………………………………………………………………………………………………… 23

2-2-1. دسته بندی روش های کروماتوگرافی …………………………………………………………………. 24

2-2-1-1. کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)…………………………………………………….. 24

2-2-1-2. دستگاه های کروماتوگرافی مایع …………………………………………………………………… 26

2-2-1-2-1.مخزن فاز متحرک…………………………………………………………………………………. 26

2-2-1-2-2. سیستم های پمپ کننده ………………………………………………………………………….. 27

2-2-1-2-3. سیستم های تزریق نمونه ………………………………………………………………………… 28

2-2-1-2-4. ستون های کروماتوگرافی مایع …………………………………………………………………. 28

2-2-1-2-4-1. انواع پر کننده های ستون ……………………………………………………………………. 29

2-2-1-2-5. دمای ستون ……………………………………………………………………………………….. 29

2-2-1-2-6. آشکارسازها ………………………………………………………………………………………. 30

2-2-1-2-6-1.آشکارساز فتومتریک …………………………………………………………………………. 31

2-2-1-2-6-2.آشکارساز جذب فرابنفش (UV)………………………………………………………….. 32

2-3.بررسی مطالعات دیگران در این زمینه ……………………………………………………………………. 33

2-4.بررسی داروی مورد مطالعه …………………………………………………………………………………. 36

2-4-1.مکانیسم اثر فارماکوکینتیک دارو………………………………………………………………………… 36

2-4-2.مکانیسم اثر………………………………………………………………………………………………….. 37

2-4-3. موارد مصرف …………………………………………………………………………………………….. 37

2-4-4.منع مصرف و احتیاط ……………………………………………………………………………………. 37

2-4-5.عوارض جانبی …………………………………………………………………………………………….. 38

2-4-6. تداخل ها …………………………………………………………………………………………………… 38

2-4-7.دوز مصرفی ……………………………………………………………………………………………….. 38

2-5. میکرواستخراج سه فازی بر پایه استفاده از فیبر توخالی متخلخل………………………………….. 38

2-5-1.از دلایل انتخاب این روش………………………………………………………………………………. 39

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1.مواد شیمیایی و تجهیزات دستگاهی……………………………………………………………………….. 41

3-2-1. مواد شیمیایی، استانداردها و نمونه های حقیقی …………………………………………………….. 41

3-2-2.تجهیزات دستگاهی ………………………………………………………………………………………. 41

3-3.روش استخراج ………………………………………………………………………………………………… 42

3-3-1.استخراج به اختصار طی مراحل زیر انجام گرفت…………………………………………………… 42

3-3-2. مراحل بهینه سازی ……………………………………………………………………………………….. 43

3-3-2-1. بهینه سازی شرایط جداسازی……………………………………………………………………….. 43

3-3-2-2. بهینه سازی شرایط استخراج ……………………………………………………………………….. 43

3-3-2-2-1.نوع حلال آلی …………………………………………………………………………………….. 44

3-3-2-2-2.اثرpHفاز دهنده ……………………………………………………………………………………. 44

3-3-2-2-3.اثرpHفاز گیرنده …………………………………………………………………………………… 44

3-3-2-2-4.اثر قدرت یونی فاز دهنده ………………………………………………………………………. 44

3-3-2-2-5.اثر هم زدن محلول آنالیت ………………………………………………………………………. 44

3-3-2-2-6.اثر زمان استخراج …………………………………………………………………………………. 44

3-3-3. ارزیابی کارایی روش استخراج ……………………………………………………………………….. 45

3-3-3-1. منحنی درجه بندی ……………………………………………………………………………………. 45

3-3-3-2.تعیین فاکتور پیش تغلیظ (PF) ……………………………………………………………………. 45

3-3-3-3. تعیین تکرارپذیری (RSD) ………………………………………………………………………… 46

3-3-4.آنالیز نمونه حقیقی ……………………………………………………………………………………….. 46

فصل چهارم: نتایج

4-1. میکرواستخراج سه فازی بر پایه استفاده از فیبر توخالی متخلخل …………………………………. 48

4-2. مراحل بهینه سازی…………………………………………………………………………………………….. 48

4-2-1. بهینه سازی شرایط HPLC………………………………………………………………………………. 48

4-2-2. بهینه سازی شرایط استخراج ……………………………………………………………………………. 49

4-2-2-1.نوع حلال آلی………………………………………………………………………………………….. 49

4-2-2-2.طراحی آزمایش………………………………………………………………………………………… 51

4-2-2-2-1. غربال گری …………………………………………………………………………………………. 51

4-2-2-2-2. طراحی بهینه سازی ………………………………………………………………………………. 55

4-2-2-2-3. خلاصه نتایج بهینه سازی ……………………………………………………………………….. 59

4-3. تعیین پارامترهای تجزیه ای روش استخراج …………………………………………………………….. 59

4-3-1.تهیه منحنی درجه بندی …………………………………………………………………………………… 59

4-3-2.فاکتور پیش تغلیظ (PF) و درصد بازیابی (R%) …………………………………………………. 60

4-3-3.تعیین حد تشخیص (LOD) …………………………………………………………………………… 61

4-3-4. تکرارپذیری روش (RSD) ……………………………………………………………………………. 62

4-4.آنالیز نمونه ادرار و پلاسما ………………………………………………………………………………….. 62

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

5-1. بحث و نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………… 66

5-2. پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………… 69

منابع……………………………………………………………………………………………………………………..70

خلاصه انگلیسی ……………………………………………………………………………………………………..82

ضمایم………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….82

فهرست جداول

عنوان صفحه

جدول 2-1. کاربردهای کروماتوگرافی تقسیمی ……………………………………………………………… 25

جدول 2-2. کاربردهای اخیر HF-LPME در استخراج گونه های مختلف ……………………………… 33

جدول 4-1. سطوح پایین و بالای مربوط به فاکتورهای بررسی شده ……………………………………. 52

جدول 4-2. آزمایشات طراحی شده پلاکت- بورمان جهت شناسایی فاکتورهای مهم تاثیرگذار بر روی نتایج SBME-HPLC برای جداسازی و اندازه گیریdonepezil…………………….. 52

جدول 4-3. آزمایشات طراحی شده باکس- بهکن جهت بهینه سازی فاکتورهای موثر بر SBME…. 55

