………. 15

1-5-2- آلرژی به پروتئین­های شیر……………………………………………………………………………… 16

عنوان صفحه

1-5-2-1- معرفی انواع آزمون­های رایج جهت مطالعه­ی فرآیند آلرژی……………… 18

1-5-2-2- آزمون الایزا……………………………………………………………………………………………. 19

1-6- قندی شدن غیرآنزیمی پروتئین­ها……………………………………………………………………………. 20

فصل دوم: مروری بر پژوهش­های پیشین………………………………………. 23

فصل سوم: مواد و روش­های تحقیق

3-1- مواد مصرفی………………………………………………………………………………………… 27

3-2- تهیه­ی محلول­ها……………………………………………………………………………. 28

3-2-1- تهیه­ی محلول­های کازئینی، کازئین­بتا و تعیین غلظت آن­ها………………………. 28

3-2-2- تهیه­ی محلول برادفورد و رسم نمودار استاندارد آن با

استفاده از کازئین­بتا……………………………………………………………………………. 28

3-2-3- تهیه­ی محلول­های مورد نیاز برای الکتروفورز ژلی………………………………………… 30

3-2-3-1-تهیه محلول SDS 20 درصد………………………………………………………………… 30

3-2-3-2- تهیه محلول آمونیوم پر سولفات (APS)……………………………………………… 30

3-2-3-3- تهیه محلول آکریلامید و بیس آکریلامید…………………………………………… 31

3-2-3-4- تهیه بافر تریس 5/1 مولار…………………………………………………………………… 31

3-2-3-5- تهیه بافر تریس 5/0 مولار…………………………………………………………………… 31

3-2-3-6- تهیه بافر تانک به حجم 500 میلی­لیتر……………………………………………… 31

3-2-3-7- تهیه بافر نمونه X2………………………………………………………………………………. 32

3-2-3-8- تهیه 100 میلی­لیتر محلول کوماسی­بلو……………………………………………… 33

3-2-3-9- تهیه محلول رنگ بر ژل………………………………………………………………………… 33

3-2-4- تهیه محلول OPA به حجم 50 میلی­لیتر……………………………………………………. 33

3-2-5- تهیه محلول فلورسامین…………………………………………………………………………………… 34

عنوان صفحه

3-2-6- تهیه محلول ANS…………………………………………………………………………………………… 35

3-2-7- تهیه محلول ABTS رادیکال…………………………………………………………………………. 36

3-2-8- تهیه عصاره­ی ACE از پودر استون شش خرگوش……………………………………… 37

3-3-روش­ها………………………………………………………………………………………… 38

3-3-1- تخلیص کازئین­بتا شیرگاو……………………………………………………………………………….. 38

3-3-2- تخلیص هموگلوبین A از خون انسان……………………………………………………………. 39

3-3-3- تعیین میزان خلوص پروتئین با استفاده از SDS-PAGE…………………………… 40

3-3-4- تهیه پودر استون شش خرگوش…………………………………………………………………….. 40

3-3-5- قندی کردن کازئین­بتا و کازئین­های شیرگاو به روش غیرآنزیمی………………. 41

3-3-6- آزمون­های OPA و فلورسامین برای تایید فرآیند

قندی شدن غیرآنزیمی………………………………………………………….. 41

3-3-7- مطالعه­ی فلورسانس ذاتی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی……………………. 42

3-3-8- مطالعه­ی فلورسانس عارضی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی……………….. 43

3-3-9- مطالعه تغییرات ساختاری کازئین­های بتای قندی و غیرقندی،

با استفاده از دستگاه دورنگ نمایی دورانی………………………………………. 43

3-3-10- مطالعه­ی فعالیت چاپرونی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی………………… 44

3-3-11- هضم کازئین­های شیرگاو و کازئین­بتای قندی و غیرقندی

به وسیله­ی آنزیم­های تریپسین و کیموتریپسین پانکراس گاوی…………………………………. 44

3-3-12- مطالعه­ی فعالیت آنتی­اکسیدانی کازئین­های شیرگاو کازئین­بتای

قندی و غیرقندی…………………………………………………………………………. 45

3-3-13- مطالعه­ی فعالیت مهار آنزیم ACE به وسیله­ی کازئین­بتا

قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آن­ها……………………………………… 47

3-3-14- مطالعه­ی توان آلرژی­زایی کازئین­ها و کازئین­بتای قندی

و غیرقندی……. 47

عنوان صفحه

3-3-15- آزمون آماری…………………………………………………………………….. 48

فصل چهارم: نتایج و بحث

4-1- مطالعه اثر قندی شدن غیرآنزیمی بر ساختار، فعالیت­های زیستی

(چاپرونی، آنتی­اکسیدانی و مهار آنزیمACE ) و آلرژی­زایی کازئین­بتا………………………………. 50

4-1-1- تخلیص پروتئین کازئین­بتا………………………………………………………………………………. 50

4-1-2- تخلیص هموگلوبینA از خون انسان……………………………………………………………… 51

4-1-3- مطالعه فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی کازئین­بتا

در حضور ماده­ی احیا کننده………………………………………………… 52

4-1-3-1- مطالعه­ی قندی شدن کازئین­بتا با استفاده از ترکیب OPA……………… 53

4-1-3-2- مطالعه فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی کازئین­بتا با استفاده

