Pareto chart مربوط به طراحی پلاکت- بورمان …………………………………….. 54

شکل 4-4. نمودار مربوط به میزان و نحوه تغییر سطوح فاکتورهای موثر انتخاب شده ………………. 56

شکل 4-5. نمودار پاسخ سطحی تخمینی و خطوط کانتور به دست آمده از فاکتورهای موثر در کارایی استخراج donepezil توسط روش SBME-HPLC………………………………………………………………………………………. 57

شکل 4-6. منحنی درجه بندی در شرایط بهینه SBME 59

شکل 4-7. منحنی درجه بندی در محیط آبی حاصل از تزریق دارو قبل از استخراج ………………………………… 60

شکل 4-8. منحنی درجه بندی تزریق مستقیم ………………………………………………………………….. 61

شکل 4-9. کروماتوگرام نمونه ادرار حاوی 10 میکروگرم بر لیتر دارو………………………………….. 63

شکل 4-10. کروماتوگرام نمونه پلاسما حاوی 10 میکروگرم بر لیتر دارو……………………………… 64

 

خلاصه فارسی

داروی دونپزیل یک مهار کننده مرکزی آنزیم استیل کولیناستراز است که در موارد خفیف تا شدید بیماری آلزایمر بهکار می رود. همچنین در برخی موارد در درمانبیش فعالیو نیز موارد دمانس مرتبط با پارکینسون مورد استفاده قرار می گیرد.

2-1 بیوانفورماتیک و نقش آن در زیست­فناوری

3

1-2-1 پایگاه­داده

4

1-1-2-1 جایگاه Expasy

4

2-1-2-1 پایگاه­داده Swiss-Prot

7

3-1-2-1- پایگاه­دادهProsite یا پایگاه­داده موتیف­ها

9

3-1 کاربرد بیوانفورماتیک در پیش­گویی ساختار پروتئین

9

1-3-1 پیش­گویی ساختار دوم پروتئین­ها

10

2-3-1 پیش­گویی ساختار سوم پروتئین­ها

11

4-1 نمایش ساختار پروتئین

11

5-1 مقایسه ساختار سوم پروتئین­ها

12

6-1 فلزات سنگین و اثرات زیست­محیطی آنها

14

7-1 منابع تولید کننده آلودگی­های فلزات سنگین

16

8-1 کادمیوم

16

9-1 حذف فلزات سنگین از محیط­زیست

17

1-9-1 روش­های فیزیکوشیمیائی

17

1-1-9-1 روش اسمز معکوس

17

2-1-9-1 روش دیالیز الکتریکی

17

3-1-9-1 روش اولترا فیلتراسیون

18

4-1-9-1 تبادل یونی

18

5-1-9-1 رسوب­دهی شیمیایی

18

2-9-1 روشهای پاکسازی زیستی

18

1-2-9-1 پاکسازی گیاهی

18

2-2-9-1 جذب زیستی

19

1-2-2-9-1 سازکار­های جذب زیستی

19

1-1-2-2-9-1 فرایند رسوب و تجمع خارج سلولی

20

1-1-1-2-2-9-1 جذب الکتریکی

20

2-1-1-2-2-9-1 جذب فیزیکی یا جذب با دخالت نیروهای واندروالس

20

3-1-1-2-2-9-1 جذب شیمیایی

20

2-1-2-2-9-1 رسوب وتجمع داخل سلولی

20

1-2-1-2-2-9-1 متیله­کردن فلز

21

2-2-1-2-2-9-1 سولفوره کردن

21

3-2-1-2-2-9-1 رسوب فلزات مسموم کننده به صورت غیرمستقیم

21

10-1سازکار­های ورود فلزات سنگین به ریزسازواره­ها

23

11-1 پروتئین­ها و پپتیدهای عمومی متصل شونده به فلزات سنگین

26

12-1 نمایش سطحی باکتریایی

27

1-12-1 نمایش­سطحی در باکتری­های گرم­منفی

29

2-12-1 نمایش پروتئین­های هترولوگ در باکتری­های گرم مثبت

30

13-1 افزایش جذب­زیستی فلزات سنگین در باکتری­های گرم منفی با روش­های مهندسی ژنتیک با تاکید بر نمایش­سطحی