جدول 4-4. خلاصه نتایج بهینه سازی استخراج……………………………………………………………….. 59

جدول 4-5. ارقام شایستگی SBME داروی دونپزیل……………………………………………………….. 62

جدول 5-1. مقایسه روش ارائه شده با سایر روش های استخراجی……………………………………….. 66

فهرست اشکال

عنوان صفحه

شکل ( الف ). روش های استخراج و میکرواستخراج ………………………………………………………….. 3

شکل 2-1. نمای جانبی از سیستم میکرواستخراج با حلال با استفاده از میله تفلونی …………………. 11

شکل 2-2. نمای جانبی از سیستم میکرواستخراج با تک قطره الف)استخراج مستقیم ازدرون محلول

ب)استخراج از فضای فوقانی ……………………………………………………………………………………………. 13

شکل 2-3. اصول استخراج HF-LPME (الف) دو فازی (ب) سه فازی ………………………………. 14

شکل 2-4. (الف) سیستم HF-LPME بر اساس پیکربندی (ب) پیکربندی میله ای U………………… 17

شکل 2-5. طرح شماتیک از سیستم HF-LPME…………………………………………………………….. 18

شکل 2-6. (الف): شمایی از سیستم HF-LPME از حجم زیاد (ب) سیستم نیمه خودکار …………. 19

شکل 2-7. طرح شماتیک میکرواستخراج فاز مایع به روش مستقیم (الف) و (ب) فضای فوقانی .. 21

شکل 2-8. شمایی از یک دستگاه HPLC……………………………………………………………………… 26

شکل 2-9. یک حلقه نمونه برداری کروماتوگرافی مایع …………………………………………………….. 28

شکل 2-10. سلول آشکارساز فرابنفش برای HPLC………………………………………………………… 32

شکل 2-11. ساختار شیمیایی دونپزیل …………………………………………………………………………. 36

شکل 4-1.کروماتو گرام تزریق مستقیم 1میلی گرم بر لیتر محلول ابی دونپزیل ………………………… 49

شکل 4-2. بررسی نوع حلال پر کننده منافذ فیبر ……………………………………………………………. 50

شکل 4-3. نمودار Pareto chart مربوط به طراحی پلاکت- بورمان …………………………………….. 54

شکل 4-4. نمودار مربوط به میزان و نحوه تغییر سطوح فاکتورهای موثر انتخاب شده ………………. 56

شکل 4-5. نمودار پاسخ سطحی تخمینی و خطوط کانتور به دست آمده از فاکتورهای موثر در کارایی استخراج donepezil توسط روش SBME-HPLC………………………………………………………………………………………. 57

شکل 4-6. منحنی درجه بندی در شرایط بهینه SBME 59

شکل 4-7. منحنی درجه بندی در محیط آبی حاصل از تزریق دارو قبل از استخراج ………………………………… 60

شکل 4-8. منحنی درجه بندی تزریق مستقیم ………………………………………………………………….. 61

شکل 4-9. کروماتوگرام نمونه ادرار حاوی 10 میکروگرم بر لیتر دارو………………………………….. 63

شکل 4-10. کروماتوگرام نمونه پلاسما حاوی 10 میکروگرم بر لیتر دارو……………………………… 64

 

خلاصه فارسی

داروی دونپزیل یک مهار کننده مرکزی آنزیم استیل کولیناستراز است که در موارد خفیف تا شدید بیماری آلزایمر بهکار می رود. همچنین در برخی موارد در درمانبیش فعالیو نیز موارد دمانس مرتبط با پارکینسون مورد استفاده قرار می گیرد.

2-1 بیوانفورماتیک و نقش آن در زیست­فناوری

3

1-2-1 پایگاه­داده

4

1-1-2-1 جایگاه Expasy

4

2-1-2-1 پایگاه­داده Swiss-Prot

7

3-1-2-1- پایگاه­دادهProsite یا پایگاه­داده موتیف­ها

9

3-1 کاربرد بیوانفورماتیک در پیش­گویی ساختار پروتئین

9

1-3-1 پیش­گویی ساختار دوم پروتئین­ها

10

2-3-1 پیش­گویی ساختار سوم پروتئین­ها

11

4-1 نمایش ساختار پروتئین

11

5-1 مقایسه ساختار سوم پروتئین­ها

12

6-1 فلزات سنگین و اثرات زیست­محیطی آنها

14

7-1 منابع تولید کننده آلودگی­های فلزات سنگین

16

8-1 کادمیوم

16

9-1 حذف فلزات سنگین از محیط­زیست

17

1-9-1 روش­های فیزیکوشیمیائی

17

1-1-9-1 روش اسمز معکوس

17

2-1-9-1 روش دیالیز الکتریکی

17

3-1-9-1 روش اولترا فیلتراسیون

18

4-1-9-1 تبادل یونی

18

5-1-9-1 رسوب­دهی شیمیایی

18

2-9-1 روشهای پاکسازی زیستی

18

1-2-9-1 پاکسازی گیاهی

18

2-2-9-1 جذب زیستی

19

1-2-2-9-1 سازکار­های جذب زیستی

19

1-1-2-2-9-1 فرایند رسوب و تجمع خارج سلولی

20

1-1-1-2-2-9-1 جذب الکتریکی

20

2-1-1-2-2-9-1 جذب فیزیکی یا جذب با دخالت نیروهای واندروالس

20

3-1-1-2-2-9-1 جذب شیمیایی

20

2-1-2-2-9-1 رسوب وتجمع داخل سلولی

20

1-2-1-2-2-9-1 متیله­کردن فلز

21

2-2-1-2-2-9-1 سولفوره کردن

21

3-2-1-2-2-9-1 رسوب فلزات مسموم کننده به صورت غیرمستقیم

21

10-1سازکار­های ورود فلزات سنگین به ریزسازواره­ها

23

11-1 پروتئین­ها و پپتیدهای عمومی متصل شونده به فلزات سنگین

26

12-1 نمایش سطحی باکتریایی

27

1-12-1 نمایش­سطحی در باکتری­های گرم­منفی

29

2-12-1 نمایش پروتئین­های هترولوگ در باکتری­های گرم مثبت

30

13-1 افزایش جذب­زیستی فلزات سنگین در باکتری­های گرم منفی با روش­های مهندسی ژنتیک با تاکید بر نمایش­سطحی

