بروسلا…………………………………………………………….

1-8 روشهای تشخیص…………………………………………………………………………………..

1-9 درمان بیماری ………………………………………………………………………………………..

1-10 واکسیناسیون…………………………………………………………………………………………

1-10-1 تولید پروتئین نوترکیب Omp31…………………………………………….

1-10-2 استفاده از NPAP…………………………………………………………………..

1-10-3 استفاده ازبروسلاملیتنسیسسویه WR201……………………………………..

1-10-4 استفاده ازپروتئینهای غشاءداخلی16و19(Omp16&Omp19)بروسلاآبورتوس

1-10-5 تولید سویه زنده تخفیف حدت یافته با جهش بر روی ژنهایmanBA ،virB2 و asp24 در هر دو سویهبروسلا آبورتوسوبروسلا ملیتنسیس

1-10-6 جهش بر روی ژنهای دخیل در سنتز LPS………………………………………….

1-10-7 استفاده از LPS خالص شدهبروسلاملیتنسیس……………………………………

1-10-8 استفاده از پروتئین CP24…………………………………………………………………

1-10-9 نتیجه گیری در مورد بهترین حالت ممکن واکسن انسانیبروسلاملیتنسیس…

1-10-10 مجوز استفاده از واکسنبروسلاابورتوسسویه RB51 برای استفاده در گاوها…

1-11 دیواره سلولی باکتری های گرم منفی……………………………………………………….

1-11-1 اندوتوکسین …………………………………………………………………………..

1-11-2 ساختمانLPS………………………………………………………………………

1-11-3 عملکردLPS………………………………………………………………………..

1-11-4 تاثیراتLPS………………………………………………………………………….

1-12نایسریا………………………………………………………………………………………………….

1-12-1 پورین های مننگوکوک………………………………………………………….

1-12-2PorA…………………………………………………………………………………..

فصل دوم: (سابقه وپیشینه تحقیق)

فصل سوم: (مواد و روشها)

3-1 وسایل مورد استفاده ……………………………………………………………………………….

3-2 مواد مورد استفاده……………………………………………………………………………………

3-3 روش کار ……………………………………………………………………………………………..

3-4 رنگ آمیزی گرم…………………………………………………………………………………….

3-5 طرز تهیه استوک ………………………………………………………………………………

3-6 روش استخراجDNAپلاسمیدی…………………………………………………………..

3-6-1 طرز تهیه محلولهای مورد نیاز برای استخراج پلاسمید…………………….

3-6-2 مراحل استخراجDNAپلاسمیدی……………………………………………….

3-7 الکتروفورز …………………………………………………………………………………………..

3-7-1 طرز تهیه ژل آگاروز……………………………………………………………………

3-7-2طرز تهیه بافرTBE(1X)…………………………………………………………….

3-8 بررسی بیان پروتئین……………………………………………………………………………..

3-9 نحوه آماده سازی جایگاه ژل…………………………………………………………………

3-10 روش تهیه بافر متراکم کننده…………………………………………………………….

3-11 روش تهیه بافرجداکننده ……………………………………………………………….

3-12 روش تهیه بافر تانک……………………………………………………………………..

3-13 آماده سازی الکتروفورز عمودی……………………………………………………………

3-13-1 آماده سازی پروتئین ………………………………………………………………

3-13-2 بارگذاری پروتئین………………………………………………………………….

3-14 رنگ آمیزی ژل.SDS-PAGE…………………………………………………………..

3-14-1 ساخت محلول رنگ………………………………………………………………

3-14-2 نحوه رنگ آمیزی…………………………………………………………………..

3-15 خالص سازی پروتئین نوترکیبE.coli………………………………………………..

3-16 شکستن سلولها برای آزادسازی پروتئین………………………………………………..

3-17 خالص سازی با ستون نیکل سفارز……………………………………………………….

3-17-1 مواد مورد نیاز برای تهیه بافرهای خالص سازی………………………..

3-18 بردفورد……………………………………………………………………………………………

3-18-1 تهیه معرف بردفورد…………………………………………………………..

3-19 جداسازیLPSبروسلا ملیتنسیس……………………………………………………….

3-19-1 پروتکل جدا سازیLPS……………………………………………………

3-19-2 تهیه محلول دیالیز یا بافرفسفات…………………………………………..

3-20 سنجش غلضتLPSبروسلا ملیتنسیس……………………………………………..

3-20-1 تهیهLPSمنحنی استاندارد………………………………………………….

3-21 روش کونژوگاسیونLPSباPorA…………………………………………………..

3-22 خالص سازی کونژوگاسیون………………………………………………………………..

 

فصل چهارم:(نتایج )

4-1 احیا باکتری نوترکیبPorA……………………………………………………………….

4-2 استخراجDNAپلاسمیدی ……………………………………………………………….

4-3 بررسی بیان پروتئین …………………………………………………………………………..

4-4 خالص سازی پروتئین نوترکیبPorA………………………………………………..

4-5 بردفورد…………………………………………………………………………………………….

4-6 جداسازیLPSبروسلا ملیتنسیس………………………………………………………

4-7 سنجش غلظتLPSبروسلا ملیتنسیس………………………………………………

4-8 کونژوگاسیونLPSباPorA………………………………………………………………

فصل پنجم: (بحث)…………………………………………………………………………………..

نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………….

منابع و ماخذ …………………………………………………………………………………………..

فهرست جدول ها

جدول1-1 طبقه بندی بروسلا……………………………………………………………………………………………

جدول 1-2 مقایسه بیماری زایی گونه های مهم بروسلا……………………………………………………….

جدول1-3 فراوانی شکایات بیماران مبتلا به بروسلوز بستری…………………………………………………

جدول1-4 فراوانی بعضی از یافته های بروسلوز طی چند فقره مطالعه…………………………………….

جدول 3-1 بافر جدا کننده 12%…………………………………………………………………………………………

جدول3-2 بافر متراکم کننده 6%…………………………………………………………………………………………

جدول3-3 بافر تانک………………………………………………………………………………………………………..

جدول3-4 تهیه معرف بردفورد………………………………………………………………………………………….

جدول3-5 تهیه معرف مورد استفاده در سنجشLPS…………………………………………………………..

فهرست شکل ها

شکل1-1 انواع سلولهایی که توسط باکتریبروسلا آبورتوسدر میزبان طبیعی و در میزبان تصادفی درگیر میشوند…………………………………………………………………………………………………………………….

شکل1-2 شکل فرضی از تعاملات باکتریبروسلا آبورتوسبا ماکروفاژ……………………………………

شکل 3-1 الکتروفورز با ژل پلی اکریل آمید…………………………………………………………………………..

شکل 4-1 کشت پارویی……………………………………………………………………………………………………..

شکل 4-2 DNA پلاسمیدی……………………………………………………………………………………………..

شکل4-3SDS-PAGE,PorA………………………………………………………………………………………..

شکل 4-4 باند خالص سازی شده PorA……………………………………………………………………………..

شکل 4-5 معادله منحنی استاندارد برای سنجش غلضت پروتئین خالص سازی شدهPorA………..

شکل4-6 باندهای LPSبروسلا ملیتنسیس…………………………………………………………………………….

شکل 4-7 معادله منحنی استاندارد سنجشLPS…………………………………………………………………..

چکیده

بروسلوز یکی از پنج بیماری عفونی مشترک بین انسان و دام است که در اثر آلودگی با باکتری های جنسبروسلابه وجود می آید .بروسلاها، باکتری های کوچک ، غیر متحرک ، گرم منفی کوکوباسیل و درون سلولی اختیاری که در طیف وسیعی از حیوانات ایجاد بیماری می کنند .بروسلاآبورتوسوبروسلاملی تنسیسعمده ترین گونه های عامل بروسلوز انسانی هستند.واکسنهای بروسلوز حیوانی شامل باکتریهای غیر فعال شده و یا سویه های زنده تخفیف حدت یافته دو مشکل اساسی در انسان ایجاد می کنند: نخست آنکه گاهی ایجاد بیماری مینمایند و دوم آنکه با واکنشهای ازدیاد حساسیت ناخواسته همراه اند. در همین راستا در سالهای اخیر ایمنی زایی با آنتی ژنهای مختلفی از گونه هایبروسلابه شکل مونووالان طبیعی کونژوگه و یا نوترکیب مورد مطالعه و بررسی قرار گرفته است.از بین عوامل ویرولانس این ارگانیسم ،لیپوپولی ساکارید(LPS) بعنوان عامل ویرولانس اصلی شناخته شده است و سویه های جهش یافته و فاقد این جزء از دیواره سلولی، فاقد ویرولانس و توان بقای درون سلولی هستند.همچنین LPS به لحاظ ایمونولوژیک آنتی ژن اصلی سطح سلولیبروسلامحسوب میشود. به همین دلیل امروزه استفاده از LPSبروسلابه دلیل داشتن خواص آنتی ژنیک و ایمونوژنیک قوی جهت طراحی و تولید یک واکسن موثر انسانی بسیار مورد ارزیابی و مطالعه قرار میگیرد.امروزه پژوهش های متعددی در زمینه واکسن های زیر واحدی مونووالانت و یا کونژوگه ،با جایگزینی اجزاء دیگر باکتری از جمله پروتئین های غشاء خارجی جهت ایجاد پاسخ های ایمنی وابسته به لنفوسیتTصورت گرفته است وزیکول غشاء خارجی مننگوکوک(OMV) متشکل از پروتئینهای کلاس 1 تا 4،فسفولیپید پلی ساکارید کپسولی و لیپواولیگوساکارید میباشد،این ماکرومولکول در خلال سیر رشد باکتری در بدن میزبان رها میشود و پژوهش ها نشان میدهد که نقش عمده ای را در القائ ایمنی حفاظت بخش پس از ابتلا به بیماری دارد.از مهمترین اجزائ این ماکرومولکول میتوان به PorA،از خانواده کلاس1 پروتئین غشائ خارجی اشاره نمود که توانایی ایجاد پاسخ های باکتریسیدی را دارد. علاوه بر این وجود سایر ترکیبات از جمله لیپوالیگوساکارید و فسفولیپیدها،دارای خاصیت آدجوانتی بوده و پاسخ حفاظتی مناسبی را در انسان ایجاد مینمایند.

