1-4- 4-4 پلی مورفیسم های افزایش هموسیستئین…………………………………………….. 19

1-4-4-5 پلی مورفیسم هایی در فیبرینوژن……………………………………………………………. 19

1-4-4-6 واریانت های میتوکندریایی………………………………………………………………………. 20

1-4-5 نقش آلودگی………………………………………………………………………………………………………… 21

1-5 عواملی که در آترواسکلروزیس جلوگیری می کند………………………………………………………. 21

1-5-1 استروژن ها…………………………………………………………………………………………………………… 21

1-5- 2 آنتی اکسیدان ها و عمکرد آنها………………………………………………………………………… 21

1-5-3 پرهیزهای غذایی………………………………………………………………………………………………….. 22

1-5-4 ورزش……………………………………………………………………………………………………………………. 23

1-6 سیستم RAAS و عملکرد آن……………………………………………………………………………………. 23

1-7 طبقه بندی ترکیبات RAAS و ویژگی شان…………………………………………………………….. 25

1-7-1 رنین……………………………………………………………………………………………………………………… 25

1-7-2 آنژیوتانسینوژن ، آنژیوتانسین 1 و 2…………………………………………………………………. 25

1-7-3 آنزیم مبدل آنژیوتانسین 1 (ACE ) و آنزیم مبدل آنژیوتانسین 2 ( ( ACE2. 26

1-7-4 رسپتورهای 1 و 2………………………………………………………………………………………………. 27

1-8 التهاب و سیستمRAAS…………………………………………………………………………………………….. 29

1-9 واریانت ها در ژن AGT……………………………………………………………………………………………….. 30

1-10 RAAS موضعی……………………………………………………………………………………………………….. 30

1-10-1 RAAS موضعی در قلب……………………………………………………………………………….. 31

1-11 تولید آنژیوتانسین بافتی……………………………………………………………………………………………… 31

1-11- 1 تولید آنژیوتانسین در جریان درونی ( بین شکاف )……………………………………….. 31

1-11-2 تولید آنژیوتانسین در غشاء سلولی……………………………………………………………………. 32

1-11-3 تولید آنژیوتانسین در داخل سلول…………………………………………………………………… 32

1-12 تاثیرات RAAS روی سلول های قلبی………………………………………………………………….. 33

1-13 تاثیرات RAAS روی جریان کرونری………………………………………………………………………. 34

1-14 تاثیرات RAAS روی جریان منظم شریان……………………………………………………………… 34

1-15 جداسازی و خالص سازی DNA……………………………………………………………………………… 36

1-16 واکنش زنجیره پلی مراز ……………………………………………………………………………………………. 38

1-16-1 مراحل اصلی در واکنش زنجیرۀ پلی مراز………………………………………………………. 39

1-16-2 طراحی پرایمر ………………………………………………………………………………………………….. 40

1-16-3 دمای اتصال پرایمر ……………………………………………………………………………………………. 41

1-17 الکتروفورز…………………………………………………………………………………………………………………….. 42

1-18 روش آشکارسازی اسیدنوکلئیک………………………………………………………………………………… 43

1-19 یافتن جهش ها با روش PCR – SSCP………………………………………………………………. 44

1-20 تعیین توالی بازهای DNA ………………………………………………………………………………………. 46

1-21 مروری بر مطالعات گذشته…………………………………………………………………………………………… 48

1-22 اهداف تحقیق……………………………………………………………………………………………………………….. 52

2 فصل دوم : مواد و روش ها……………………………………………………………………………………………………….. 53

2-1 مشخصات بیماران…………………………………………………………………………………………………………… 54

2-2 بافرها و محلول ها…………………………………………………………………………………………………………… 55

2-2-1 روش تهیه EDTA……………………………………………………………………………………………. 55

2-2-2 روش تهیه الکل 75/…………………………………………………………………………………………… 55

2-2-3 روش تهیه پرایمرها………………………………………………………………………………………………. 55

2-2-4 روش تهیه اتیدیوم بروماید………………………………………………………………………………….. 55

2-2-5 روش تهیه بافر TBE 10X……………………………………………………………………………… 56

2-2-6 روش تهیه بافر TBE ./5X……………………………………………………………………………… 56

2-2-7 روش تهیه لودینگ بافر PCR…………………………………………………………………………… 56

2-2-8 روش تهیه لودینگ بافر SSCP………………………………………………………………………… 57

2-2-9 روش تهیه محلول NAOH………………………………………………………………………………. 57

2-2-10 روش تهیه آمونیوم پرسولفات 10/………………………………………………………………….. 57

2-3 کیت استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………… 57

2-4 تکنیک PCR………………………………………………………………………………………………………………… 59

2-4-1 شرایط تکثیر قطعه مورد نظر……………………………………………………………………………… 60

2-4-2 مراحل PCR………………………………………………………………………………………………………. 61

2-5 الکتروفورز ژل آگاروز……………………………………………………………………………………………………… 61

2-6 آنالیز ژل SSCP…………………………………………………………………………………………………………… 62

2-7 آماده سازی ژل پلی آکریل آمید…………………………………………………………………………………… 62

2-8 مراحل رنگ آمیزی ژل SSCP…………………………………………………………………………………… 63

3 فصل سوم : نتایج…………………………………………………………………………………………………………………………. 64

4 فصل چهارم : بحث و نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………… 72