33

14-1 سازکار تشکیل پیلی باکتریایی

36

1-14-1 پیلی­های باکتریایی و پیلی CS3

39

1-1-14-1 سازمان دهی ژنتیکی اپرونcst

40

2-1-14-1 تنظیم بیان CS3

40

15-1 اهداف تحقیق

فصل دوم: مواد و روش­ها

42

1-2 بررسی­های بیوانفورماتیکی

42

1-1-2 پایگاه­های­داده و برنامه­های بیوانفورماتیکی

43

2-1-2 ساختار پروتئین و روش­های پیش­گویی عملکرد

43

1-1-2-1-2 جستجوی (شباهت) در پایگاه­داده توالی

43

1-1-2-1-2 جستجوی (شباهت) در پایگاه­داده توالی

43

3-1-2 روش­های آنالیز ساختار اول

44

4-1-2 روش­ها و برنامه­ی پیش­گویی ساختار و عملکرد پروتئین

46

5-1-2 ابزارهای مشاهده و آنالیز ملکولی

47

2-2 روش­های بیوانفورماتیکی

47

1-2-2 پیش­گویی ساختار دوم

47

2-2-2 پیش­گویی ساختار سوم پروتئین­ها و مدل­سازی

49

1-2-2-2 جستجوی توالی­های مشابه با PSI-Blast و Blast در مقابل پایگاه­داده PDB

49

2-2-2-2 مدل­سازی مقایسه­ای

49

1-2-2-2-2 سرور SWISS-MODEL

50

2-2-2-2-2 مدل­سازی با برنامه Modeller

51

3-2-2-2 مدل­سازی براساس روش شناسایی تاخوردگی

52

4-2-2-2 شبیه سازی دینامیک مولکولی با استفاده از نرم افزار GROMACS

52

5-2-2-2 تغییرات RMSD

52

1-5-2-2-2اندازه گیری RMSD با نرم افزار Swiss-pdb viewer

53

2-4-2-2-2اندازه­گیری RMSD با برنامه تحت شبکه CE

53

3-2-2 پیش­گویی سطوح در دسترس و سطوح مشترک بین دو پروتئین

54

3-2 مواد

54

1-3-2 ترکیبات استفاده­شده

54

2-3-2 آنتی بیوتیک ها

54

3-3-2 آنتی­بادی­های اولیه

54

4-3-2 آنتی­بادی­های ثانویه

54

5-3-2 باکتری­ها

55

6-3-2 پلاسمیدها

57

7-3-2 اولیگونوکلئوتیدها

58

8-3-2 کیت­های آزمایشگاهی

59

9-3-2 آنزیمها

59

10-3-2 نشانگر­ها

59

11-3-2 محلول­ها و بافرها

60

12-3-2 محیط­های کشت

60

1-12-3-2 محیط­های­کشت CFA آگار

60

13-3-2 محلول های مورد نیاز برای تهیه سلول های باكتریایی مستعد

60

14-3-2 محلول­های مورد نیاز به منظور نگهداری باکتری­ها

60

4-2 وسایل و دستگاه­ها

61

5-2 روش­ها

61

1-5-2 کشت باکتری

61

2-5-2 استخراج پلاسمید

61

1-2-5-2 استخراج پلاسمید با روش شکستن قلیایی

62

3-5-2 استخراج DNA پلاسمیدی با استفاده از کیت

62

4-5-2 بازیافت قطعات DNA از روی ژل­آگارز با استفاده از کیت

62

6-5-2 تهیه باکتریهای مستعد برای پذیرش DNA پلاسمید خارجی

62

1-6-5-2 مستعد سازی باکتری­ها

63

7-5-2 انتقال پلاسمید به درون باکتری

64

8-5-2 واکنش زنجیره­ای پلی­مراز(Polymerase chain reaction, PCR)

64

1-8-5-2 SOEing-PCR (Splicing by overlap extension PCR)

67

1-1. 9-5-2 کلونینگ ژن جهش یافته cstHدر وکتورpBR322

68

10-5-2 تائید صحت کلون­های واجد پلاسمید نوترکیب (Screening)

69

11-5-2 بررسی پروتیئن­ها

69

1-11-5-2 استخراج پروتیئن پیلی از باکتری

70

2-11-5-2 سنجش پروتیئن به روش برادفورد(Baradford)

70

1-2-11-5-2 رسم منحنی استاندارد پروتئین

71

3-11-5-2 وسترن­بلاتینگ (Western Blotting)

71

4-11-5-2 لکه­گذاری برای سلولهای باکتری

72

12-5-2 رنگ آمیزی ایمینوفلوروسنس

73

13-5-2 بررسی میزان جذب یون فلز

73

14-5-2 ویژگی­های پلاسمیدهای استفاده­شده در این مطالعه

74

15-5-2 بررسی های آماری

فصل سوم: نتایج

76

1-3 نتایج بررسی های بیوانفورماتیکی

76

1-1-3 شناسایی و طراحی موتیف(پپتید) متصل شونده به فلزات

80

2-1-3 آنالیز ساختاری پروتئین CstH جهت پیش­گویی جایگاه مجاز در آن

80

1-2-1-3 شناسایی الگو و همردیفی توالی الگو–هدف

87

2-2-1-3 تولید و ساخت مدل و ارزیابی کیفیت آنها

90

3-2-1-3 سطوح قابل دسترس و اسیدهای­آمینه سطحی

93

4-2-1-3 سطوح مشترک و اسیدهای­آمینه درگیر در ارتباطات زیرواحدها در پلیمر پیلی و زیرواحد–چاپرون

94

5-2-1-3 پیش­گویی و تعیین ساختار دوم

96

3-1-3 پیش­گویی نهایی مناطق مجاز در زیرواحد CstH

96

4-1-3 مدل­سازی پروتئین­های هیبرید

98

2-3 نتایج آزمایشگاهی

98

1-2-3 ساخت کاست های ژنی از ترکیب ژنcstHو توالی متصل شونده به کادمیوم

101

2-2-3 کلونینگ DNA زیر­واحد اصلی(CstH) جهش­یافته در وکتور کلونینگ

103

1-2-2-3 غربالگری کلون­های دارای پلاسمید­های نوترکیب

103

1-1-2-2-3 غربالگری با مقاومت آنتی­بیوتیکی و مقایسه وزنی با پلاسمیدهای کنترل

103

2-1-2-2-3 غربالگری با PCR

105

3-1-2-2-3 برش آنزیمی

105

4-1-2-2-3 تعیین توالی ژن­هایCstH::CbmوCstH::Cbβmدر کلون­های نوترکیب

106

3-2-3 کلونینگ ژن­هایcstH::cbmوcstH::cbβmدر اپرون cst

108

1-3-2-3 غربال کردن کلون های حاوی اپرون هیبریدcst::cbmوcst::cbbm

109

1-1-3-2-3 تائید صحت کلونینگ با برش آنزیمی

110

2-1-3-2-3 تائید کلونیگ با PCR

112

4-2-3 بررسی بیان پیلی­های هیبرید CS3::cbβm و CS3::cbm توسط روش­های دات­بلاتینگ باکتری و وسترن پروتئین