33

14-1 سازکار تشکیل پیلی باکتریایی

36

1-14-1 پیلی­های باکتریایی و پیلی CS3

39

1-1-14-1 سازمان دهی ژنتیکی اپرونcst

40

2-1-14-1 تنظیم بیان CS3

40

15-1 اهداف تحقیق

فصل دوم: مواد و روش­ها

42

1-2 بررسی­های بیوانفورماتیکی

42

1-1-2 پایگاه­های­داده و برنامه­های بیوانفورماتیکی

43

2-1-2 ساختار پروتئین و روش­های پیش­گویی عملکرد

43

1-1-2-1-2 جستجوی (شباهت) در پایگاه­داده توالی

43

1-1-2-1-2 جستجوی (شباهت) در پایگاه­داده توالی

43

3-1-2 روش­های آنالیز ساختار اول

44

4-1-2 روش­ها و برنامه­ی پیش­گویی ساختار و عملکرد پروتئین

46

5-1-2 ابزارهای مشاهده و آنالیز ملکولی

47

2-2 روش­های بیوانفورماتیکی

47

1-2-2 پیش­گویی ساختار دوم

47

2-2-2 پیش­گویی ساختار سوم پروتئین­ها و مدل­سازی

49

1-2-2-2 جستجوی توالی­های مشابه با PSI-Blast و Blast در مقابل پایگاه­داده PDB

49

2-2-2-2 مدل­سازی مقایسه­ای

49

1-2-2-2-2 سرور SWISS-MODEL

50

2-2-2-2-2 مدل­سازی با برنامه Modeller

51

3-2-2-2 مدل­سازی براساس روش شناسایی تاخوردگی

52

4-2-2-2 شبیه سازی دینامیک مولکولی با استفاده از نرم افزار GROMACS

52

5-2-2-2 تغییرات RMSD

52

1-5-2-2-2اندازه گیری RMSD با نرم افزار Swiss-pdb viewer

53

2-4-2-2-2اندازه­گیری RMSD با برنامه تحت شبکه CE

53

3-2-2 پیش­گویی سطوح در دسترس و سطوح مشترک بین دو پروتئین

54

3-2 مواد

54

1-3-2 ترکیبات استفاده­شده

54

2-3-2 آنتی بیوتیک ها

54

3-3-2 آنتی­بادی­های اولیه

54

4-3-2 آنتی­بادی­های ثانویه

54

5-3-2 باکتری­ها

55

6-3-2 پلاسمیدها

57

7-3-2 اولیگونوکلئوتیدها

58

8-3-2 کیت­های آزمایشگاهی

59

9-3-2 آنزیمها

59

10-3-2 نشانگر­ها

59

11-3-2 محلول­ها و بافرها

60

12-3-2 محیط­های کشت

60

1-12-3-2 محیط­های­کشت CFA آگار

60

13-3-2 محلول های مورد نیاز برای تهیه سلول های باكتریایی مستعد

60

14-3-2 محلول­های مورد نیاز به منظور نگهداری باکتری­ها

60

4-2 وسایل و دستگاه­ها

61

5-2 روش­ها

61

1-5-2 کشت باکتری

61

2-5-2 استخراج پلاسمید

61

1-2-5-2 استخراج پلاسمید با روش شکستن قلیایی

62

3-5-2 استخراج DNA پلاسمیدی با استفاده از کیت

62

4-5-2 بازیافت قطعات DNA از روی ژل­آگارز با استفاده از کیت

62

6-5-2 تهیه باکتریهای مستعد برای پذیرش DNA پلاسمید خارجی

62

1-6-5-2 مستعد سازی باکتری­ها

63

7-5-2 انتقال پلاسمید به درون باکتری

64

8-5-2 واکنش زنجیره­ای پلی­مراز(Polymerase chain reaction, PCR)

