لیشمانیا…………………………………………………………………………………………………………………… 20

1-5-1 خصوصیات بیماری لیشمانیا…………………………………………………………………………………………………. 19

1-5-2 لیشمانیوز احشایی…………………………………………………………………………………………………………………. 20

1-5-3 لیشمانیوز جلدی پس از کالاآزار (PKDL)……………………………………………………………………… 21

1-5-3-1 لیشمانیوز جلدی و اشکال بالینی آن………………………………………………………………………………. 22

1-5-3-2 لیشمانیوز جلدی خشک…………………………………………………………………………………………………. 22

1-5-3-3 لیشمانیوز جلدی مرطوب… 22

1-5-3-4 لیشمانیوز جلدی مزمن (Chronic Cutaneous Leisniasihmas)………………… 23

1-5-3-4-1 شکل لوپوئید یا عود کننده سالک (Lupoid or Recidivan form)…………….. 24

1-5-3-5 لیشمانیوز جلدی- مخاطی……………………………………………………………………………………………… 24

1-6 ایمنولوژی عفونت­های لیشمانیا…………………………………………………………………………………………………. 25

1-6-1 مشخصات ایمنولوژیكی در لیشمانیوز پوستی……………………………………………………………………. 25

1-6-1-1 نقش آنتی بادی یا ایمنی همورال…………………………………………………………………………………… 25

1-6-1-2 نقش ایمنی سلولی در لیشمانیوز جلدی………………………………………………………………………… 26

1-6-1-3 عمل سلولهای نوتروفیل و ماكروفاژ در لیشمانیوز………………………………………………………….. 26

1-6-1-3 عملکرد T-CELL……………………………………………………………… 27

1-6-2 مشخصات ایمنولوژیكی در لیشمانیوز احشایی…………………………………………………………………… 28

1-6-2-1 نقش ایمنی همورال در كالاآزار………………………………………………………………………………………. 28

1-6-2-3 نقش ایمنی سلولی در كالاآزار………………………………………………………………………………………… 28

4……………………………………………………. 29

1-7 روشهای تشخیص و مطالعه لیشمانیوز…………………………………………………………………………………….. 30

1-7-1 روشهای مستقیم تشخیص انگل…………………………………………………………………………………………… 30

1-7-1-1 . جداسازی انگل از کناره ضایعات پوستی یا بافتهای آلوده…………………………………………… 31

1-7-1-1 رنگ آمیزی……………………………………………………………………………………………………………………….. 31

1-7-1-2 کشت انگل………………………………………………………………………………………………………………………… 32

1-7-2 روشهای ایمنولوژی در شناسایی انگل………………………………………………………………………………… 32

1-7-2-1 آزمایشات سرولوژی برای بررسی ایمنی همورال…………………………………………………………… 32

1-7-2-2 آزمایشات ایمنولوژیکی جهت بررسی ایمنی سلولی………………………………………………………. 33

1-7-2-2-1 تستهای پوستی……………………………………………………………………………………………………………. 33

1-7-2-3 ماهیت پاسخهای ازدیاد حساسیت تاخیری (DTH)……………………………………………………. 34

1-7-3 آزمون پوستی لیشمانین یا تست مونتنگرو…………………………………………………………………………. 35

1-7-3-1 معرف آنتی­ژنی لیشمانین برای تست پوستی………………………………………………………………… 35

…………………….. 37

: بر متون گذشته

مواد و روشها

3-1کشت انگل……………………………………………………………………………………………………………………………………. 43

3 -1-1 مواد مورد نیاز جهت كشت انگل……………………………………………………………………………………….. 43

3-1-2. وسایل مورد نیاز جهت كشت انگل……………………………………………………………………………………… 43

3-1-3. طرز تهیه محیط كشت مایع RPMI- 1640 ………………………………………………………………….. 44

3-1-4. طرز تهیه محیط كشت كامل……………………………………………………………………………………………….. 44

3-1-5. طرز تهیه محیط كشت NNN……………………………………………………… 44

3-1-6. طرز تهیه (PBS) Phosphate Buffered Saline…………………………….. 45

3-1-7. روش كشت انگل…………………………………………………………………………………………………………………… 45

3-1-8. روش شمارش سلولها……………………………………………………………………………………………………………. 46

3-1-8-1. مواد و وسایل لازم جهت شمارش انگل…………………………………………………………………………. 46

3-1-8-2. شمارش با لام نئوبار………………………………………………………………………………………………………… 46

3-2. جداسازی انگلها با limiting dilution assay………………………………………. 47

3-2-1. مواد و وسایل مورد نیاز برای Limiting dilution assay……………………….. 48

3-2-2. مراحل Limiting dilution assay……………………………………………… 48

3-3. تهیه کرایو برای ذخیره در بانک سلولی…………………………………………………………………………………… 50

3-3-1. مواد و وسایل لازم جهت تهیه کرایو……………………………………………………………………………………. 50

3-4 تهیه آنتی­ژن Freeze – thaw از انگلها جهت درهم ریختگی غشاء و بروز تمامی آنتی­ژن­ها…………….. 52

