1-1-6- گیرنده هورمون انسولین…………………………………………………………………………………. 13

1-2- بیماری دیابت قندی…………………………………………………………………………………………………… 15

1-2-1- دیابت نوع- I…………………………………………………………………………………………………….. 15

1-2-1-1- دیابت آدیوپاتیک……………………………………………………………………………………. 16

1-2-2- دیابت نوع- II…………………………………………………………………………………………………… 16

1-2-3- دیابت حاملگی………………………………………………………………………………………………….. 17

1-2-4- عوارض بیماری دیابت ……………………………………………………………………………………. 17

عنوان صفحه

1-3- آسپرین ………………………………………………………………………………………………………………………. 19

1-3-1- ساز و کار عملکرد آسپرین …………………………………………………………………………….. 21

1-4- تا خوردگی و تجمعات پروتئینی……………………………………………………………………………….. 22

1-4-1- تجمعات منظم پروتئینی: فیبر آمیلوئیدی…………………………………………………….. 25

1-4-2- مراحل تشکیل فیبریل ها……………………………………………………………………………….. 26

1-4-3- پدیده فیبریلاسیون هورمون انسولین…………………………………………………………….. 28

1-5- نقش چاپرون ها در جلوگیری از فرآیند توده ای شدن

و فیبریلاسیون پروتئین ها……………………………………………………………………………………………………. 32

1-5-1- چاپرون های آلفا کریستالین و بتا کازئین……………………………………………………… 32

فصل دوم: مروری بر پژوهش های پیشین…………………………………………………………………………. 35

فصل سوم: مواد و روش های تحقیق

3-1- مواد مصرفی و رده ی سلولی…………………………………………………………………………………….. 40

3-1-1- مواد مصرفی……………………………………………………………………………………………………… 40

3-1-2- رده ی سلولی…………………………………………………………………………………………………… 41

3-2- تهیه محلول ها……………………………………………………………………………………………………………. 41

3-2-1- تهیه محلول های مورد نیاز کشت سلول سرطانی…………………………………………. 41

3-2-1-1- تهیه محلول MTT………………………………………………………………………………… 41

3-2-1-2- تهیه محلول تریپان بلو جهت رنگ آمیزی و شمارش

سلول های زنده و غیر زنده……………………………………………………………………………………… 41

3-2-1-3- تهیه محلول SDS-DMF……………………………………………………………………… 42

3-2-2- تهیه ی محلول های پروتئینی………………………………………………………………………… 42

عنوان صفحه

3-2-2-1- تهیه ی محلول انسولین ………………………………………………………………………. 42

3-2-2-2- تهیه محلول های بتاکازئین و آلفاکریستالین………………………………………. 43

3-2-3- تهیه ی محلول های مورد نیاز………………………………………………………………………. 43

3-2-3- 1- تهیه محلول بافر فسفات…………………………………………………………………….. 43

3-2-3-2- تهیه ی محلول استوک ANS……………………………………………………………… 44

3-2-3-3- تهیه ی محلول استوک تیوفلاوین T ………………………………………………… 45

3-2-3-4- تهیه محلول استوک کنگورد………………………………………………………………… 46

3-2-3-5- تهیه محلول OPA………………………………………………………………………………. 47

3-2-3-6- تهیه محلول فلورسامین………………………………………………………………………. 48

3-2-4- تهیه محلول های مورد نیاز ژل الکتروفورز …………………………………………………… 48

3-2-4-1- تهیه محلول آکریل آمید و بیس آکریل آمید……………………………………… 48

3-2-4-2- تهیه محلول 20 درصد SDS…………………………………………………………….. 48

3-2-4-3- تهیه محلول 10 درصد آمونیوم پرسولفات (APS) …………………………. 49

3-2-4-4- تهیه محلول بافر تریس 5/1 مولار ……………………………………………………… 49

3-2-4-5- تهیه محلول بافر تریس 5/0 مولار ……………………………………………………. 49

3-2-4-6- تهیه محلول بافر تانک…………………………………………………………………………. 50