113

1-4-2-3 دات بلاتینگ باکتری

114

2-4-2-3 وسترن بلاتینگ

115

5-2-3 بررسی نمایش سطحی پیلی­های هیبرید CS3::cbβm و CS3::cbm توسط رنگ­آمیزی ایمونوفلورسانس

117

6-2-3 بررسی خاصیت اتصال به فلز باکتری­های بیان کننده پیلی CS3 نوترکیب

119

1-6-2-3 جذب کادمیم

120

2-6-2-3 اختصاصیت اتصال

فصل چهارم: بحث و نتیجه­گیری

123

1-4 مزیت بیان سطحی بر سایر سیستم­های بیان پروتئین

124

2-4 کاربرد پیلی CS3 جهت نمایش سطحی و نقش مطالعات بیوانفورماتیکی در شناسایی مناطق مجاز ورود پپتیدهای بیگانه در آن

129

3-4 مقایسه موتیف­های طراحی­شده جهت جذب یون کادمیوم توسط باکتری­های نوترکیب ساخته­شده در این پروژه با مطالعات پیشین

135

4-4 پیشنهادات

136

منابع

144

پیوست­ها

فهرست جدول­ها

عنوان	صفحه
جدول 1-1. موتیف­های حفظ شده و اختصاصی متصل شونده به یونهای فلزی	8
جدول 1-2. مهمترین صنایع تولید كننده فاضلاب حاوی فلز سنگین	15
جدول 1-3. خانواده­های مهم پروتئین­های دخیل در نقل وانتقالات فلزات سنگین در باکتری­ها	22
جدول1 -4. ارگانل­های سطحی باکتریایی که از طریق مسیر چاپرون-آشر اسمبل می­شوند	35
جدول 1-5. خلاصه ای از اپی توپ­ها و موتیف­های ارائه شده توسط پیلی­ها	38
جدول 2-1. پایگاه­های­داده و برنامه­های بیوانفورماتیکی	42
جدول 2-2.ابزارهای مقایسه توالی	43
جدول 2-3. ابزارهای آنالیز توالی اول پروتئین	43
جدول 2-4. روش­های جستجوی پروفایل و پترن	44
جدول 2-5. ابزارهای پیش­گویی ساختار دوم	44
جدول 2-6. ابزارها و روش های پیش­گویی ساختار سوم	45
جدول 2-7. ابزارهای آنالیز و مشاهده ملکولی	46
جدول 2-8. مشخصات پلاسمیدهای استفاده شده و یا ساخته شده در این تحقیق	56
جدول 2-9. مشخصات اولیگونوکلئوتید­های استفاده شده در این تحقیق	57
جدول 2-10. ترکیبات استفاده شده در یک واکنش SOEing-PCR	65
جدول 2-11. واكنش برش آنزیمی پلاسمید pPR322	67
جدول 2-12. تركیبات مورد استفاده برای واكنش الحاق	68
جدول 3-1 توالی اسید آمینه ای زیرواحد اصلی و چاپرون دو سیستم CS3 و کپسول آنتی­ژنی F1	81
جدول 3-2. ویژگیهای ساختاری الگو-هدف که توسط روش­های محاسباتی به همراه امتیازات نمره­دهی بدست آمده­است	87
جدول 3-3. مناطق و اسیدهای­آمینه درگیر در ارتباطات ملکولی و غیرقابل دسترس ملکول CstH	94
جدول 3- 4. اثر رقابتی یونهای Ni2+,Cu2+و Cr3+بر جذب Cd2+در حضور کادمیوم	121
4 -1. مقایسه میزان جذب یون کادمیم در سیستم­های نمایش­سطحی مختلف و نتایج حاصل از این تحقیق	133

فهرست شکل­ها

ی نوشته‌ها

……………………. 21

1-7. بیماری زایی سیاه سرفه ………………………………………………………………………………………………………………. 21

1-8. علائم کلینیکی ………………………………………………………………………………………………………………………………. 22

1-9.تشخیص بیماری…………………………………………………………………………………………………………………………….. 23

1-9-1. تشخیص بالینی………………………………………………………………………………………………………………………….. 23

1-9-2. علائم کلینیکی در نوزادان…………………………………………………………………………………………………………. 24

1-9-3. کودکان، نوجوانان و بزرگسالان………………………………………………………………………………………………….. 25

1-10. پاسخ ایمنی در برابر سیاه سرفه ………………………………………………………………………………………………… 26

1-10-1. پاسخ ایمنی همورال………………………………………………………………………………………………………………… 27

1-10-2. پاسخ ایمنی سلولی…………………………………………………………………………………………………………………. 28

1-11. روش های آزمایشگاهی تشخیص………………………………………………………………………………………………… 30

1-11-1. کشت………………………………………………………………………………………………………………………………………… 30

1-11-2. سرولوژی………………………………………………………………………………………………………………………………….. 30

1-11-3. PCR …………………………………………………………………………………………………………………………………….. 32

1-12. مدیریت بیماری…………………………………………………………………………………………………………………………….. 33

1-13. پیشگیری …………………………………………………………………………………………………………………………………….. 34

1-13-1. راهبردهای بالقوه در مهار بیماری سیاه سرفه در اوایل نوزادی……………………………………………. 35

1-13-1-1. واکسیناسیون بالغین و سالمندان……………………………………………………………………………………… 37

1-13-1-2. حفاظت غیرمستقیم نوزادان از طریق واکسیناسیون والدین………………………………………….. 37

1-13-1-3. ایمن سازی نوزادان و کودکان…………………………………………………………………………………………… 38

1-13-1-4. واکسیناسیون مادر در دوران بارداری……………………………………………………………………………….. 38

1-14. استراتژی های واکسن………………………………………………………………………………………………………………….. 39

1-14-1. واکسن غیر سلولی سیاه سرفه………………………………………………………………………………………………. 39

1-14-2. واکسن سلولی سیاه سرفه………………………………………………………………………………………………………. 40

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

2-1. تاریخچه تولید واکسن سیاه سرفه…………………………………………………………………………………………………. 42

2-1-1. تعریف تست كنترل سمیت زدایی (MWGT) ……………………………………………………………………. 43

2-1-2. تعریف تست حفاظتی داخل مغزی موش (تست توانمندی Potency test) …………………… 44

2-1-3. ابداع روش کشت……………………………………………………………………………………………………………………….. 44

2-1-4. جداسازی سلول باکتری از کشت……………………………………………………………………………………………… 45

2-2. تاریخچه تولید واکسن سیاه سرفه در انستیتو رازی…………………………………………………………………….. 46

