موضعی……………………………………………………………………………………………………………………………………………..13

1-7-2 درمان سیستماتیک………………………………………………………………………………………………………………………………………..13

1-7-3 کولونوسکپی………………………………………………………………………………………………………………………………………………13

• لاپاراسکپی………………………………………………………………………………………………………………………………………………13

1-7-6جراحی باز……………………………………………………………………………………………………………………………………………………13

1-7-7 شیمی درمانی……………………………………………………………………………………………………………………………………………..14

1-7-8درمان بیولوژیکی………………………………………………………………………………………………………………………………………….14

1-7-9 پرتو درمانی………………………………………………………………………………………………………………………………………………..14

1-7-9-1 انواع درمان با اشعه………………………………………………………………………………………………………………………………….14

1-8 ALCAM……………………………………………………………………………………………………………………………………………………15

1-9ویژگی های عمومیALCAM………………………………………………………………………………………………………………………….15

1-10شناساییALCAM به عنوان یک هدف با انکولوژی………………………………………………………………………………………..16

مساله تحقیق………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….19

فصل دوم:مروری بر تحقیقات انجام شده

2-1 نقش ALCAM در درمان سرطان………………………………………………………………………………………………………………….20

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1 مواد مورد استفاده……………………………………………………………………………………………………………………………………………23

3-1-1 باکتری مورد استفاده …………………………………………………………………………………………………………………………………..23

3-1-2 پلاسمید ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………23

3-1-3 انزیم ها …………………………………………………………………………………………………………………………………………………….23

3-1-4 کیت های ازمایشگاهی. ………………………………………………………………………………………………………………………………24

3-1-5 انتی بیوتیک ها. ………………………………………………………………………………………………………………………………………….24

3-1-6 محیط کشت باکتری …………………………………………………………………………………………………………………………………..25

3-1-7 ژل الکتروفورز……………………………………………………………………………………………………………………………………………25

3-1-8 مواد شیمیایی. …………………………………………………………………………………………………………………………………………….25

3-1-9 وسایل و تجهیزات آزمایشگاهی …………………………………………………………………………………………………………………..25

3-2 انالیز بیوانفورماتیکی ناحیه C2 پروتئین ALCAM. ………………………………………………………………………………………….29

3-2-1 استخراج توالی ناحیه C2 پروتئیین ALCAM ………………………………………………………………………………………………29

3-2-2 بهینه سازی توالی یا Optimization …………………………………………………………………………………………………………29

3-3 سنتز شیمیایی DNA ناحیهC2 پروتئین ALCAM ……………………………………………………………………………………………….29

3-3-1 سنتز شیمیایی ژن نوترکیب ……………………………………………………………………………………………………………………………..29

3-3-2 پایداری و شرایط نگهداری DNA سنتز شده ……………………………………………………………………………………………………..30

3-3-3 محلول سازی DNA لیوفیلیزه………………………………………………………………………………………………………………………….30

3-4 کلونینگ پلاسمید- AMP⁺pBSK حاوی DNA ناحیهC2 پروتئینALCAM ………………………………………………30

3-4-1 آماده سازی باکتری شایسته…………………………………………………………………………………………………………………………..30

3-4-1-1 مواد و محلول ها…………………………………………………………………………………………………………………………………….30

3-4-1-2 روش کار………………………………………………………………………………………………………………………………………………30

3-4-2 ترانسفورماسیون پلاسمید به سلول های مستعد TOP10 E.coli.. ………………………………………………………………..31

3-4-2-1 روش کار……………………………………………………………………………………………………………………………………………..31

3-4-3 ارزیابی کلونی ها………………………………………………………………………………………………………………………………………..32

3-4-4 استخراج پلاسمید – AMP⁺pBSK حاوی DNA ناحیه C2……………………………………………………………………..33

3-4-5 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده……………………………………………………………………………………………………………..35