3-2-4-7- تهیه بافر نمونه X2 ……………………………………………………………………………. 50

3-2-4-8- تهیه محلول رنگ آمیزی کوماسی بلو………………………………………………… 51

3-2-4-9- تهیه محلول رنگ زدای کوماسی بلو……………………………………………………. 51

3-3- روش های استفاده شده در این پژوهش………………………………………………………………….. 52

3-3-1- تخلیص آلفا کریستالین ………………………………………………………………………………… 52

3-4- روش های تحقیق………………………………………………………………………………………………………. 53

3-4-1- فرآیند استیلاسیون هورمون انسولین پانکراس گاوی با آسپیرین……………….. 53

عنوان صفحه

3-4-2- الکتروفورز ژلی هورمون انسولین استیله و غیر استیله

به منظور بررسی میزان استیلاسیون و تشکیل توده های پروتئینی

با وزن مولکولی بالا………………………………………………………………………………………………………….. 53

3-4-3- تعیین گروه های آمین آزاد/ غیر واکنش دهنده در هورمون انسولین……….. 54

3-4-4- مطالعه فلورسانس ذاتی هورمون انسولین در حضور آسپیرین…………………….. 55

3-4-5- مطالعه فلورسانس عارضی هورمون انسولین در حضور آسپیرین………………… 56

3-4-6- بررسی تشکیل فیبر آمیلوئیدی هورمون انسولین در حضور

آسپیرین با استفاده از آزمون فلورسانس تیوفلاوین T (ThT) و آزمون

اسپکتروسکوپی سنجش جذبی کنگورد……………………………………………………………………….. 57

3-4-7- بررسی توده ای شدن پروتئین انسولین استیله و غیر استیله ……………………. 58

3-4-8- مطالعه اثر استرس های شیمیایی و فیزیکی در القاء تشکیل

فیبر آمیلوئیدی انسولین استیله و غیر استیله…………………………………………………………….. 58

3-4-9- مطالعه جلوگیری از توده ای شدن هورمون انسولین استیله

و غیر استیله با چاپرون های بتا کازئین و آلفا کریستالین……………………………………………. 59

3-4-10- مطالعه ساختار دوم انسولین به روش دو رنگ نمای دورانی

در حضور آسپیرین ………………………………………………………………………………………………………… 59

3-4-11- مطالعه هورمون انسولین به روش دستگاه پراکندگی

پویای نور در حضورآسپیرین……………………………………………………………………………………………. 61

3-4-12- مطالعه تغییرات کشش سطحی نمونه های

انسولین استیله و غیر استیله………………………………………………………………………………………… 62

3-4-13- مشاهده ی فیبر آمیلوئیدی پروتئین با دستگاه

میکروسکوپ فلورسانس…………………………………………………………………………………………………… 63

3-4-14- بررسی فعالیت القا مرگ سلولی انسولین استیله با سنجش MTT …………. 63

3-4-15- آزمون آماری………………………………………………………………………………………………….. 65

عنوان صفحه

فصل چهارم: نتایج و بحث

4-1- مطالعه استیلاسیون پروتئین انسولین پانکراس گاوی در حضور آسپیرین……………. 67

4-2- مطالعه بررسی استیلاسیون پروتئین انسولین…………………………………………………………. 67

4-3- بررسی پیدایش گونه های مولکولی با وزن بالای انسولین در حضور آسپیرین

با الکتروفورز ژلی……………………………………………………………………………………………………………………. 70

4-4- مطالعه پیدایش گونه های مولکولی مختلف انسولین در حضور آسپیرین

با روش پراکنش پویای نور…………………………………………………………………………………………………… 73

4-5- مطالعه ساختار دوم پروتئین انسولین استیله به روش دو رنگ نمای دورانی……….. 75

4-6- مطالعه ساختار سوم انسولین استیله با روش فلورسانس ذاتی و محیطی…………….. 78

4-7- مطالعه کشش سطحی انسولین نمونه های مختلف انسولینی……………………………….. 80

4-8- بررسی توده ای شدن پروتئین انسولین بعد از فرآیند استیلاسیون…………………….. 82

4-9- بررسی تشکیل فیبر آمیلوئیدی پروتئین انسولین در حضور آسپیرین