از ترکیب فلورسامین…………………………………………….. 54

4-1-3-3- استفاده از ژل SDS-PAGE احیایی برای تایید فرآیند

قندی شدن غیرآنزیمی کازئین­بتا……………………………………………………………………………… 55

4-1-4- مطالعه­ی فلورسانس ذاتی و عارضی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی…… 56

4-1-5- مطالعه ساختار دوم کازئین­های بتای قندی و غیرقندی با استفاده

از دستگاه دورنگ نمایی دورانی………………………………………………………………………………………. 58

4-1-6- مطالعه فعالیت چاپرونی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی………………………. 60

4-1-7- هضم آنزیمی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی با آنزیم­های

تریپسین و کیموتریپسین………………………………………………………………………………………………. 62

4-1-7-1- تایید فرآیند هضم آنزیمی با استفاده از ژلSDS-PAGE

(15درصد) احیایی……………………………………………………………………………………………………… 63

عنوان صفحه

4-1-7-2- مطالعه فعالیت آنتی­اکسیدان کازئین­های بتای قندی

و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آن­ها………………………………………………………… 65

4-1-7-3- مطالعه خاصیت مهار آنزیم ACE به وسیله­ی کازئین­های

بتای قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آن­ها………………………… 71

4-1-8- مطالعه آلرژی­زایی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی و پپتیدهای

حاصل از هضم آنزیمی آن­ها…………………………………………………………………………………………… 73

4-2- مطالعه اثر قندی شدن غیرآنزیمی بر ساختار، فعالیت آنتی­اکسیدانی

و آلرژی­زایی کازئین­های شیرگاو…………………………………………………………………………………………. 77

4-2-1- جداسازی و قندی کردن کازئین شیرگاو……………………………………………………….. 77

4-2-2- تایید فرآیند قندی شدن کازئین­های شیرگاو……………………………………………….. 77

4-2-2-1- استفاده از ژل SDS-PAGE (12 درصد) برای تایید

قندی شدن غیرآنزیمی…………………………………………………………………………………………….. 77

4-2-2-2- استفاده از ترکیب OPA برای مطالعه­ی قندی شدن غیرآنزیمی

کازئین­های شیرگاو……………………………………………………………………………………………………… 78

4-2-3- هضم آنزیمی کازئین­های قندی و غیرقندی شیرگاو با آنزیم­های

تریپسین و کیموتریپسین………………………………………………………………………………………………. 80

4-2-4- مطالعه فعالیت آنتی­اکسیدان کازئین­های قندی و غیرقندی شیرگاو

و پپتیدهای حاصل از هضم آن­ها………………………………………………………………………………….. 82

4-2-5- مطالعه آلرژی­زایی کازئین­های قندی و غیرقندی شیرگاو و پپتیدهای

حاصل از هضم آنزیمی آن­ها به وسیله­ی دو آنزیم تریپسین و کیموتریپسین………….. 86

عنوان صفحه

خلاصه­ی نتایج………………………………………………………………………………. 90

نتیجه­گیری نهایی……………………………………………………………………………………. 91

فهرست منابع و مآخذ 92

شیر

شیر یک مایع زیستی پیچیده متشکل از آب، پروتئین، چربی، کربوهیدرات، مواد معدنی و برخی ترکیبات فعال زیستی از جمله آنزیم­ها و ویتامین­ها می­باشد که به عنوان اولین ماده غذایی برای نوزاد، بوسیله غدد پستانی موجودات پستاندار ساخته می­شود. در اوایل دوران شیردهی، شیر آغوز[1] نامیده می­شود که سرشار از آنتی­بادی­هایی است که خطر ابتلای نوزاد به بسیاری از بیماری­ها را کاهش می­دهد. شیر به عنوان اولین ماده­ی غذایی برای نوزاد شامل اکثر ترکیبات ضروری و مورد نیاز برای رشد و نمو است. در شکل (1-1) ترکیبات اصلی موجود در شیر مشاهده می­شود (Pehrsson، 2000).

شکل1-1-نمایی از ترکیبات موجود در شیر.

شیر نه تنها به عنوان یک ماده­ی غذای برای تغذیه­ی نوزاد تازه متولد شده مطرح است بلکه به عنوان یک ماده­ی غذایی ارزشمند و مغذی برای انسان در تمام کشورهای جهان استفاده می شود. امروزه در سراسر جهان دامداری­های بزرگ در سطح وسیع به تولید شیر و محصولات لبنی مشغولند به طوریکه در سال 2011 میزان تولید شیر در جهان 730 میلیون تن بوده است. هندوستان به عنوان بزرگترین کشور تولید و مصرف کننده شیر در جهان و نیوزلند، 28کشور عضو اتحادیه اروپا، استرالیا و ایالات متحده­ی آمریکا به عنوان بزرگترین صادر کننده های شیر و محصولات لبنی می­باشند. همچنین چین و روسیه به عنوان بزرگترین واردکنندگان شیر و محصولات لبنی در جهان شناخته می­شوند (Blasko، 2011).