3-5 الکتروفورز آنتی­ژن­های پروتئینی در ژل پلی­آکریل­آمید ( SDS-PAGE )………………………. 53

3-5-1 اصول الکتروفورز در ژل پلی­آکریل­آمید……………………………………………………………………………….. 53

3-5-2 سیستم بافری………………………………………………………………………………………………………………………… 54

3-5-3 مواد و وسایل مورد نیاز برای SDS-PAGE…………………………………………………………………… 54

3-5-4 آماده­سازی نمونه……………………………………………………………………………………………………………………. 57

3-5-6 طرز تهیه بافر الکترود……………………………………………………………………………………………………………. 57

3-5-7. روش انجام SDS-PAGE………………………………………………………… 58

3-5-8 روش رنگ­آمیزی با کوماسی آبی R- 250………………………………………….. 59

مواد مورد نیاز رنگ­آمیزی کوماسی آبی R- 250:…………………………………………………………………………… 59

3-6 سنجش میزان پروتئین تام با Bradford assay…………………………………….. 60

3-6-1 مواد و معرف­های مورد نیاز تست Bradford………………………………………. 60

3-6- 2 روش کار سنجش پروتئین تام……………………………………………………………………………………………. 61

3-7 تست Lymphocyte transformation test (L.T.T)………………………….. 62

3-7-1 روش انجام تست L.T.T……………………………………………………………. 63

1-3-7-1. مواد و وسایل لازم جهت انجام تست L.T.T…………………………………….. 64

3-8 ایمنی­زایی در خوکچه هندی…………………………………………………………………………………………………….. 66

3-8-1 مواد و وسایل مورد نیاز ایمنی­زایی در خوکچه هندی……………………………………………………….. 67

3-8-2 نحوه ایمنی­زایی در خوکچه………………………………………………………………………………………………… 67

3-9 تزریق داخل پوستی آنتی­ژن­ها و سنجش میزانDTH…………………………………. 69

3-9-1 مواد و وسایل لازم برای تزریق داخل پوستی و سنجش میزان DTH……………….. 69

3-9-2 مراحل تزریق داخل پوستی………………………………………………………………………………………………… 69

3-9-3 نحوه سنجش میزان DTH………………………………………………………… 70

4-1 کشت اولیه و جداسازی تک کلون­ها با روش limiting dilution…………………….. 72

4-2 بررسی پروفایل پروتئینی در آنالیز تک کلون­ها………………………………………………………………………. 72

4-3 نتایج میزان پروتئین تام آنتی­ژن­ها به روش Bradford……………………………….. 73

4-4 بررسی نتایج تست L.T.T…………………………………………………………….. 74

4-4-1 نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن B……………………………………………. 74

4-4-2 نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن C……………………………………………. 75

4-4-3. نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن D…………………………………………… 76

4-4-4 نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن لیشمانین استاندارد (M)…………………………………….. 76

4-4-5. بررسی نتایج حاصل از اندکس تحریکی تمامی آنتی­ژن­ها و میانگین آنها در مقایسه با Con-A 77

4-4-6 بررسی نتایج کلی L.T.T…………………………………………………………… 79

4-5 بررسی نتایج تست­های DTH بر روی خوکچه­های هندی……………………………………………………. 79

4-5-1 نتایج تست DTH 24 ساعته……………………………………………………………………………………………. 79

4-5-2 نتایج تست DTH 48 ساعته…………………………………………………………………………………………….. 82

4-5-3 نتایج تست DTH 72 ساعته…………………………………………………………………………………………….. 83

95

خلاصه انگلیسی………………………………………………………………………………………………..106

فهرست اشکال و جداول و نمودارها

عنوان صفحه

شکل 1-1. اشکال مختلف انگل های لیشمانیا ………………………………………………………………………………… 11

شکل1-2. پروماستیگوت لیشمانیا (خارج سلولی) …………………………………………………………………………… 14

شکل -1-3. اشکال اماستیگوت و پروماستیگوت …………………………………………………………………………….. 15

شکل 1-4. پشه خاکی ………………………………………………………………………………………………………………………. 17

شکل1-5. چرخه زندگی لیشمانیا در میزبان مهره دار …………………………………………………………………… 18

شکل 1-6.. اشکال مختلف لیشمانیوز جلدی (سالک) ……………………………………………………………………. 24

شکل 1-7. بلعیده شدن پروماستیگوت لیشمانیا توسط یک سلول ماکروفاژی …………………………….. 28

شکل3-1. شکل شماتیک لام نئوبار …………………………………………………………………………………………………. 48

جدول3-1. جدول تهیه ژل جدا کننده پایین SDS-PAGE ………………………………………………….. 56

جدول3-1. جدول تهیه ژل جدا کننده بالا SDS-PAGE ……………………………….. 57

جدول3-1. جدول تنظیم رقت دستگاه spect ……………………………………………………………………………… 62

شکل 4-1. پروفایل پروتئینی باندهای حاصل از تک­کلون­ها در مقایسه با نمونه لیشمانین استاندارد…………. 74