3-4-5-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion…………………………………………………………………………………………..35

3-4-5-2 الکتروفورز…………………………………………………………………………………………………………………………………………….35

3-5 ساب کلونینگ ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM……………………………………………………………………………………………….37

3-5-1 تخلیص DNA ناحیهC2 از ژل………………………………………………………………………………………………………………….37

3-5-2 لایگیشن…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….38

3-5-3 ترانسفورماسیون………………………………………………………………………………………………………………………………………….39

3-5-3-1 آماده سازی سلول های شایسته…………………………………………………………………………………………………………………39

3-5-3-2 ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coli BL21(DE3) با محصول لایگیشن…………………………………………40

3-5-4 ارزیابی کلونی ها………………………………………………………………………………………………………………………………………..40

3-5-5 استخراج پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM……………………………………………………..41

3-5-6 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده……………………………………………………………………………………………………………..42

3-6 بیان پروتئین مولتی توپ EpCAM………………………………………………………………………………………………………………..43

3-6-1 القاء بیان پروتئین………………………………………………………………………………………………………………………………………..43

3-6-2 بررسی بیان به کمک تکنیک SDS-page…………………………………………………………………………………………………….43

3-6-2-1 روش ساخت محلول ها و ژل ها……………………………………………………………………………………………………………..44

3-6-2-2 Run کردن نمونه ها……………………………………………………………………………………………………………………………..45

3-6-2-3 رنگ آمیزی با کوماسی G-250 کلوئیدی………………………………………………………………………………………………….45

فصل چهارم:نتایج

4-1 نتایج حاصل از بهینه سازی توالی ………………………………………………………………………………………………………………………….47

C2ناحیهDNA4-2 سنتز شیمیایی………………………………………………………………………………………………….50

4-3کلونینگ پلاسمید AMP+ -pBSK حاویDNA ناحیهC2…………………………………………………………………………………….52

4-4 ساب کلونینگ ژن ناحیه C2……………………………………………………………………………………………………………………………….54

4-5بیان پروتئینC2 و تایید آن به کمک تکنیک SDS_page…………………………………………………………………………………………..57

فصل پنجم:

بحث…………………………………………………………………………………………………………………………59

نتیجه گیری………………………………………………………………………………………………………………………………..69

منابع…………………………………………………………………………………………………………………………………………71

چکیده انگلیسی………………………………………………………………………………………………………………………………..74

فهرست شکل ها:

شکل 1-1 تصویر بخش های مختلف روده بزرگ………………………………………………………………………………………………………5

شکل1-2 نمای کلی روده بزرگ، روده کوچک و معده……………………………………………………………………………………………….6

شکل1-3 درصد فراوانی محل آناتومیک سرطان کولورکتال ………………………………………………………………………………………..7

شکل1-4 درصد فراوانی مراحل سرطان کولورکتال…………………………………………………………………………………………………..12

شکل1-5 نقشه ژنتیکی پروتئین ALCAM…………………………………………………………………………………………………………….15

شکل1-6 رنگ آمیزی ایمنوهیستوشیمیایی ALCAM در بافت توموری…………………………………………………………………….17

شکل3-1 نقشه ژنی پلاسمید Pet28a…………………………………………………………………………………………………………………….24

شکل3-2 دستگاه انکوباتور……………………………………………………………………………………………………………………………………25

شکل3-3 دستگاه اتوکلاو………………………………………………………………………………………………………………………………………26

شکل3-4 دستگاه مولد ولتاژو تانک الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………..26

شکل3-5 شیکر انکی باتور…………………………………………………………………………………………………………………………………….27

شکل3-6 سانتریفیوژ……………………………………………………………………………………………………………………………………………..27

شکل3-7 دستگاه تصویر ساز ژل……………………………………………………………………………………………………………………………27

شکل3-8 ترموسایکلر……………………………………………………………………………………………………………………………………………28

شکل3-9 بن ماری ………………………………………………………………………………………………………………………………………………28

شکل3-10 کیت استخراج پلاسمید…………………………………………………………………………………………………………………………33

شکل3-11 کیت استخراج DNA از ژل فرمانتاز………………………………………………………………………………………………………37

شکل4-1 شاخص سازی کدون. سمت راست: قبل از بهینه سازی سمت چپ: بعد از بهینه سازی…………………………………..48