2-3. غیرفعال سازی سوسپانسیون سلولی باکتری سیاه سرفه…………………………………………………………….. 47

2-3-1. استفاده از فرمالین و تیومرسال برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه…………. 47

2-3-2. استفاده از گلوتار آلدهید برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه……………………. 49

2-3-3. استفاده از حرارت برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه……………………………….. 49

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1. تجهیزات و وسایل ………………………………………………………………………………………………………………………….. 51

3-2. مواد و محیط ها ……………………………………………………………………………………………………………………………… 52

3-2-1. محیط کشت آگار بورده ژانگو……………………………………………………………………………………………………. 52

3-2-2. محیط کشت وِروِی…………………………………………………………………………………………………………………….. 53

3-2-3. محیط B₂…………………………………………………………………………………………………………………………………… 54

3-2-4. محیط کشت سویابین کازئین…………………………………………………………………………………………………… 54

3-2-5. محیط تیوگلیکولات براث………………………………………………………………………………………………………….. 55

3-3. روش کار …………………………………………………………………………………………………………………………………………. 56

3-3-1. انتخاب سویه های بوردتلا پرتوسیس……………………………………………………………………………………….. 56

3-3-1-1. لیوفیلیزه کردن……………………………………………………………………………………………………………………… 56

3-3-2. کشت باکتری سیاه سرفه………………………………………………………………………………………………………….. 56

3-3-2-1. کشت تجدید حیات روی محیط بورده ژانگو………………………………………………………………………. 56

3-3-2-2. کشت بذر روی محیط وِروِی………………………………………………………………………………………………… 57

3-3-2-3. مراحل انجام کشت فرمانتوری باکتری سیاه سرفه…………………………………………………………….. 57

3-3-2-3-1. استریلیزاسیون فرمانتور…………………………………………………………………………………………………… 57

3-3-2-3-2. آماده سازی و بهینه سازی محیط کشت فرمانتوری……………………………………………………… 58

3-3-2-3-3. تلقیح بذر به محیط کشت در فرمانتور…………………………………………………………………………… 58

3-3-3. جداسازی باکتری سیاه سرفه از محیط کشت…………………………………………………………………………. 59

3-3-3-1. جداسازی سلول باکتری با استفاده از سانتریفوژ…………………………………………………………………. 59

3-3-3-2. جداسازی سلول باکتری با استفاده از سیستم میکرو فیلتراسیون……………………………………. 59

3-3-4. غیرفعال سازی سلول باکتری سیاه سرفه………………………………………………………………………………… 60

3-3-5. سمیت زدایی سوسپانسیون باکتری سیاه سرفه………………………………………………………………………. 60

3-3-5-1. سمیت زدایی با استفاده از فرمالین……………………………………………………………………………………… 61

3-3-5-2. سمیت زدایی با استفاده از تیومرسال………………………………………………………………………………….. 61

3-3-6. تست های کنترلی سوسپانسیون سیاه سرفه…………………………………………………………………………… 61

3-3-6-1. تست استریلیتی……………………………………………………………………………………………………………………. 61

3-3-6-2. تست کنترل غیرفعال بودن باكتری…………………………………………………………………………………….. 62

3-3-6-3. تست کنترل سمیت زدایی (MWGT) …………………………………………………………………………… 62

3-3-6-4. تست توانمندی……………………………………………………………………………………………………………………… 62

فصل چهارم: نتایج

4-1. تجدید حیات بذر بر روی محیط بورده ژانگو………………………………………………………………………………… 64

4-2. تهیه بذر در محیط وِروِی……………………………………………………………………………………………………………….. 64

4-3. کشت فرمانتوری باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن……………………………………………………………… 64

4-4. جداسازی باکتری سیاه سرفه از کشت………………………………………………………………………………………….. 67

4-5. غیرفعال سازی و سمیت زدایی باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن……………………………………… 69

4-5-1. سمیت زدایی با فرمالین…………………………………………………………………………………………………………….. 69

4-5-2. سمیت زدایی با تیومرسال…………………………………………………………………………………………………………. 69

4-6. آزمایش های کنترلی سوسپانسیون های سیاه سرفه……………………………………………………………………. 69

4-7. نتایج حاصل از آزمون MWG در کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفه

سمیت زدایی شده با فرمالین و تیومرسال…………………………………………………………………………………………….. 72

4-8. آزمون MWG و مقایسه تغییرات اوزان موش ها……………………………………………………………………….. 75

4-9. تست توانمندی واکسن های آزمایشی سیاه سرفه……………………………………………………………………….. 80

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

بحث ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 83

نتیجه گیری و پیشنهادات ………………………………………………………………………………………………………………………. 88

منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 89

خلاصه انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………………………………. 97

ضمایم ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 98

فهرست جداول

عنوانصفحه

جدول1-1. آنتی ژن های مختلف سیاه سرفه…………………………………………………………………………………………… 9

جدول1-2. علائم کلینیکی بیماری سیاه سرفه……………………………………………………………………………………… 26

جدول1-3. آنتی بیوتیک های مورد استفاده در درمان سیاه سرفه حاد و رژیم مصرف آن……………….. 34

جدول1-4. واکسیناسیون سیاه سرفه در کشورهای مختلف…………………………………………………………………. 36

جدول2-1. ترکیب محیط لیستر و B₂بر اساس گرم در لیتر…………………………………………………………….. 45

جدول3-1. لیست دستگاه ها و تجهیزات مورد استفاده………………………………………………………………………… 51

جدول3-2. لیست مواد و محیط های مورد استفاده در تولید واکسن سیاه سرفه………………………………. 52

جدول3-3. ترکیبات محیط بورده ژانگو………………………………………………………………………………………………….. 53

جدول3-4. ترکیبات محیط کشت وِروِی………………………………………………………………………………………………… 53

جدول3-5. ترکیبات محیط کشت B₂…………………………………………………………………………………………………… 54

جدول3-6. ترکیبات محیط کشت سویابین کازئین………………………………………………………………………………. 55

جدول4-1. اطلاعات دوره كشت باكتری سیاه سرفه برای تولید واكسن…………………………………………….. 68