64

1-8-5-2 SOEing-PCR (Splicing by overlap extension PCR)

67

1-1. 9-5-2 کلونینگ ژن جهش یافته cstHدر وکتورpBR322

68

10-5-2 تائید صحت کلون­های واجد پلاسمید نوترکیب (Screening)

69

11-5-2 بررسی پروتیئن­ها

69

1-11-5-2 استخراج پروتیئن پیلی از باکتری

70

2-11-5-2 سنجش پروتیئن به روش برادفورد(Baradford)

70

1-2-11-5-2 رسم منحنی استاندارد پروتئین

71

3-11-5-2 وسترن­بلاتینگ (Western Blotting)

71

4-11-5-2 لکه­گذاری برای سلولهای باکتری

72

12-5-2 رنگ آمیزی ایمینوفلوروسنس

73

13-5-2 بررسی میزان جذب یون فلز

73

14-5-2 ویژگی­های پلاسمیدهای استفاده­شده در این مطالعه

74

15-5-2 بررسی های آماری

فصل سوم: نتایج

76

1-3 نتایج بررسی های بیوانفورماتیکی

76

1-1-3 شناسایی و طراحی موتیف(پپتید) متصل شونده به فلزات

80

2-1-3 آنالیز ساختاری پروتئین CstH جهت پیش­گویی جایگاه مجاز در آن

80

1-2-1-3 شناسایی الگو و همردیفی توالی الگو–هدف

87

2-2-1-3 تولید و ساخت مدل و ارزیابی کیفیت آنها

90

3-2-1-3 سطوح قابل دسترس و اسیدهای­آمینه سطحی

93

4-2-1-3 سطوح مشترک و اسیدهای­آمینه درگیر در ارتباطات زیرواحدها در پلیمر پیلی و زیرواحد–چاپرون

94

5-2-1-3 پیش­گویی و تعیین ساختار دوم

96

3-1-3 پیش­گویی نهایی مناطق مجاز در زیرواحد CstH

96

4-1-3 مدل­سازی پروتئین­های هیبرید

98

2-3 نتایج آزمایشگاهی

98

1-2-3 ساخت کاست های ژنی از ترکیب ژنcstHو توالی متصل شونده به کادمیوم

101

2-2-3 کلونینگ DNA زیر­واحد اصلی(CstH) جهش­یافته در وکتور کلونینگ

103

1-2-2-3 غربالگری کلون­های دارای پلاسمید­های نوترکیب

103

1-1-2-2-3 غربالگری با مقاومت آنتی­بیوتیکی و مقایسه وزنی با پلاسمیدهای کنترل

103

2-1-2-2-3 غربالگری با PCR

105

3-1-2-2-3 برش آنزیمی

105

4-1-2-2-3 تعیین توالی ژن­هایCstH::CbmوCstH::Cbβmدر کلون­های نوترکیب

106

3-2-3 کلونینگ ژن­هایcstH::cbmوcstH::cbβmدر اپرون cst

108

1-3-2-3 غربال کردن کلون های حاوی اپرون هیبریدcst::cbmوcst::cbbm

109

1-1-3-2-3 تائید صحت کلونینگ با برش آنزیمی

110

2-1-3-2-3 تائید کلونیگ با PCR

112

4-2-3 بررسی بیان پیلی­های هیبرید CS3::cbβm و CS3::cbm توسط روش­های دات­بلاتینگ باکتری و وسترن پروتئین

113

1-4-2-3 دات بلاتینگ باکتری

114

2-4-2-3 وسترن بلاتینگ

115

5-2-3 بررسی نمایش سطحی پیلی­های هیبرید CS3::cbβm و CS3::cbm توسط رنگ­آمیزی ایمونوفلورسانس