شکل4-2 میزان فراوانی کدون های بهینه. سمت چپ: قبل از بهینه سازی سمت راست:بعد از بهینه سازی ……………………..48

شکل4-3 شاخص سازی محتوای G-C سمت راست:قبل از بهینه سازی سمت چپ: بعد از بهینه سازی………………………..49

شکل4-4ترادف ناحیهC2 مورد نظر پس از بهینه سازی کدون های مربوطه جهت بیان در میزبان E.coli………………………49

شکل4-5 مقایسه نوکلئوتید بصورت نظیر به نظیر در توالی های اولیه و بهینه سازی شده……………………………………………….50

شکل4-6 تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم آنزیمی…………………………………………………………………………………………51

شکل4-7 نقشه ژنی پلاسمید حاوی DNA ناحیه C2 پروتئینALCAM…………………………………………………………………53

شکل4-8 تائید حضور پلاسمید حاوی ژن ناحیه C2 در محصول استخراج پلاسمید…………………………………………………….53

شکل4-9 هضم دوگانه آنزیمی پلاسمید تکثیر یافتهPBSK……………………………………………………………………………………….54

شکل4-10 نقشه ژنی پلاسمید Pet28a………………………………………………………………………………………………………………….55

شکل4-11 باکتری های BL21(DE3) ترانسفورم شده با Pet28a حاوی ژن ناحیه C2…………………………………………….55

شکل4-12 تائید حضور پلاسمید Pet28a حاوی ژن ناحیه C2 در باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3) ………………….56

شکل4-13 نتیجه حاصلهاز هضم آنزیمی دوگانه پلاسمید Pet28a حاوی ژن ناحیه C2………………………………………………57

شکل4-14 بررسی بیان پروتئین ناحیه C2 به کمک تکنیک SDS-Page………………………………………………………….58

چکیده:

همة سرطان ها از سلول ها شروع می شوند به طور طبیعی ، سلول ها به گونه ای که بدن به آنها نیاز دارد، رشد می كنند و تقسیم می شوند. سلول های جدید زمانی كه لزومی به وجود آنها نیست، به وجود می آیند و یا سلول های پیر در زمان مرگ به حیات خود ادامه می دهند. این سلول های اضافی توده بافتی به نام تومور تشکیل می دهند.

سرطان کولورکتال یکی از شایع ترین سرطان های بدخیم در سرتاسر جهان می باشد که میزان ابتلا به آن حدود 6/0 می باشد که منجر به مرگ600 هزار نفر در سال می گردد. .CD166 به عنوان مارکر سلول های بنیادی سرطان کولورکتال شناسایی و معرفی شده است.که با توجه به بیان آن بر سطح سلول های سرطان کولورکتال در مراحل مختلف بیماری می توان از آن جهت کارهای درمانی و تشخیصی استفاده نمود.

ALCAM مارکر تشخیصی مثبتی برای بقای کلی بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال می باشد و شناسایی آن ممکن است به بهینه سازی سیتسم مرحله بندی تشخیصی موجود کمک کند.ALCAMمعمولا در سرطان کولورکتال روشن بوده و مارکر تشخیصی مستقل جدیدی می باشد که بر اهمیت ان در پیشروی تومور در سرطان کولورکتال تاکید شده است.