جدول4-2. نتایج حاصل از انجام آزمایش های غیرفعال سازی و استریلیتی سوسپانسیون های باكتری سیاه سرفه سمیت زدایی شده با فرمالین……………………………………………………………………………………………………………………………….. 70

جدول4-3. نتایج حاصل از انجام آزمایش های غیرفعال سازی و استریلیتی سوسپانسیون های باكتری سیاه سرفه سمیت زدایی شده با تیومرسال…………………………………………………………………………………………………………………………….. 71

جدول4-4. نتایج حاصل از کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با فرمالین و تیومرسال با استفاده از آزمون MWG………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 73

جدول4-5. نتایج كنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با فرمالین با استفاده از آزمون MWG 76

جدول4-6. نتایج كنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با تیومرسال با استفاده از آزمون MWG 77

جدول4-7. نتایج حاصل از انجام تست توانمندی برای شش واکسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین (FDV) 80

جدول4-8. نتایج حاصل از انجام تست توانمندی برای شش واکسن تجربی سمیت زدایی شده با تیومرسال (TDV) 81

فهرست نمودارها

عنوان صفحه

نمودار1-1. مقایسه تعداد افراد زیر یک سال ایمن شده با واکسن DTP در سه کشور مختلف در سال

2000 تا 2010 ………………………………………………………………………………………………………………………………………. 6

نمودار4-1. تغییرات pH کشت سویه 134 از باکتری سیاه سرفه در طول دوره رشد درفرمانتور….. 65

نمودار4-2. تغییرات pH کشت سویه 509 از باکتری سیاه سرفه در طول دوره رشد درفرمانتور….. 65

نمودار4-3. مقایسه­ی میانگین جذب نوری در طول موج های530 و590 در مقدار جرم باكتری در هنگام برداشت در بچ های مختلف سویه 134 و 509……………………………………………………………………………………………………………… 66

نمودار4-4. مقدار غلظت نهایی باكتری سیاه سرفه (cell10⁹×1) سویه 134 در پایان دوره كشت در هنگام برداشت 66

نمودار4-5. مقدار غلظت نهایی باكتری سیاه سرفه (cell10⁹×1) سویه 509 در پایان دوره كشت در هنگام برداشت67

نمودار4-6. مقایسه دوره ی سمیت زدایی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفه سویه 134 توسط فرمالین و تیومرسال با استفاده از تست MWG ……………………………………………………………………………………………………………………….. 74

نمودار4-7. مقایسه دوره ی سمیت زدایی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفه در سویه 509 توسط فرمالین و تیومرسال با استفاده از تست MWG……………………………………………………………………………………………………………………….. 74

نمودار4-8. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با واكسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین نسبت به تیومرسال در سویه 134……………………………………………………………………………………………………………………………………………. 78

نمودار4-9. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با واكسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین

نسبت به تیومرسال در سویه 509………………………………………………………………………………………………………. 78

نمودار4-10. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با سوسپانسیون های سمیت زدایی شده سویه 134 با تیومرسال و فرمالین نسبت به موش های گروه كنترل………………………………………………………………………………………………..79

2-1-8- كارآفرینی روستایی.. 23

2-1-9- توسعه. 23

2-2-1- تاریخچه و مبانی نظری مطالعات فقر. 26

2-2-2- دیدگاه های مرتبط با کارآفرینی.. 30

2-2-3- دیدگاه جامعه شناختی و جمعیت شناختی.. 30

2-2-4- دیدگاه روانشناختی.. 31

2-2-5- دیدگاه اقتصادی (کارآفرینی درون تئوری اقتصادی) 31

2-2-6- دیدگاه توسعه ای و محیطی.. 33

2-2-7- دیدگاه نهادی.. 33

2-3-1- دیدگاه روانشناختی.. 34

2-3-2- دیدگاه جامعه شناختی.. 34

2-3-3- دیدگاه علوم سیاسی.. 35

2-4-1- رویکردهای نظری توانمندسازی.. 36

2-4-2- فرآیند توانمندسازی.. 37

2-4-3- چارچوب توانمندسازی.. 38

2-4-4- حوزه های توانمندسازی مددجویان.. 40

2-4-5- ساماندهی افراد و ایجاد تشکل.. 42

2-4-6- رویكردهای سازمانی.. 43

2-4-7- نظریه های گونه ی اول. 44

2-4-8- نظریه های گونه ی دوم. 45

2-4-9- نظریه های گونه ی سوم. 45

2-4-10- نظریه های گونه ی چهارم. 45

2-4-11- نوع شناسی کمیته امداد امام خمینی (ره) 46

2-4-12- اهمیت موضوع توانمندسازی در کمیته امداد امام خمینی (ره) 48

2-4-13- جایگاه کمیته امداد در توانمندسازی مددجویان تحت پوشش این نهاد. 49

2-4-14- توانمندسازی مددجویان.. 50

2-4-15- عوامل موثر بر توانمندسازی خانواده های تحت حمایت کمیته امداد. 51

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1-1- موقعیت، حدود و وسعت منطقه مورد مطالعه. 56

3-1-2-توپوگرافیو ژئومورفولوژی.. 58

3-1-3- اقلیم. 59

3-1-4- منابع آب.. 64

3-2-1- جمعیّت و ویژگیهای آن.. 70

3-4-1- روش پژوهش…. 76

3-4-2- جامعه آماری و تعداد نمونه. 77

3-4-3- شاخصهای تحقیق.. 80

3-4-4- روش و ابزار گردآوری دادهها و اطلاعات.. 83

3-4-5- شیوه تجزیه و تحلیل داده‎ها 83

3-4-6- مدل تصمیم‎گیری چند شاخصه (MCDM) 84

3-4-7- فرآیند تحلیل سلسله مراتبی (AHP) 86

3-4-8- روایی و پایایی ابزار تحقیق.. 90

فصل چهارم: یافته­های تحقیق

4-1-1- وضعیت سنی پاسخگویان.. 94

4-1-2- وضعیت جنسی.. 96

4-3-1- وضعیت سواد. 96

4-2-1- علل قرار گرفتن تحت پوشش کمیته امداد. 98

4-2-2- روند تغییرات خانوارهای تحت پوشش کمیته امداد. 99

4-3-3- شدت اثرات موانع یا محدودیتهای مطرح در توانمندسازی خانوارهای روستایی………………………..103

فصل پنجم: جمع­بندی و نتیجه گیری

فصل ششم: فهرست منابع

1-6- منابع ……………………………………………………………………………………………………………………………….121

2-9-2- عفونت حفره دهانی.. 31

2-9-3- عفونت مجاری تنفسی.. 31

2-9-4- سرطان مقعد. 31

2-9-5- سرطان گردن رحم. 32

2-9-6- HPV در کودکان. 34

2-10- اپیدمیولوژی.. 35

2-11- مطالعه سرطان گردن رحم و عفونت پاپیلوماویروس در ایران. 37

2-12- تشخیص…. 38

2-13- پاسخ ایمنی در برابر HPV.. 40

2-13-1- ایمنی اختصاصی.. 41

2-13-1- 1- پاسخ ایمنی هومورال. 41

2-13-1-2- پاسخ ایمنی سلولی.. 42

2-13-2-پاسخ ایمنی ذاتی.. 43

2-14- درمان. 44

2-15- پیشگیری.. 45

2-16- واکسیناسیون. 46

2-17- واکسیناسیون علیه HPV.. 47

2-17-1- واکسن های نوترکیب با ناقل زنده 50

2-17-2-واکسن های پروتئینی و پپتیدی.. 51

2-17-3-ذرات شبه ویروس( VLPs). 52

2-17-4- DNA واکسن ها 56

-5-17-2 واکسن های خوراکی.. 59

2-18- اهمیت پاسخ های ایمنی هومورال و واکسن های پیشگیری کننده 63

2-19- اهمیت پاسخ های ایمنی سلولی و واکسن های درمان کننده 64

2-20-ایمونوانفورماتیک در علم واکسن.. 65

2-20-1-ﭘﺎﯾﮕﺎه های داده ها (Databases) 68

2-20-1-1- پایگاه های داده اﯾﻤﻮﻧﻮﻣﯿﮏ… 68

2-20-1-2- ﭘﺎﯾﮕﺎه داده اپی توپ ها و ﺳﺎﺧﺘﺎرهای آﻧﺘﯽ ﺑﺎدی ﺑﺮای ﺳﻠﻮل B.. 69

2-20-1-3- ﭘﺎﯾﮕﺎه داده اﭘﯽ ﺗﻮپ ﺳﻠﻮلT.. 72

2-20-2-اﺑﺰارها و اﻟﮕﻮرﯾﺘﻢ های ﻣﺘﻨﻮع ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ.. 73

2-20-2-1-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮل B.. 74

2-20-2-2-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮل B ﺑﺮ ﻣﺒﻨﺎی ﻣﯿﻞ ذاﺗﯽ آﻣﯿﻨﻮاﺳﯿﺪ. 75

2-20-2-3-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ ﺳﻠﻮلB ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از روش های ﯾﺎدﮔﯿﺮی ﻣﺎﺷﯿﻦ.. 77

2-20-2-4-روش ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﻏﯿﺮ پیوسته ﺳﻠﻮل B.. 78

2-20-2-5-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ های ﺳﻠﻮل T.. 82

2-20-3- ﮐﺎرﺑﺮدهای ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ.. 83

2-21-واکسن همگانی (Universal vaccine) 84

2-22- واكسن سازی معكوس Reverse Vaccinology.. 84

2-23-ادجوانت ها 86

2-24-به دست آوردن قطعه DNA یاژن مورد نظر. 89

2-25-کلونینگ ژن. 90

2-25-1- مراحل کلون کردن ژن. 90

2-25-2- میزبان کلونینگ… 90

2-26- آنزیم های محدود کننده 91

2-26-1-آنزیم لیگاز. 91

2-27- حامل های کلونینگ… 91

2-28-غربالگری وجود ژن. 92

2-29-انواع سیستم های بیانی و مزیت اشرشیاکلی.. 92

2-30-وکتورهای بیان کننده 94

2-30-1- وکتورهای بیان کننده سیستمpET.. 94

2-31-وکتورهای پلاسمیدی.. 96

2-32-توالی شاین دلگارنو(SD)(Shine-delgarno) 97

2-33-استراتژی بیان در سیستمpET.. 97

2-34-نقشه و مشخصات وکتورpET28a(+) 98

2-35-تولید پروتئین نوترکیب.. 99

2-36-مراحل تهیه یک پروتئین نوترکیب در اشرشیاکلی.. 99

2-37-بیان ژن و تولید پروتئین نوترکیب در E.coli. 100

2-38-راهکارهای افزایش تولید پروتئین نوترکیب در اشرشیاکلی.. 101

2-39-تخلیص پروتئین نوترکیب.. 102

2-40- فرضیات و هدف از انجام تحقیق.. 103

2-40-1 -فرضیات.. 103

2-40-2 – هدف از انجام تحقیق.. 103

فصل سوم: مواد و روش ها…104

3-1-مجموعه توالی های پروتئین.. 105

3-2-پیش بینی اپی توپ سلول B.. 105

3-3-قابلیت دسترسی اپی توپ به حلال. 106

3-4-محل های N-Glycosylated.. 107

3-5-ترجمۀ معکوس اولین ساختمان. 107

3-6-بهینه سازی کدون، تعیین کدون های نادر (rare codon) 108

3-7-تولید ساختار واکسن.. 109

3-8-تهیه باکتری مستعد شده 109

3-9-ترانسفورم نمودن پلاسمید بیانی.. 111

3-10- SDS-PAGE. 114

3-11-بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی در مقیاس کم. 115

3-12-کشت انبوه سویه بیانی و تهیه جسم سلولی.. 117

3-13-بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی در مقیاس بالا. 117

3-14-الکتروفورز پروتئین در ژل آکریل آمید در حضور SDS. 119

3-15- رنگ آمیزی ژل با کوماسی بلوR-350.. 122

3-15-1- روش تهیه محلول ها 122

3-15-2- روش رنگ آمیزی.. 123

3-16- وسترن بلاتینگ… 123

3-16-1- انتقال در تانک… 124

3-16-2- مسدودسازی غشا 125

3-16-3- تشخیص با آنتی بادی.. 125

3-17-تخلیص پروتئین با یون های نیکل متصل به ماتریکس NTA نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی روی ماتریکس Ni-NTA.. 126