117

6-2-3 بررسی خاصیت اتصال به فلز باکتری­های بیان کننده پیلی CS3 نوترکیب

119

1-6-2-3 جذب کادمیم

120

2-6-2-3 اختصاصیت اتصال

فصل چهارم: بحث و نتیجه­گیری

123

1-4 مزیت بیان سطحی بر سایر سیستم­های بیان پروتئین

124

2-4 کاربرد پیلی CS3 جهت نمایش سطحی و نقش مطالعات بیوانفورماتیکی در شناسایی مناطق مجاز ورود پپتیدهای بیگانه در آن

129

3-4 مقایسه موتیف­های طراحی­شده جهت جذب یون کادمیوم توسط باکتری­های نوترکیب ساخته­شده در این پروژه با مطالعات پیشین

135

4-4 پیشنهادات

136

منابع

144

پیوست­ها

فهرست جدول­ها

عنوان	صفحه
جدول 1-1. موتیف­های حفظ شده و اختصاصی متصل شونده به یونهای فلزی	8
جدول 1-2. مهمترین صنایع تولید كننده فاضلاب حاوی فلز سنگین	15
جدول 1-3. خانواده­های مهم پروتئین­های دخیل در نقل وانتقالات فلزات سنگین در باکتری­ها	22
جدول1 -4. ارگانل­های سطحی باکتریایی که از طریق مسیر چاپرون-آشر اسمبل می­شوند	35
جدول 1-5. خلاصه ای از اپی توپ­ها و موتیف­های ارائه شده توسط پیلی­ها	38
جدول 2-1. پایگاه­های­داده و برنامه­های بیوانفورماتیکی	42
جدول 2-2.ابزارهای مقایسه توالی	43
جدول 2-3. ابزارهای آنالیز توالی اول پروتئین	43
جدول 2-4. روش­های جستجوی پروفایل و پترن	44
جدول 2-5. ابزارهای پیش­گویی ساختار دوم	44
جدول 2-6. ابزارها و روش های پیش­گویی ساختار سوم	45
جدول 2-7. ابزارهای آنالیز و مشاهده ملکولی	46
جدول 2-8. مشخصات پلاسمیدهای استفاده شده و یا ساخته شده در این تحقیق	56
جدول 2-9. مشخصات اولیگونوکلئوتید­های استفاده شده در این تحقیق	57
جدول 2-10. ترکیبات استفاده شده در یک واکنش SOEing-PCR	65
جدول 2-11. واكنش برش آنزیمی پلاسمید pPR322	67
جدول 2-12. تركیبات مورد استفاده برای واكنش الحاق	68
جدول 3-1 توالی اسید آمینه ای زیرواحد اصلی و چاپرون دو سیستم CS3 و کپسول آنتی­ژنی F1	81
جدول 3-2. ویژگیهای ساختاری الگو-هدف که توسط روش­های محاسباتی به همراه امتیازات نمره­دهی بدست آمده­است	87
جدول 3-3. مناطق و اسیدهای­آمینه درگیر در ارتباطات ملکولی و غیرقابل دسترس ملکول CstH	94
جدول 3- 4. اثر رقابتی یونهای Ni2+,Cu2+و Cr3+بر جذب Cd2+در حضور کادمیوم	121
4 -1. مقایسه میزان جذب یون کادمیم در سیستم­های نمایش­سطحی مختلف و نتایج حاصل از این تحقیق	133

