۱-۱۹ فاکتور رشد رگ زایی.. 20

۱-۲۰ فاکتور رشد اپیدرمی.. 21

۱-۲۱ فاکتور رشد مشتق از پلاکت.. 22

۱-۲۲ فاکتور رشد تراریختی.. 24

۱-۲۳ اهداف طرح: 26

27

۲-۱ مواد، وسایل و دستگاه های موردنیاز برای آزمایش ها به شرح زیر است: 28

۲-۲ کشت و پاساژ رده سلول هایفیبروبلاستانسانی.. 30

۲-۲-۱ رده سلولی موردمطالعه. 30

۲-۲-۲ آماده سازی محیط کشت سلولی.. 30

۲-۲-۳ پاساژ سلولی.. 31

۲-۲-۴ شمارش سلولی.. 32

۲-۲-۵ انجماد و ذخیره سازی سلول ها 33

۲-۲-۶ ذوب کردن سلول های منجمد شده. 33

۲-۲-۷ تهیه فرآورده عصاره پلاکتی مشتق از خون بند ناف.. 34

۲-۳ بررسی اثر عصاره پلاکتی بر تکثیر (فیبروبلاست) 35

۲-۴ بررسی اثر فرآورده عصاره پلاکتی بر درصد بقاء سلول های فیبروبلاست.. 36

۲-۵ اندازه گیری میزان مهاجرت سلولی به روش assay Scratch. 36

۲-۶ فرمول بکار رفته در تست خراشیدگی.. 37

۲-۷ بررسی بیان ژن. 37

۲-۷-۱ مراحل استخراج RNA.. 38

۲-۷-۲ تیمار RNA با DNAaseІ. 40

۲-۷-۳ تعیین جذب نوری و غلظت نمونه های RNA.. 40

۲-۷-۴ الکتروفورز، رنگ آمیزی و مشاهده RNA بر روی ژل آگارز. 40

۲-۷-۵ سنتز cDNA.. 42

۲-۷-۶ واکنش زنجیره ای پلیمراز 43

۲-۷-7 پرایمر. 43

۲-۷-8 نحوه رقیق کردن پرایمر. 43

۲-۷-9 Real time PCR. 44

۲-۸ جمع آوری عصاره سلولی.. 46

۲-۸-۱ تعیین غلظت پروتئین ها به روش بردفورد. 46

۲-۸-۲ انجام تست وسترن بلات به منظور بررسی تغییرات سطح پروتئین های psmad2/3, smad2/3 در مسیر smad signaling 47

۲-۸-۳ مرحله الکتروفوز. 48

۲-۸-۴ مرحله ساندویچ. 48

۲-۸-۵ مرحله Blocking و افزودن آنتی بادی ها: 49

۲-۸-۶ مرحله Stripping. 50

۲-۸-۷ مرحله ظهور فیلم. 51

۲-۹ آنالیزهای آماری.. 51

.. 53

۳-۱ بررسی اثر غلظت های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون بند ناف بر تکثیر سلول های فیبروبلاست.. 54

۳-۲ بررسی اثر غلظت های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون بند ناف بر درصد بقاء سلول های فیبروبلاست.. 56

۳-۳ نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون بند ناف بر مهاجرت سلول های فیبروبلاست 57

۳-۴ نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت های مختلف لایزت پلاکتی مشتق از خون بند ناف بر بیان ژن های Smad2 و Smad3 درسلول های فیبروبلاست تیمار شده. 62

۳-۴-۱ کیفیت RNA استخراج شده. 62

۳-۵ بررسی میزان بیان پروتئین های Smad2- P Smad3 Smad3 P Smad2 توسط وسترن بلات.. 68