در این مطالعه ما ابتدا سعی بر آن داشتیم توالی مورد نظر را از بانک های اطلاعاتی ژنی استخراج نماییم و سپس از طریق آنالیز بیوانفورماتیکی توالی مورد نظر را از نظر بهترین بیان در میزبان باکتریایی آماده نماییم.ژن مورد نظر از طریق شیمیایی سنتز شده و سپس با استفاده از فرایند کلونینگ، قطعه ژنی سنتز شده را به کمک پلاسمید بیانی pet-28a درون سیستمپروکاریوتیانتقال داده و تکثیرنموده. در انتها نیز بیان ناحی C2در باکتری های نوترکیب با القاگر مناسب القا می نماییم و وجود پروتئین مورد نظر را به کمک تکنیک SDS-page مورد بررسی قرار می دهیم.

ناحیه C2 می تواند به مانند پروتئین اصلی خاصیت ایمنی زائی داشته باشد. این قطعه ژنی توانایی کلون شدن در میزبان پروکاریوتی را دارا بوده و باکتری قادر است به کمک القاگر مناسب به میزان فراوانی پروتئین مورد نظر را تولید کند. از این جهت می توان از این پروتئین نوترکیب برای تهیه کیت تشخیصی سرطان کولورکتال به واسطه تکنیک الایزا استفاده برد. همچنین می توان با تزریق این پروتئین نوترکیب به عنوان واکسن، سیستم ایمنی فرد را جهت پیش گیری از ابتلا به سرطان تقویت نمود.

واژه های کلیدی:

سرطان کولورکتال، ALCAM، ناحیه C2 پروتئینALCAM ،کلونینگ

فصلاول

مقدمه

1-1سرطان چیست

اصطلاح سرطان به تومورهای اطلاق می شود که می توانند به بافت های مجاور خود که از سلول­های سالم تشکیل میشوند حمله کنند توانایی مجاورت و هجوم سلول های توموری عامل طبقه بندی تومورها به دو دسته خوش خیم و بدخیم است اگر یک تومور بدخیم به یک رگ خونی یا لنفی[1] برسد می تواند متاستاز [2]دهد ودر بافت های دیگری رشد کند. نئوپلاسم(که معنی آن رشد جدید است) شکل غیر طبیعی رشد سلول­ها است و تومور، نئپلاسمی است که با وضعیت بیمار گونه همراه است، تومور ها بیماری هایی هستند که در آنها جمعیتی از سلول های، که به لحاظ ژنتیکی هم خانواده هستند توانایی رشد نا به هنجار را کسب می کنند(نخعی سیستانی وهمکاران 1389). همة سرطان ها از سلول ها شروع می شوند كه واحد سازنده بدن و اساس زندگی محسوب می شوند. سلول ها بافت را می سازند و بافت های بدن، اندام ها را تشكیل می دهند. به طور طبیعی ، سلول ها به گونه ای که بدن به آنها نیاز دارد، رشد می كنند و تقسیم می شوند. سلول های پیر می میرند وسلول های جدید جای آنها را می گیرند.

گاهی نظم مراحل رشد به هم می خورد. سلول های جدید زمانی كه لزومی به وجود آنها نیست، به وجود می آیند و یا سلول های پیر در زمان مرگ به حیات خود ادامه می دهند. این سلول های اضافی توده بافتی به نام تومور تشکیل می دهند.

تومورها خوش خیم یا بد خیم می باشند.

تومورهای خوش خیم سرطانی نیستند.

• این نوع تومورها به ندرت زندگی فرد را تهدید می کنند.

• بیشتر تومورهای خوش خیم قابل جراحی بوده و معمولا عود نمی کنند.

• تومورهای خوش خیم، به بافت های اطراف و سایر قسمت های بدن گسترش نمی یابند.

تومورهای بدخیمسرطانی هستند.

• عموما این تومورها بسیار خطرناك تر از تومورهای خوش خیم بوده و زندگی فرد را تهدید می کنند.

• تومورهای بدخیم قابل جراحی بوده ولی در مواردی بعد از عمل جراحی مجددا عود می كنند.