1-2-11- اثرات آنتی­اکسیدان­ها 18

1-2-11-1- تاثیر بر تحرک اسپرم. 18

1-2-11-2- تاثیر بر روی کاهش آسیب­های بعد از انجماد اسپرم. 18

1-2-11-3- تاثیر آنتی­اکسیدان­ها در جلوگیری از آسیب بهDNA… 18

1-2-12- نقش آنتی­اکسیدان­ها (رباینده­های­بالقوهROS) دراسپرم. 19

3-1- ژنتیک و ناباروری مردان.. 20

1-3-1- ژن انتخابی مورد مطالعه. 21

1-4- اهداف: 22

1-5-فرضیات: 22

2-1- مروری بر مطالعات علمی گذشته. 24

3-1- تعیین گروه­های آزمایشی.. 30

3-2- جمع آوری نمونه­ها و محل انجام آزمایش…. 30

3-3- القاء استرس اکسیداتیو با تزریق t-BHP.. 31

3-4- تک سلول کردن بافت بیضه. 31

3-5- شمارش تعداد سلول­های زنده در بافت بیضه. 32

3-6-1- روش فلوسایتومتری.. 32

3-6-2- سنجش ROS در بیضه بوسیله فلوسایتومتری.. 34

3-7- روشهای تعیین آسیب DNA اسپرم. 35

3-7-1- تست TUNEL جهت ارزیابی شکست DNAاسپرم. 36

3-7-2- جمع آوری سلول های اسپرمی جهت آنالیز شکستهای DNA اسپرم. 37

3-7-3- محلولها و بافرهای مورد نیاز جهت روش TUNEL، به منظور ارزیابی شکست DNA اسپرم. 39

3-7-4- مراحل انجام آزمایش TUNEL.. 39

3-7-5- نحوه استفاده از کیت TUNEL.. 40

. 40

3-8-1- استخراج RNA به روش ترایزول.. 41

3-8-2- بررسی کیفی RNAهای استخراج شده به وسیله الکتروفورز روی ژل آگارز 42

3-8-3- تیمار کردن نمونه­های RNAی استخراج شده 43

3-8-4- سنتزDNA مکمل (cDNA) از روی الگوی RNA… 44

3-8-5- روش انجام واکنش زنجیرهای پلی مراز (PCR) جهت اطمینان از سنتز cDNA… 46

3-8-6-روش تهیه­ی ژل آگارز و انجام الکتروفورز 48

3-8-7- طرز تهیه­ی محلول­ها 48

1- بافر50x TAE.. 48

2- محلول رنگ آمیزی اتیدیوم برماید (10mg/ml) 48

3-8-8- بررسی کمی بیان ژن با استفاده از روش واکنش زنجیرهای پلیمرازپیوسته. 49

مقایس­های برای کمی سازی نسبی.. 50

3-8-6- آنالیز آماری.. 52

4-1- بررسی وزن بدن و بافت بیضه پس از 14 روز تزریق.. 54

4-2- بررسی ماکروسکوپی بافت بیضه. 55

4-3- بررسی میزان ROS در بیضه­ی گروه کنترل و آزمون.. 56

56

4-4- نتایج ارزیابی شکست DNA اسپرم با تست TUNEL.. 59

در بافت بیضه. 61

4-5-1- استخراج RNA کل از بافت بیضه. 61

4-5-2- بررسی صحت سنتز cDNA… 62

در بافت بیضه. 63

5-1- بحث و نتیجه گیری کلی.. 67

5-2- پیشنهادات: 70

فهرست جداول

عنوان صفحه

جدول 1-1: انواع آنتی­اکسیدان­ها و مکانیسم عملکرد آنها 17

جدول 3-1: ترکیب محیط TCM…. 38

جدول 3-2: ترکیب محیط 38

جدول 3-3: ژن مورد نظر و توالی پرایمر مورد استفاده 40

جدول 3-4: مواد مورد استفاده در تیمار نمونه­هایRNA… 43

جدول 3-5: مواد مورد استفاده در سنتزcDNA… 45

جدول 3-6: برنامه دمایی سنتز cDNA… 45

جدول 3-7: مواد مورد استفاده در RT-PCR… 47

جدول 3-8: برنامه دمایی RT-PCR و تعداد سیکل­های هر مرحله. 47

جدول 3-9: اجزای لازم برای انجام واكنش Real-Time PCR… 51

جدول 3-10: برنامه دمایی Real-Time PCR… 51

جدول 4-1: میانگین وزن بدن در طول تزریق و بافت بیضه پس از 14 روز تزریق.. 54

جدول 4-2: میزان درصد H2O2 و O2 موجود در دو گروه کنترل و آزمون در نمونه­های بیضه­ای با استفاده از تکنیک فلوسایتومتری.. 58

جدول 4-3: درصد شکست DNA اسپرم با روش TUNEL در گروه کنترل و آزمون.. 60

.. 64

جدول 4-5: آنالیز نتایج Real-Time PCR با استفاده از نرم افزار REST.. 64

فهرست اشکال

عنوان صفحه

شکل 1-1: ارتباط بین ATMو P53 در پاسخ­های ترمیم DNA یا آپوپتوز حاصل از آسیب ایجاد شده توسط استرس اکسیداتیو. 9

شکل 1-2: ارتباط بین افزایش تولید ROS با ناباروری.. 15

-MSH5.. 21

شکل 3-1: شمایی از لام نئوبار 32

شکل 3-2: DCFH-DA و مکانیسم عمل آن.. 34

شکل 3-3: روش­های ارزیابی شکست DNA و نحوه تشخیص آن­ها 36

شکل3-4: اساس روش TUNEL.. 37

شکل 4-1: نمونه­های بافت بیضه در موش­های کنترل و آزمون.. 56

شکل 4-2: ارزیابی آسیب DNA در نمونه آزمون با روش TUNEL با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت(1000×) 60

شکل 4-3: نمونه RNA­های استخراج شده از بافت بیضه. 62

63

شکل 4-5: منحنی تفکیک ژن مربوطه. 65

فهرست نمودار

عنوان صفحه

نمودار 4-1: مقایسه وزن بدن و بافت بیضه میان گروه کنترل و آزمون. 55

نمودار 4-2: نمودار هیستوگرام از سلول­های بیضه­ای در یکی از نمونه­های گروه کنترل و آزمون.. 57

) در نمونه­های بیضه بین دو گروه کنترل و آزمون 59

نمودار 4-4: نتیجه حاصل از بررسی میزان شکست DNA در نمونه­های اسپرم بین دو گروه کنترل و آزمون 61

. 65

چکیده

ناباروری عمده­ترین مشکل تولیدمثلی است که حدود 15درصد زوج های جوان در جهان را درگیر می­کند. این عارضه دلایل مختلفی دارد که فاکتورهای مردانه مسؤول 40 درصد این دلایل می­باشند. در بررسی دلایل ناباروری مردان، استرس اکسیداتیو و فاکتورهای ژنتیکی نقش اساسی ایفا می کنند. گونه های اکسیژن فعال (ROS) می­توانند سبب افزایش استرس اکسیداتیوشوند. افزایش استرس اکسیداتیو می­تواند موجب اثرات مخربی بر روی عملکرد سیستم تولید مثل از جمله شکست DNA اسپرم و تغییر بیان ژن­های دخیل در اسپرماتوژنز شود.

در این تحقیق با استفاده ازماده ترت بوتیل هیدروپراکساید t-BHPیک مدل حیوانی از استرس اکسیداتیو به منظور مطالعه اثر آن در چگونگی بیان ژنKdm5d(Smcy) ایجاد گردید. این ژن در مرحله لپتوتن/زیگوتن میوز به کمک فاکتور ترمیمی MSH5سبب دمتیله شدن هیستون 3 لیزین 4 (H3K4) شده و در فشرده شدن کروماتین نقش مهمی داشت.پس از تعیین دوز LD₅₀برای t-BHP، به میزان یک دهم آن به مدت 14 روز به موش­های نر بالغ Balb/c به صورت داخل صفاقی تزریق شد. سپس میزان ROS در بیضه بوسیله فلوسایتومتری اندازه­گیری و میزان شکست DNA اسپرم با روش TUNEL سنجیده و بیان ژنKdm5d مورد ارزیابی قرار گرفت.