.. 72

4-1 بحث.. 73

4-2 نتیجه گیری.. 79

۴-3 پیشنهاد ها 80

. 81

منابع انگلیسی.. 82

فهرست جداول

جدول 1- 1: لیست کامل از فاکتورهای رشد در پلاکت (22) 9

جدول 1- 2: لیستی از محتویات α گرانول های پلاکتی (۲۲) 11

جدول 2- 1: تجهیزات مورداستفاده. 28

جدول 2- 2: مواد مصرفی جهت آزمایشات سلولی.. 29

جدول 2- 3: مواد و وسایل موردنیاز برای بررسی بیان ژن. 29

جدول 2- 4: مواد و وسایل موردنیاز برای تکنیک وسترن بلات.. 30

جدول 2- 5: توالی پرایمر. 43

فهرست اشکال

شکل 1- 1: مرحله التهاب در فرایند ترمیم زخم (۱۴) 5

شکل1- 2: مرحله شکل گیری بافت در فرایند ترمیم زخم (14) 6

شکل 1- 3: اتصالات دو پلاکت در ایجاد لخته پلاکتی (22) 10

شکل 1- 4: ارتباط مسیر سیگنالینگ smad2/3 با فرایند ترمیم زخم. 26

شکل 2- 1: کشت سلول در پلیت ۶ خانه. 36

شکل 2- 2: نحوه کشیدن خراش در تکنیک assay Scratch. 37

شکل 2- 3: ۳ فاز تشکیل شده در استخراج RNA.. 38

شکل 2- 4: نمای کلی از استخراج RNA.. 39

شکل 2- 5: RNA استخراج شده بر روی ژل اگاروز. 41

شکل 2- 6: ساختار شیمیایی سایبر گرین.. 44

شکل 2- 7: مکانیسم عمل سایبر گرین.. 45

شکل 2- 8: مرحله تهیه ساندویچ. 49

شکل 2- 9: مرحله Blocking و افزودن آنتی بادی ها 50

شکل 3- 1: بررسی افزایش تکثیر در غلظت های متفاوت عصاره پلاکتی مشتق از خون بند ناف در مقایسه با گروه های کنترل در ۲۴ ساعت 55

. 55

شکل 3- 3: نمودار مربوط به تأثیر غلظت های متفاوت UCB-PL بر درصد بقا فیبروبلاست در این شکل علامت* به معنی تفاوت معنی دار گروه با غلظت ۱۰% در مقایسه با همه گروه های دیگر به جز گروه POS و ۱۵%-۸% است. 57

. 58

شکل 3- 5: سنجش اثر UCB-PL ۸% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 58

شکل 3- 6: سنجش اثر UCB-PL ۱۰% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 59

شکل 3- 7: سنجش اثر UCB-PL/FBS بر میزان مهاجرت سلولی در سلول های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 60

شکل 3- 8: سنجش اثر FBS۱۰% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 61

شکل 3- 9: سنجش اثر گروه کنترل منفی بر میزان مهاجرت سلولی در سلول های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 62

شکل 3- 10: کیفیت RNA استخراج شده در گروه های مختلف.. 63

شکل 3- 11: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن GAPDH.. 64

شکل 3- 12: نمودار Amplification Plot حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن GAPDH.. 64

شکل 3- 13: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad۲. 65

شکل 3- 14: نمودار Amplification Plot حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad2. 65

شکل 3- 15: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad2. 66

شکل 3- 16: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad3. 66

شکل 3- 17: مطالعه اثر گروهای مختلف UCB-PL بر میزان بیان Smad2 در سلول های فیبروبلاست تیمار شده به روش Real time-PCR 67

شکل 3- 18: مطالعه اثر گروهای مختلف UCB-PL بر میزان بیان Smad3 در سلول های فیبروبلاست تیمار شده به روش Real time-PCR 68

شکل 3- 19: رنگ آمیزی ژل حاوی پروتئین ها 69

شکل 3- 20: وسترن بلات برای پروتئین Smad2. 70

شکل 3- 21: وسترن بلات برای پروتئین P Smad2. 70

شکل 3- 22: وسترن بلات برای پروتئین Smad3. 70

شکل 3- 23: وسترن بلات برای پروتئین p-Smad3. 71

چکیده

هدف: