اسپرم………………………………………………………………………………………………………………19

1-5-3- لقاح در شرایط آزمایشگاهی(IVF)………………………………………………………………………………………..21

1-5-4-کشت جنین در شرایط آزمایشگاهی(IVC)……………………………………………………………………………23

1-6- مقایسه جنین­های طبیعی با جنین­های آزمایشگاهی………………………………………………………………….26

1-7- انجماد

1-7-1- مراحل اصلی انجماد………………………………………………………………………………………………………………..30

1-7-2- راه­های کاهش اثرات زیانبار مواد محافظت کننده…………………………………………………………………..30

1-7-3- روش­های انجماد……………………………………………………………………………………………………………………..30

1-7-3-1- انجماد شیشه­ای………………………………………………………………………………………………………………….31

1-7-3-1-1- عوامل تکنیکی موثر در انجماد شیشه­ای……………………………………………………………………….32

1-7-3-1-1-1- زمان تعادل و آبگیری………………………………………………………………………………………………..32

1-7-3-1-1-2- سرعت سرد کردن……………………………………………………………………………………………………..32

1-7-3-1-1-3- سرعت گرم کردن………………………………………………………………………………………………………35

1-7-3-1-1-4- مواد محافظ انجمادی…………………………………………………………………………………………………35

1-7-3-1-1-5- نقش ضد یخ­ها……………………………………………………………………………………………………………36

1-7-3-1-1-6- ذوب و آبدهی…………………………………………………………………………………………………………….. 36

1-8-آلدوسترون…………………………………………………………………………………………………………………………………….37

1-8-1- خصوصیات……………………………………………………………………………………………………………………………….37

1-8-2- عملکرد…………………………………………………………………………………………………………………………………….38

1-9- ارزیابی کیفیت رویان……………………………………………………………………………………………………………………41

1-10- سلول­های رویانی……………………………………………………………………………………………………………………….43

فصل دوم: بر متون گذشته

2-1- اثرات انجماد بر روی تخمک………………………………………………………………………………………………………..46

2-2- اثر روش انجماد شیشه­ای…………………………………………………………………………………………………………….47

2-3- بیان زیر واحد­های پمپ Na/K ATpase در تخمک و جنین…………………………………………………48

2-4- پمپ Na/K ATpase ……………………………………………………………………………………………………………49

2-5- آکواپورین­ها………………………………………………………………………………………………………………………………….51

2-6- هچ یا تفریخ………………………………………………………………………………………………………………………………….52

2-7- فعال شدن ژنوم رویانی………………………………………………………………………………………………………………..55

2-8- متابولیسم رویان…………………………………………………………………………………………………………………………..56

2-9- نقش آلدوسترون در بیان پروتیین Na/K ATpase………………………………………………………………..58

فصل سوم: مواد و روش­ها

3-1- تولید جنین های حاصل از لقاح خارج رحمی (IVF)

3-1-1- جمع آوری تخمدان ها از کشتارگاه و استحصال تخمک ها از مایع فولیکولی……………………………61

3-1-2- بلوغ آزمایشگاهی تخمک ها (IVM)………………..……….…….………………………………………..62

3-1-3- لقاح داخل آزمایشگاهی (IVF)……………………………………………………………………………………………..63

3-1-3-1- آماده سازی اووسیت­های بالغ شده برای لقاح…………………………………………………………………….63

3-1-3-2- آماده سازی اسپرم………………………………………………………………………………………………………………63

3-1-4- کشت داخل آزمایشگاهی جنین های حاصل از(IVF)………………………………………………………….64

3-1-5- تازه كردن محیط کشت جنین ها…………………………………………………………………………………………….65

3-2- تهیه محلول های انجمادی……………………………………………………………………………………………………………65

3-3- مراحل انجام روند انجماد شیشه ای…………………………………………………………………………………………….66

3-4- محیط ذوب…………………………………………………………………………………………………………………………………..66

3-5- گروه­های آزمایشی و طراحی مطالعه……………………………………………………………………………………………66

3-6- ارزیابی جنین ها

3-6-1- ارزیابی کیفی جنین ها با استفاده از رنگ آمیزی افتراقی………………………………………………………….68

3-7- ایمونوسایتوشیمی پروتئین­های سطحی جنین های گوسفندی(Sheep embryo ICC)……..70

فصل چهارم: نتایج

4-1- تخمک­های منجمد شده

4-1-1- گروه آزمایشی اول، افزودن آلدوسترون به محیط IVM تخمک­های

منجمد-ذوب شده در مرحله GV………………………………………………………………………………………………………….82

4-1-2- گروه آزمایشی دوم، افزودن آلدوسترون در روز چهارم

جنینی (D4)، به محیط کشت جنین­های حاصل از تخمک­های منجمد-ذوب شده…………………………….82

4-1-3- گروه آزمایشی سوم، افزودن آلدوسترون در طی IVM،

ومتعاقباً انجماد تخمک ها در مرحله MII……………………………………………………………………………………………..83

4-1-4- گروه آزمایشی چهارم، یا گروه کننرل……………………………………………………………………………………..83

4-2- تخمک های منجمد نشده

4-2-1- گروه آزمایشی پنجم، افزودن آلدوسترون به محیط IVM تخمک­های غیر منجمد……………….85