4-1 نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………………………. 76

4- 3 پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………………… 77

4-4 مراجع……………………………………………………………………………………………………………………………… 78

عنوان فهرست شکل ها صفحه

شکل 1-1: مکانیسم پیشنهادی در وقوع آترواسکلروزیس……………………………………………………………….. 10

شکل 1-2 : خلاصه ای از تاثیرات HDL-C………………………………………………………………………………….. 15

شکل 1-3 : کل عملکرد سیستم RAAS………………………………………………………………………………………. 24

شکل 1-4 : مسیر کلاسیک و غیر کلاسیک RAAS ………………………………………………………………….. 28

شکل 1-5 : ساختار پروتیین های درگیر در سیستم RAAS …………………………………………………….. 29

شکل 1-6 : طرح پیشنهادی تولید آنژیوتانسین 1 و 2 درقلب……………………………………………………….. 33

شکل 1-7 : تاثیرات آنژیوتانسین 2 روی قلب………………………………………………………………………………….. 35

شکل 1-8 : مراحل زنجیره پلی مراز…………………………………………………………………………………………………. 40

شکل 1-9 : ژل الکتروفورز ………………………………………………………………………………………………………………… 43

شکل 1-10 : روش SSCP …………………………………………………………………………………………………………….. 46

شکل 3-1 : تصویری از الکتروفورز محصول PCR نمونه های مورد مطالعه بر روی ژل آگاروز…. 65

شکل 3-2 : تصویری از آنالیز SSCP روی ژل پلی آکریل آمید…………………………………………………… 66

شکل 3-3 : تشخیص جهش 4360C>T با استفاده از تکنیک SSCP و تعیین توالی………… 67

شکل 3-4 : تشخیص جهش 4543T>C با استفاده از تکنیک SSCP و تعیین توالی………… 67

شکل 3-5 : هم ردیفی نوکلئوتید برای تغییر 4360C>T……………………………………………………………. 68

شکل 3-6 : هم ردیفی نوکلئوتید برای تغییر4543T>C…………………………………………………………….. 65

شکل 3-7 : هم ردیفی پروتیین برای تغییر T207M …………………………………………………………………. 66

شکل 3-8 : هم ردیفی پروتیین برای تغییر M268T …………………………………………………………………. 66

شکل 3-9 : نتیجه Blastn برای جهش 4360C> T همولوگ با حیوان pan paniscus… 67

شکل 3-10 : نتیجه Blastn برای جهش 4543T> C همولوگ با حیوان pan paniscus….. 67

عنوان فهرست جداول صفحه

جدول 1-1 : فعالیت های رسپتور نوع یک و دو آنژیوتانسین 2…………………………………………………….. 28

جدول 1-2 : مواد لازم جهت تهیه ژل SSCP با درصدهای مختلف……………………………………………. 45

جدول 2-1 : مشخصات بیماران…………………………………………………………………………………………………………. 55

جدول 2-2 : مشخصات پرایمر در این مطالعه………………………………………………………………………………….. 59

جدول 2-3 : مقدار مواد مورد استفاده در مخلوط PCR در حجم Lµ25………………………………….. 60

چکیده :

آترواسکلروزیس “بیماری اصلیعروق کرونرقلب” بیماری است که بر روی شریانهای بزرگ و متوسط بدن تاثیر میگذارد. انواع متفاوتی از سلول ها، اندام ها و شماری از فرآیندهای فیزیولوژیکی در این عارضه درگیر هستند. سیستمRAAS یک سیستم مهم در تنظیم فشارخون، آب و الکترولیت های بدن انسان و سایر موجودات زنده است. مطالعه وسیعی روی واریانت های ژن های کد کنندۀ این سیستم، که باعث گسترش فشار خون و بیماری آترواسکلروزیس می گردد، صورت گرفته است. ژنAGTنخستین ژنی است که با فشارخون بالا ارتباط دارد و واریانت های این ژن احتمالا با افزایش فشارخون و گسترش آترواسکلروزیس مرتبط هستند.

این مطالعه بر روی دومین اگزون ژنAGT(آنژیوتانسین) بر روی 70 فرد مبتلا به آترواسکلروزیس انجام گرفت. پس از استخراج DNA از نمونه ها و PCR ، ژن تکثیر شده با روش SSCP⁵برای یافتن پلی مورفیسم یا تغییرات جدید در ژن، مورد بررسی قرار گرفت. هفت مورد از نمونه های دارای شیفت باندی برای تعیین ماهیت تغییر، تعیین توالی شدند. در این بررسی دو جهش در موقعیت های 4543T>C و 4360C>T مشخص شد، که در جهش اول متیونین موقعیت 268 به تروئونین (M268T) و در جهش دوم در کدون 207 اسیدآمینه تروئونین به متیونین (T207M) تبدیل می گردد. این تغییرات احتمالا افزایش غلظت های پلاسماییAGTو افزایش فشارخون را به همراه دارند.

کلمات کلیدی:آترواسکلروزیس، آنژیوتانسینوژن، PCR-SSCP، موتاسیون، آنژیوتانسین 2، فشار خون بالا