فهرست شکل­ها

ی نوشته‌ها

……………………. 21

1-7. بیماری زایی سیاه سرفه ………………………………………………………………………………………………………………. 21

1-8. علائم کلینیکی ………………………………………………………………………………………………………………………………. 22

1-9.تشخیص بیماری…………………………………………………………………………………………………………………………….. 23

1-9-1. تشخیص بالینی………………………………………………………………………………………………………………………….. 23

1-9-2. علائم کلینیکی در نوزادان…………………………………………………………………………………………………………. 24

1-9-3. کودکان، نوجوانان و بزرگسالان………………………………………………………………………………………………….. 25

1-10. پاسخ ایمنی در برابر سیاه سرفه ………………………………………………………………………………………………… 26

1-10-1. پاسخ ایمنی همورال………………………………………………………………………………………………………………… 27

1-10-2. پاسخ ایمنی سلولی…………………………………………………………………………………………………………………. 28

1-11. روش های آزمایشگاهی تشخیص………………………………………………………………………………………………… 30

1-11-1. کشت………………………………………………………………………………………………………………………………………… 30

1-11-2. سرولوژی………………………………………………………………………………………………………………………………….. 30

1-11-3. PCR …………………………………………………………………………………………………………………………………….. 32

1-12. مدیریت بیماری…………………………………………………………………………………………………………………………….. 33

1-13. پیشگیری …………………………………………………………………………………………………………………………………….. 34

1-13-1. راهبردهای بالقوه در مهار بیماری سیاه سرفه در اوایل نوزادی……………………………………………. 35

1-13-1-1. واکسیناسیون بالغین و سالمندان……………………………………………………………………………………… 37

1-13-1-2. حفاظت غیرمستقیم نوزادان از طریق واکسیناسیون والدین………………………………………….. 37

1-13-1-3. ایمن سازی نوزادان و کودکان…………………………………………………………………………………………… 38

1-13-1-4. واکسیناسیون مادر در دوران بارداری……………………………………………………………………………….. 38

1-14. استراتژی های واکسن………………………………………………………………………………………………………………….. 39

1-14-1. واکسن غیر سلولی سیاه سرفه………………………………………………………………………………………………. 39

1-14-2. واکسن سلولی سیاه سرفه………………………………………………………………………………………………………. 40

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

2-1. تاریخچه تولید واکسن سیاه سرفه…………………………………………………………………………………………………. 42

2-1-1. تعریف تست كنترل سمیت زدایی (MWGT) ……………………………………………………………………. 43

2-1-2. تعریف تست حفاظتی داخل مغزی موش (تست توانمندی Potency test) …………………… 44

2-1-3. ابداع روش کشت……………………………………………………………………………………………………………………….. 44

2-1-4. جداسازی سلول باکتری از کشت……………………………………………………………………………………………… 45

2-2. تاریخچه تولید واکسن سیاه سرفه در انستیتو رازی…………………………………………………………………….. 46

2-3. غیرفعال سازی سوسپانسیون سلولی باکتری سیاه سرفه…………………………………………………………….. 47

2-3-1. استفاده از فرمالین و تیومرسال برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه…………. 47

2-3-2. استفاده از گلوتار آلدهید برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه……………………. 49

2-3-3. استفاده از حرارت برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه……………………………….. 49

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1. تجهیزات و وسایل ………………………………………………………………………………………………………………………….. 51