4-2-2- گروه آزمایشی ششم، افزودن آلدوسترون در روز چهارم جنینی (D4)، به محیط کشت جنین­های حاصل از تخمک­های غیر منجمد………………………………………………………………………………………………….85

4-2-3- گروه آزمایشی هفتم، یا گروه کنترل……………………………………………………………………………………….86

4-3-

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

بحث………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..89

نتیجه­گیری………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 94

پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 95

منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 96

خلاصه انگلیسی………………………………………………………………………………………………………………………………..113

 

 

 

 

فهرست جداول

عنوانصفحه

جدول 3-1- ترکیبات محیط HEPES buffered M199……………………………………………………………. 73

جدول 3-2- ترکیبات محیط Bicarbonate buffered M199………………………………………………….. 73

جدول 3-3- ترکیبات محیطIVF medium “Fert. TALP”……………………………………………………… 74

جدول 3-4- ترکیبات محیطRinsing medium “R. TALP”………………………………………………….. 74

جدول 3-5- ترکیبات محیط Sperm medium “S. TALP”……………………………………………………. 75

جدول 3-6- ترکیبات محیط H-SOF…………………………………………………………………………………………………. 75

جدول 3-7- ترکیبات محیطی IVC- SOF……………………………………………………………………………………….. 76

جدول 3-8- Medium A……………………………………………………………………………………………………………………… 76

جدول 3-9- مواد شیمیایی و تجهیزات…………………………………………………………………………………………………… 77

جدول 4-1- حضور آلدوسترون در محیط کشت در زمانIVM یا روز چهارم

کشت جنینی، در تکامل جنین حاصل از تخمک های منجمد-ذوب شده………………………………………………83

جدول 4-2- حضور آلدوسترون در محیط کشت در زمانIVM یا روز چهارم

کشت جنینی، در تکامل جنین حاصل از تخمک های تازه……………………………………………………………………. 86

جدول 4-3- حضور آلدوسترون در محیط کشت در زمانIVM یا روز چهارم

کشت جنینی و تأثیر آن بر تعدا سلول های در تعدادی از سلول­های بلاستوسیست در تقسیم جنین­های حاصل از تخمک­های تازه………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 86

 

 

 

فهرست نمودارها

عنوانصفحه

نمودار 4-1- تاثیر آلدسترون روی بیان زیرواحد های α1 و β1 پمپ ATPase سدیم

و پتاسیم در مدت IVM یا IVC – روز چهارم- در محیط کشت سلولهای

بلاستوسیت. نوارها با حروف مختلف نشان دهنده تفاوت معنی­دار می­باشد…………………………………………. 87

فهرست اشکال

عنوانصفحه

شکل 1-1- روند انجام اووژنزیزیس و اسپرماتوژنزیس……………………………………………………………………………. 10

شکل 1-2- روند انجام لقاح از زمان رشد تخمک…………………………………………………………………………………… 11

شکل 1-3- تصاویر شماتیک مراحل نفوذ اسپرم به داخل تخمک……………………………………………………….. 21

شکل 1- 4- تصویر شماتیک روند تکامل جنین…………………………………………………………………………………….. 24

شکل 1-5- دو مکانیسم عملکرد مولکولی آلدوسترون…………………………………………………………………………… 38

شکل 1- 6- سیگنال های آلدوسترون……………………………………………………………………………………………………. 39

شکل 1-7- میزان اتصال سلول – سلول در توده سلولی رویان…………………………………………………………….. 44

شکل 2-1- اتصالات سلولی در رویان در حال تقسیم ونقش آنها در تشکیل حفره

بلاستوسل و تعیین موقعیت سلول­های ترفکتودرم و توده داخلی………………………………………………………… 50

شکل2-2- فرایند تشکیل حفره بلاستوسل…………………………………………………………………………………………….. 51

شکل2-3- ساز وکار کنترل فرایند هچ شدن بلاستوسیست……………………………………………………………….. 53

شکل 2-4- پدیدۀ فعال شدن ژنوم رویانی……………………………………………………………………………………………… 56

شکل 3-1- رنگ آمیزی افتراقی بلاستوسیت های مشتق از تخمک های منجمد…………………………….. 69

شکل 3-2- رنگ آمیزی ایمونوسیتوشیمی زیر واحد های α1 و β1 پمپ Na+/K+ ATPase… 72

شکل 4-1- تصاویر مورولا و بلاستوسیست تولید شده در آزمایشگاه

جنین شناسی پژوهشگاه ابن سینا…………………………………………………………………………………………………………… 84

شکل 4-2- تصاویر بلاستوسیست های در حال تفریخ در آزمایشگاه