با روش های اسپکتروسکوپی………………………………………………………………………………………………. 84

4-10- مطالعه ی میکروسکوپی تشکیل فیبر آمیلوئیدی به وسیله ی پروتئین

انسولین در حضور آسپیرین………………………………………………………………………………………………… 87

4-11- مطالعه ی اثر استرس های شیمیایی و فیزیکی بر ساختار و ویژگی های

آمیلوئیدی انسولین استیله و غیر استیله…………………………………………………………………………….. 88

4-12- مطالعه کینتیک توده ای شدن نمونه های مختلف انسولینی……………………………. 93

4-13- جلوگیری از فرآیند توده ای شدن نمونه های مختلف انسولینی

به کمک دو چاپرون مولکولی آلفا کریستالین و بتا کازئین……………………………………………….. 94

4-14- مطالعه ی سمیت توده های پروتئینی انسولین استیله……………………………………….. 97

نتیجهگیری……………………………………………………………………………………………………………………………… 99

فهرست منابع و مآخذ101

فهرست جداول

عنوان صفحه

جدول3-1- مقادیر لازم برای تهیه ی 1 لیتر بافر فسفات………………………………………………………. 43

جدول3-2- مقادیر لازم برای تهیه ی 1 لیتر بافر تانک………………………………………………………….. 50

جدول 3-3- مقادیر مورد نیاز جهت تهیه ی 25 میلی لیتر بافر نمونه…………………………………. 51

جدول 4-1- تغییرات شعاع هیدرودینامیک پروتئین انسولین در حضور آسپیرین……………… 75

جدول 4-2- محتوای ساختارهای دوم نمونه های مختلف انسولین بر حسب درصد…………… 77

فهرست شکل ها

عنوان صفحه

شکل 1-1- توالی اسید آمینهی پروتئین انسولین انسانی……………………………………………………….. 4

شکل 1-2- ساختار سوم و چهارم انسولین……………………………………………………………………………….. 7

شکل1-3- نمایی از مراحل سنتز هورمون انسولین………………………………………………………………….. 9

شکل 1-4- نمایی شماتیک از سلول بتای پانکراس

و چگونگی ترشح انسولین از این سلول…………………………………………………………………………………….. 10

شکل1-5- مدل ساختاری گیرنده انسولین……………………………………………………………………………… 14

شکل1-6- نمایی از ساختار مولکولی داروی آسپیرین……………………………………………………………. 20

شکل1-7- نمایی از مراحل تاخوردگی پروتئین………………………………………………………………………. 23

شکل1-8- نمایی از ایجاد حالات مولکولی گوناگون در مسیر تاخوردگی پروتئین……………….. 25

شکل1-9- تصویر شماتیک الگوی پراش اشعه X ساختار های بتا در فیبرهای آمیلوئید….. 26

شکل1-10- کینتیک تشکیل فیبر آمیلوئیدی………………………………………………………………………… 27

شکل 1-11- نمایی از ساز و کار فیبریلاسیون هورمون انسولین………………………………………….. 28

شکل1-12- مدل سلسله مراتبی تجمع انسولین در تشکیل فیبر آمیلوئید………………………….. 31

شکل 3-1- نمایی از طیف جذبی انسولین………………………………………………………………………………. 43

شکل3-2- نمایی از طیف جذبی ANS………………………………………………………………………………….. 44

شکل3-3- نمایی از طیف جذبی تیو فلاوین-T………………………………………………………………………. 45

شکل 3-4- نمایی از طیف جذبی کنگورد……………………………………………………………………………….. 46

شکل3-5- نمایی از ساختار ترکیبOPA………………………………………………………………………………. 47

عنوان صفحه

شکل3-6- نمایی از ساختار شیمیایی ترکیب فلورسامین………………………………………………………. 48

شکل 3-7- دستگاه فلورسانس Cary-Eclips………………………………………………………………………….. 57

شکل 3-8- نمایی از دستگاه دورنگ نمای دورانی215 Aviv……………………………………………… 60

شکل 3-9- نمایی از دستگاه DLS………………………………………………………………………………………….. 61

شکل3-10-دستگاه کشش سنج Kruss K100…………………………………………………………………….. 62