3-2. مواد و محیط ها ……………………………………………………………………………………………………………………………… 52

3-2-1. محیط کشت آگار بورده ژانگو……………………………………………………………………………………………………. 52

3-2-2. محیط کشت وِروِی…………………………………………………………………………………………………………………….. 53

3-2-3. محیط B₂…………………………………………………………………………………………………………………………………… 54

3-2-4. محیط کشت سویابین کازئین…………………………………………………………………………………………………… 54

3-2-5. محیط تیوگلیکولات براث………………………………………………………………………………………………………….. 55

3-3. روش کار …………………………………………………………………………………………………………………………………………. 56

3-3-1. انتخاب سویه های بوردتلا پرتوسیس……………………………………………………………………………………….. 56

3-3-1-1. لیوفیلیزه کردن……………………………………………………………………………………………………………………… 56

3-3-2. کشت باکتری سیاه سرفه………………………………………………………………………………………………………….. 56

3-3-2-1. کشت تجدید حیات روی محیط بورده ژانگو………………………………………………………………………. 56

3-3-2-2. کشت بذر روی محیط وِروِی………………………………………………………………………………………………… 57

3-3-2-3. مراحل انجام کشت فرمانتوری باکتری سیاه سرفه…………………………………………………………….. 57

3-3-2-3-1. استریلیزاسیون فرمانتور…………………………………………………………………………………………………… 57

3-3-2-3-2. آماده سازی و بهینه سازی محیط کشت فرمانتوری……………………………………………………… 58

3-3-2-3-3. تلقیح بذر به محیط کشت در فرمانتور…………………………………………………………………………… 58

3-3-3. جداسازی باکتری سیاه سرفه از محیط کشت…………………………………………………………………………. 59

3-3-3-1. جداسازی سلول باکتری با استفاده از سانتریفوژ…………………………………………………………………. 59

3-3-3-2. جداسازی سلول باکتری با استفاده از سیستم میکرو فیلتراسیون……………………………………. 59

3-3-4. غیرفعال سازی سلول باکتری سیاه سرفه………………………………………………………………………………… 60

3-3-5. سمیت زدایی سوسپانسیون باکتری سیاه سرفه………………………………………………………………………. 60

3-3-5-1. سمیت زدایی با استفاده از فرمالین……………………………………………………………………………………… 61

3-3-5-2. سمیت زدایی با استفاده از تیومرسال………………………………………………………………………………….. 61

3-3-6. تست های کنترلی سوسپانسیون سیاه سرفه…………………………………………………………………………… 61

3-3-6-1. تست استریلیتی……………………………………………………………………………………………………………………. 61

3-3-6-2. تست کنترل غیرفعال بودن باكتری…………………………………………………………………………………….. 62

3-3-6-3. تست کنترل سمیت زدایی (MWGT) …………………………………………………………………………… 62

3-3-6-4. تست توانمندی……………………………………………………………………………………………………………………… 62

فصل چهارم: نتایج

4-1. تجدید حیات بذر بر روی محیط بورده ژانگو………………………………………………………………………………… 64

4-2. تهیه بذر در محیط وِروِی……………………………………………………………………………………………………………….. 64

4-3. کشت فرمانتوری باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن……………………………………………………………… 64

4-4. جداسازی باکتری سیاه سرفه از کشت………………………………………………………………………………………….. 67

4-5. غیرفعال سازی و سمیت زدایی باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن……………………………………… 69

4-5-1. سمیت زدایی با فرمالین…………………………………………………………………………………………………………….. 69

4-5-2. سمیت زدایی با تیومرسال…………………………………………………………………………………………………………. 69

4-6. آزمایش های کنترلی سوسپانسیون های سیاه سرفه……………………………………………………………………. 69

4-7. نتایج حاصل از آزمون MWG در کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفه

سمیت زدایی شده با فرمالین و تیومرسال…………………………………………………………………………………………….. 72

4-8. آزمون MWG و مقایسه تغییرات اوزان موش ها……………………………………………………………………….. 75

4-9. تست توانمندی واکسن های آزمایشی سیاه سرفه……………………………………………………………………….. 80

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

بحث ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 83

نتیجه گیری و پیشنهادات ………………………………………………………………………………………………………………………. 88

منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 89

خلاصه انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………………………………. 97

ضمایم ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 98

فهرست جداول

عنوانصفحه

جدول1-1. آنتی ژن های مختلف سیاه سرفه…………………………………………………………………………………………… 9

جدول1-2. علائم کلینیکی بیماری سیاه سرفه……………………………………………………………………………………… 26

جدول1-3. آنتی بیوتیک های مورد استفاده در درمان سیاه سرفه حاد و رژیم مصرف آن……………….. 34