جدول 4-1. نتایج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتی­ژنB ……………………………………………………. 75

جدول 4-2. نتایج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن c……………………………………………………. 76

جدول 4-3. نتایج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتی­ژنی D……………………………… 77

جدول 4-4. نتایج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتی­ژنیM…………………………………………………… 78

جدول 4-5. مقایسه نتایج اندکس تحریکی به دست آمده در حضور نمونه­های آنتی­ژنی تک کلونی

و Con-A…………………………………………………………………………………… 79

نمودار1-4. نتایج میانگین اندکس تحریکی هر یک از تک کلون­ها در تست L.T.T………….. 80

جدول4-6. میانگین تست­های DTH ،24 ساعته………………………………………………………………………… 81

نمودار 2-4. بررسی نتایج تست­های داخل پوستی پس از 24 ساعت ………………………………………. 81

جدول4-7. میانگین تست­های DTH ، 48 ساعته ……………………………………………………………………….. 82

نمودار 4-3. بررسی نتایج تست­های داخل پوستی پس از 48 ساعت ………………………………………. 82

جدول4-8. میانگین تست­های DTH ،72ساعته ………………………………………………………………………… 83

نمودار 4-4. بررسی نتایج تست­های داخل پوستی پس از 72 ساعت …………………………………………. 83

خلاصه فارسی

 

مقدمه: لیشمانیا ماژور یک انگل پاتوژن پروتوزوأ داخل سلولی است که عامل طیف وسیعی از عفونت­های پوستی با پیامدهای بالینی متنوع، از یک زخم پوستی خود بهبود شونده تا زخم­های گسترش یافته غیر بهبود شونده می­باشد. ایمنی سلولی نقش مهمی در مقاومت در برابر لیشمانیا ماژور بازی می­کند. واکنش­های حساسیت شدید دیررس که با تست­های پوستی لیشمانین تشخیص داده می­شوند یک روش تشخیصی برای سنجش ایمنی سلولی است و بطور وسیع برای سنجش اپیدمیولوژیکی افراد در معرض آنتی­ژن­های لیشمانیایی، سنجش واکسن­های کاندید و در کمک به تشخیص، مورد استفاده است. تست پوستی لیشمانین پبطور عمومی به نام تست مونتنگرو یا تست لیشمانین شناخته می­شود، که نیازمند یک آنتی­ژن استاندارد خالص و هموژن می­باشد.

هدف: تهیه و سنجش تک­کلون­های جداشده از لیشمانیا ماژور برای تست­ پوستی

روش: جداسازی تک­کلون­ها از سوش لیشمانیا ماژور مرجع (MRHO/IR/75/ER) به روش رقت دهی محدود شونده انجام گرفت. کلون­های جداشده با استفاده از روش­های برون­تنی، SDS-PAGE و تست تکثیر لنفوسیتی با استفاده از سلول­های تک­هسته­ایخون محیطیافراد بهبود یافته از عفونت لیشمانیا ماژور مورد ارزیابی قرار گرفتند. توانایی هر تک­کلون جداشده با تست پوستی چهار خوکچه هندی ایمن شده دربرابر لیشمانیا ماژور مورد سنجش قرار گرفته شدند. تک­کلون­های جداشده به­همراه لیشمانین در ناحیه اصلاح شده شکمی حیوان­ها بطور داخل پوستی تزریق شدند.

 

نتایج: نتایج نشان دادند که سه نمونه از هفت تک­کلون­ ( نمونهDو(B,Cدر آنالیزهای SDS-PAGE یک تک باند را نشان دادند. این تک­کلون­ها برای سنجش در تست تکثیر لنفوسیتی مورد استفاده قرار گرفتند که همگی میزان ضریب تحریک (03/2±71/8، 65/2±71/8، 13/2±43/8 به ترتیب) قابل مقایسه­ای با لیشمانین ( 512/3±10) نشان دادند. سنجش درون­تنی تک­کلون­های جداشده، در خوکچه­های هندی نشان داد که هر سه تک­کلون میزان القاء قابل قبولی در مقایسه با لیشمانین از خود نشان دادند. بعلاوه، کلونC(83/0±333/7) میزان القاء معنادار بیشتری از لیشمانین ( mm00/4) در خوکچه­های هندی تست شده با آنتی­ژنCنشان داد.