شکل3-11- نمایی از دستگاه میکروسکوپ فلورسانس Olympus-CX31…………………………… 63

شکل 3-12- نمایی از خانه های پلیت کشت سلولی……………………………………………………………… 64

شکل 3-13- تبدیل MTTبه فورمازان در یک واکنش کاهشی

در میتوکندری سلول های زنده…………………………………………………………………………………………………. 65

شکل 4-1- نتایج حاصل از مطالعه ی استیلاسیون پروتئین انسولین

با استفاده از آزمون های جذبیOPA و نشری فلورسامین………………………………………………………. 69

شکل 4-2- نمایی از الکتروفورز طبیعی و غیر طبیعی (احیایی و غیر احیایی )

نمونه های مختلف هورمون انسولین………………………………………………………………………………………….. 71

شکل 4-3- نمایی از الکتروفورز طبیعی و غیر طبیعی (احیایی و غیر احیایی )

نمونه های مختلف هورمون انسولین………………………………………………………………………………………… 72

شکل 4-4- مطالعه ی DLS نمونه های متفاوت انسولین……………………………………………………… 74

شکل 4-5- طیف دو رنگ نمای دورانی محدوده فرابنفش دور نمونه های

انسولین استیله شده در مدت زمان 20 روز و 36 روز………………………………………………………… 76

شکل 4-6- طیف نشری فلورسانس ذاتی نمونه های مختلف انسولین………………………………….. 79

شکل 4-7- طیف نشری فلورسانس عارضی نمونه های مختلف انسولین……………………………… 80

شکل 4-8- مطالعه ی تغییرات کشش سطحی نمونه های متفاوت انسولین

طی انکوباسیون در مدت زمان 20 و 36 روز…………………………………………………………………………… 82

شکل 4-9- مطالعه ی توده ای شدن انسولین در حضور آسپیری………………………………………… 83

عنوان صفحه

شکل 4-10- مطالعه ی فلورسانس تیوفلاوین T نمونه های انکوبه شده

20 روز و 36 روز انسولین در حضور آسپیرین………………………………………………………………………. 85

شکل 4-11- مطالعه ی اتصال کنگورد به نمونه های مختلف انسولینی………………………………. 86

شکل 4-12- تصویر فیبر آمیلوئیدی پروتئین انسولین مشاهده شده

با فلورسانس تیوفلاوین T………………………………………………………………………………………………………….. 88

شکل 4-13- مطالعه ی نشر فلورسانس ذاتی نمونه های متفاوت انسولین

در حضور استرس شیمیایی و فیزیکی…………………………………………………………………………………….. 90

شکل4-14- مطالعه ی نشر فلورسانس عارضی نمونه های متفاوت انسولین

در حضوراسترس شیمیایی و فیزیکی………………………………………………………………………………………. 91

شکل 4-15- مطالعه ی فلورسانس تیوفلاوین T نمونه های متفاوت انسولین

در حضور استرس شیمیایی و فیزیکی…………………………………………………………………………………….. 92

شکل 4-16- مطالعه ی کنیتیک توده ای شدن نمونه های مختلف انسولینی……………………. 94

شکل 4-17- مطالعه جلوگیری از فرآیند توده ای شدن نمونه های مختلف

انسولین با استفاده از چاپرون های بتا کازئین و آلفا کریستالین……………………………………………. 96

شکل 4-18- نتایج حاصل از آزمون MTT پس از 24 ساعت انکوبه کردن

رده سلول سرطانی Jurkat با فیبر نمونه های انسولینی استیله وغیراستیله………………………… 98

علائم اختصاری

 

 

BPI: Bovine Pancreatic Insulin.

OPA:o-Phthalaldehyde.

ANS: 1-anilino-8-naphthalene sulfonate.

CD: Circular dichroism.

CDNN: Context dependent neural networks.

DLS: Dynamic light scattering.

DMF: Dimethylformamide.

DMSO: Dimethyl Sulfoxide.

DTT: Dithiothreitol.

MTT: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide.

RH: Hydrodynamic radius.

RPMI: Rapid Prototyping & Manufacturing Institute.

SDS: Sodium dodecyl sulfate.

ThT: Thioflavin T.

 

هورمون انسولین