در این مطالعه ویال لیوفلیزه، حاوی porA ای که داخلE.coliکلون شده بود احیا گردید سپس برای اطمینان از اینکه porA روی پلاسمید باکتری کلون شده است استخراج DNA پلاسمیدی انجام شد.در مرحله ی بعد بیان پروتئین porA انجام گردید و برای شناسایی و بررسی کیفیت و کمیت پروتئین ، با روش SDS-PAGE بررسی شد. برای بیشترین بیان ،خالص سازی پروتئین با ستون کروماتوگرافی (نیکل – سفاروز) انجام گردید وسپس با انجام بردفورد غلظت پروتئین بدست آمد.در مرحله ی بعد LPSبروسلا ملیتنسیسجداسازی گردید و برای بررسی کیفیت و کمیت آن با روش SDS-PAGE بررسی شد وسپس با انجام ازمایش غلظت LPS بدست آورده شد.در نهایت LPSبروسلا ملیتنسیسبا porAنیسریاکونژوگه گردید.

بیشترین بیان پروتئین porA در ساعت چهارم و پنجم در محدوده ی باند 65KD مشاهده شد . پس از خالص سازی پروتئین یک باند تک در محدوده ی 65KD مشاهده گردید و با انجام بردفورد غلظت پروتئین porA ،5 میکروگرم بر میلی لیتر بدست آمد.رویSDS-PAGE باندهای LPS مشاهده شد .با انجام ازمایش غلظت LPS ، 97/3میکروگرم برمیلی لیتر بدست آمد.

کلمات کلیدی:لیپوپلی ساکارید ، بروسلا ملیتنسیس، نیسریا مننژیتیدیس، وزیکول غشای خارجی (OMV) ،porA

فصل اول

مقدمه

1-1-طبقهبندی بروسلا:

بروسلاها جزء آلفا پرتئوباکتریا هستند و از نظر فیلوژنیک با باکتریهای پاتوژن و همزیست (از جمله ریزوبیوم و آگرباگتریوم) گیاهان ، پارازیت های داخل سلولی جانوران ( از جملهبارتونلاوریکتزیا) و فرصت طلب ها و آزادزیها مانند اوکراباکتریوم و کلوباکتر مرتبط می باشند .(کلاسن وهمکاران،1996؛ مورنو و همکاران ،2002 ؛ پریسنت و همکاران،2002 )

جنسبروسلابر اساس تفاوت آنتی ژنتیک ، میزبان اصلی ، کشت باکتری در محیط ها و شرایط فیزیکوشیمیایی مختلف ، واکنش با آنتی سرمهای اختصاصی و تشابهDNAبه هفت گونه تقسیم می گردد ، خصوصیات کلی این گونه ها در جدول( 1-1) آمده است . تاکنون 7 بیووار دربروسلاآبورتوس، 3 بیووار دربروسلاملی تنسیسو 5 بیوار در بروسلا سویسرا مشخص نموده اند . در سایر گونه ها تاکنون بیووار خاصی شناخته نشده است (مورنو و همکاران،2002 ؛یانگ،1995؛جاوتز و همکاران،1998؛کو و همکاران،2003)

جدول 1-1: طبقه بندی بروسلا

ی نوشته‌ها