3-18-بهینه سازی تخلیص…. 127

3-19-ارزیابی پروتئین تخلیص شده با روش SDS-PAGE. 127

3-20-تخلیص انبوه پروتئین نوترکیبHPV واکسن کاندید چند اپی توپی.. 128

3-21- دیالیز و تغلیظ پروتئین HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده 134

3-22- ارزیابی پروتئین تخلیص شده 136

3-23- روش برادفورد. 136

3-23-1- طرز تهیه محلول های مورد نیاز. 137

3-23-2- طرز تهیه محلول برادفورد. 137

3-23-3- طرز تهیه محلول استاندارد پروتئین ذخیره با غلظت 1000μic/ml. 137

3-23-4- طرز تهیه محلول استاندارد پروتئین با غلظت 10,100mic/ml 137

3-24- بررسی خلوص پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده با روش SDS-PAGE. 138

3-25-بررسی پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده با وسترن بلات.. 138

3-26-پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی.. 139

3-27- حیوان آزمایشگاهی.. 139

3-28-ادجوانت فروند ناقص…. 139

3-29-گروه های تجربی و واکسیناسیون موش ها 140

3-30- بررسی پاسخ های همورال. 141

3-30-1- بررسی سطح آنتی بادی توتال در رقت های مختلف سرمی.. 142

فصل چهارم: نتایج ….144

4-1-پیش بینی اپی توپ سلول B.. 145

4-2- قابلیت دسترسی اپی توپ ها 149

4-3-محل های N-Glycosylated.. 151

4-4-انتخاب اپی توپ ها و اتصال پپتیدها برای تولید ساختمان واکسن.. 153

4-5-ارزشیابی توالی پروتئین.. 155

4-6-ترجمۀ معکوس ساختمان اول. 157

4-7-نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی با روش SDS-PAGE.. 159

4-8- نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی با روش وسترن بلاتینگ… 161

4-9-نتایج بررسی پاسخ های ایمنی همورال. 162

4-9-1- نتایج بررسی سطح آنتی بادی توتال اختصاصی واکسن کاندید. 162

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری………164

5-1- بحث و نتیجه گیری.. 165

5-2-پیشنهادات و چشم اندازها 168

References …169

ضمائم:

فهرست اشکال :

شکل 2-1.ساختمان ویروس پاپیلوما……………………………………………………………………………………………………………………….16

شکل 2-2. نقشه ژنومی در پاپیلوما ویروس……………………………………………………………………………………………………………..18

شکل2-3.نمایی از تکثیر پاپیلوما ویروس در ارتباط با عملکرد پروتئین های غیرساختاری……………………………………………..18

شکل2-4. مواردی از عفونت پاپیلوما ویروس ها……………………………………………………………………………………………………..30

شکل 2-5. مراحل اصلی پاپیلوماویروس و محل آنها در اپی تلیوم اسکوآموس…………………………………………………………….41

شکل 2-6. ساختار شماتیک و توالی ژنی ناحیه بیانی pET-28a(+)…………………………………………………………………………..99

شکل4-1. نمایش انتخاب اپی توپ ها با میزان بالای قابلیت دسترسی به حلال ، در اینجا ساختمان های پروتئین L1 از سروتایپ های HPV 11, 16, 18, 31, 45 نشان داده شده اند…………………………………………………………………………………151

شکل4-2.طراحی اولیه ساختار اپی توپ های منتخب ، E1 تا E10 برای پروتئین L1 و E11 تا E20 برای L2 طراحی شدند………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..155

شکل 4-3. آنالیز آنتی ژنی سیتی ساختمان توسط برنامه پروتئان آنالیز ،. این نتایج نشان داد که قسمت های اصلی ساختار پروتئنی جدید خصوصیات هیدروفیلیک دارد، بنابراین توان آنتی ژنیک را دارد……………………………………………………………157

شکل4-4. توالی ترجمه شده معکوس برای بهینه سازی کدون و کدون نادر برای افزایش سطح بیان ژن و انحلال پذیری پروتئین ارزشیابی شد. به این منظور OPTIMIZER و سرورهای GenScript با هم بکار برده شدند…………………..158

ششکل 4-5. نتایج ترجمه معکوس و بهینه سازی …………………………………………………………………………………………………159

شکل 4-6.نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی و مشاهده باند در محدوده 45 کیلو دالتون……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….160

شکل4-7. pET28a(+)/HPV، SDS-PAGE قبل و بعد از تخلیص پروتئین ، نتیجه تخلیص به صورت تک باند و در محدوده 45KD است………………………………………………………………………………………………………………………………………….160

شکل4-8. نتایج Western Blot و SDS-PAGE ، نتیجه در محدوده 45KD است……………………………………………..161

شکل4-9. SDS-PAGE بعد از تخلیص انبوه پروتئین ، نتیجه به صورت تک باند و در محدوده 45KD است…………..162

فهرست جداول:

جدول 2-1. خصویات واکسن چهار ظرفیتی و دوظرفیتی HPV ……………………………………………………………………………….53

جدول 2-2.واکسن های پیشگیری کننده در حال توسعه……………………………………………………………………………………………61

جدول2-3.واکسن های درمانی HPV درحال توسعه………………………………………………………………………………………………..62

ﺟﺪول2-4.ﭘﺎﯾﮕﺎه داده اپی توپ ها و ﺳﺎﺧﺘﺎرهای آﻧﺘﯽ ﺑﺎدی ﺑﺮای ﺳﻠﻮل B ﻣﺨﺘﻠﻒ ……………………………………………………..72

ﺟﺪول 2-5. ﺗﻌﺪادی از اﺑﺰارهای ﻣﻮﺟﻮد جهتﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮل B ………………………………………………………….75

ﺟﺪول 2- 6 . ﻣﻨﺎﺑﻊ ﻣﻮﺟﻮد جهتﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮلB ……………………………………………………………………………80

جدول3-1. سکانس های استفاده شده برای طراحی ساختار کاندید یونیورسال واکسن HPV……………………………………..105

جدول3-2.گروه بندی موش های مورد مطالعه………………………………………………………………………………………………………141

جدول 4-1. پیش بینی اپی توپ سروتیپ های HPV 11.16.18, 31, 45 با استفاده از سرور BCPREDS……………….149

جدول 4-2.فهرست نتایج مدل سازی همولوژی برای پروتئین های L1 از HPV نوع های 11، 16، 18، 31 و 45………..150

جدول4-3. امتیاز و محدوده آسپاراژین در توالی اپی توپ ها را نشان می دهد…………………………………………………………153