جدول1-4. واکسیناسیون سیاه سرفه در کشورهای مختلف…………………………………………………………………. 36

جدول2-1. ترکیب محیط لیستر و B₂بر اساس گرم در لیتر…………………………………………………………….. 45

جدول3-1. لیست دستگاه ها و تجهیزات مورد استفاده………………………………………………………………………… 51

جدول3-2. لیست مواد و محیط های مورد استفاده در تولید واکسن سیاه سرفه………………………………. 52

جدول3-3. ترکیبات محیط بورده ژانگو………………………………………………………………………………………………….. 53

جدول3-4. ترکیبات محیط کشت وِروِی………………………………………………………………………………………………… 53

جدول3-5. ترکیبات محیط کشت B₂…………………………………………………………………………………………………… 54

جدول3-6. ترکیبات محیط کشت سویابین کازئین………………………………………………………………………………. 55

جدول4-1. اطلاعات دوره كشت باكتری سیاه سرفه برای تولید واكسن…………………………………………….. 68

جدول4-2. نتایج حاصل از انجام آزمایش های غیرفعال سازی و استریلیتی سوسپانسیون های باكتری سیاه سرفه سمیت زدایی شده با فرمالین……………………………………………………………………………………………………………………………….. 70

جدول4-3. نتایج حاصل از انجام آزمایش های غیرفعال سازی و استریلیتی سوسپانسیون های باكتری سیاه سرفه سمیت زدایی شده با تیومرسال…………………………………………………………………………………………………………………………….. 71

جدول4-4. نتایج حاصل از کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با فرمالین و تیومرسال با استفاده از آزمون MWG………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 73

جدول4-5. نتایج كنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با فرمالین با استفاده از آزمون MWG 76

جدول4-6. نتایج كنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با تیومرسال با استفاده از آزمون MWG 77

جدول4-7. نتایج حاصل از انجام تست توانمندی برای شش واکسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین (FDV) 80

جدول4-8. نتایج حاصل از انجام تست توانمندی برای شش واکسن تجربی سمیت زدایی شده با تیومرسال (TDV) 81

فهرست نمودارها

عنوان صفحه

نمودار1-1. مقایسه تعداد افراد زیر یک سال ایمن شده با واکسن DTP در سه کشور مختلف در سال

2000 تا 2010 ………………………………………………………………………………………………………………………………………. 6

نمودار4-1. تغییرات pH کشت سویه 134 از باکتری سیاه سرفه در طول دوره رشد درفرمانتور….. 65

نمودار4-2. تغییرات pH کشت سویه 509 از باکتری سیاه سرفه در طول دوره رشد درفرمانتور….. 65

نمودار4-3. مقایسه­ی میانگین جذب نوری در طول موج های530 و590 در مقدار جرم باكتری در هنگام برداشت در بچ های مختلف سویه 134 و 509……………………………………………………………………………………………………………… 66

نمودار4-4. مقدار غلظت نهایی باكتری سیاه سرفه (cell10⁹×1) سویه 134 در پایان دوره كشت در هنگام برداشت 66

نمودار4-5. مقدار غلظت نهایی باكتری سیاه سرفه (cell10⁹×1) سویه 509 در پایان دوره كشت در هنگام برداشت67

نمودار4-6. مقایسه دوره ی سمیت زدایی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفه سویه 134 توسط فرمالین و تیومرسال با استفاده از تست MWG ……………………………………………………………………………………………………………………….. 74

نمودار4-7. مقایسه دوره ی سمیت زدایی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفه در سویه 509 توسط فرمالین و تیومرسال با استفاده از تست MWG……………………………………………………………………………………………………………………….. 74

نمودار4-8. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با واكسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین نسبت به تیومرسال در سویه 134……………………………………………………………………………………………………………………………………………. 78

نمودار4-9. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با واكسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین

نسبت به تیومرسال در سویه 509………………………………………………………………………………………………………. 78

نمودار4-10. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با سوسپانسیون های سمیت زدایی شده سویه 134 با تیومرسال و فرمالین نسبت به موش های گروه كنترل………………………………………………………………………………………………..79