1-2-7-2 صنعت چرم. 23

1-2-7-3 صنایع دارویی.. 24

1-2-7-4 صنایع غذایی.. 25

1-2-8 سراشیا مارسسنس… 26

1-2- 9 سراشیاپپتیداز و اهمیت آن. 28

نوترکیب و اهمیت آن. 29

1-2-11 انتخاب میزبان بیان ژن. 30

1-2- 12راهبردهای نسخه برداری (انتخاب حاملین بیان ژن) 31

.. 32

-14استراتژی خالص سازی محصول نوترکیب.. 34

هدف از انجام پروژه 36

فصل دوم: پیشینه پژوهش

2-1 ادبیات و سوابق مربوطه…39

فصل سوم: روش شناسی

3-1مواد شیمیایی.. 42

3-2 میكروارگانیسم ها ومحیط های كشت مورد استفاده 43

3-2-1 میكروارگانیسم ها و پلاسمیدها. 43

3-2-2محیط های كشت میكروبی.. 44

3-3 روش سنجش فعالیت پروتئاز. 45

العات اولیه آنزیم شناسی.. 46

3-4-1 اثر دما بر پایداری آنزیم.. 46

3-4-2 اثر pH بر پایداری آنزیم.. 46

3-4-3 دمای بهینه. 47

3-4-4 تعیین پارامترهای سینتیكی آنزیم.. 47

3-5 جداسازی باکتری.. 48

3-5-1 استخراج DNAژنومی.. 48

3-5-2 طراحی پرایمر و انجام PCR… 48

3-5-2-1 مراحل PCR ………..49

سازی ژن سراپپتیداز در وکتورT/A . 50

3-5-4 رسم درخت فیلوژنتیک…. 51

3-5-5 تعیین توالی ژن کدکننده سراپپتیداز. 51

3-6 روشهای الکتروفورزی.. 53

3-6-1 SDS-PAGE.. 53

3-6-2 الکتروفورز ژل آگارز(100). 53

نوتركیب.. 54

3-7-1 ساختار ناقل كلونینگ…. 54

3-7-2 آماده سازی قطعهDNA برای انتقال به درون وكتور. 55

3-7-3 استخراج DNA از روی ژل.. 56

3-7- 4 مراحل کلون مجدد. 56

3-7-5 مستعدکردن باکتری DH5αبه روش استفاده از محلول CaCl2 (M 1/0). 58

3-7-6 انتقال محصول الحاق به درون باکتری مستعدDH5α . 59

3-8 بافرCracking. 60

3- 9بیان ژن سراپپتیداز و تعیین خلوص آن توسطSDS-PAGE 62

3-9-1 القاء باکتری و بیان پروتئین های نوترکیب… 62

3-9-2 بررسی بیان پروتئین های نوترکیب با استفاده از روش الکتروفورز. 63

3-10 تخلیص پروتئین های نوترکیب.. 66

نیاز تخلیص پروتئین نوترکیب… 66

3-10-2 روش تخلیص پروتئین نوترکیب… 67

فصل چهارم: تجزیه وتحلیل داده ها

4-1 جداسازی باکتری.. 70

DNAژنومی.. 70

4-3 رسم درخت فیلوژنتیکی.. 70

4-4 کلون کردن ژن سراپپتیداز در حامل بیانیpET28-a (+) 71

4-5 بیان و تخلیص ژن سراپپتیداز نوترکیب.. 75

4-6 منحنی استاندارد. 77

روی فعالیت آنزیم. 77

4-8 دمای بهینه آنزیم. 78

4 -9 بررسی خصوصویات کاتالیتیک آنزیم……79

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1 نتیجه گیری نهایی.. 88

5-2 پیشنهادات.. 88

منابع و مأخذ. 89

فهرست منابع انگلیسی….89

فهرست جداول

عنوانشماره صفحه

جدول 3-1 خصوصیات انواع سویه ها و پلاسمیدهای مورد استفاده در پژوهش …………………………………43

جدول 3-2 نسبت های واکنش الحاق …………………………………………………………………………………………..57

فهرست اشکال

عنوانشماره صفحه

شکل 1-1 سیستم بیان pET ……………………………………………………………………………………………………….34

شکل 2-1 ناقل کلونینگPet28a…………………………………………………………………………………………………55

شکل 4-1 درخت فیلوژنتیکی رسم شده با استفاده از NCBI…………………………………………………………..71

شکل 4-2 الکتروفورز محصول واکنش PCR…………………………………………………………………………………72

شکل 4-3 الکتروفورز پلاسمید های استخراج شده از باکتریهای ترانسفورم شده توسط روش Cracking………………………………………………………………………………………………………………………………..73

شکل 4-4 نمونه های پلاسمیدی حاوی ژن…………………………………………………………………………………….74

شکل 4-5 محصول واکنش PCR…………………………………………………………………………………………………75

شکل 4-6 ژل الکتروفورز آنزیم تخلیص شده ………………………………………………………………………………..76

فهرست نمودارها

1-6-1-2. اولویت­های علم و فناوری نقشه جامع علمی کشور جمهوری اسلامی ایران. 15

1-6-1-3. همکاری علمی.. 16

1-6-2. تعاریف عملیاتی اجزای مسأله. 16

1-6-2-1. بروندادهای علمی.. 16

1-6-2-2. اولویت­های علم و فناوری منتخب(فناوریهای نانو، زیست و انرژی هسته­ای) 16

1-6-2-3. همکاری علمی.. 17

1-7. جمع­بندی.. 17

فصل دوم. 18

مبانی نظری و پیشینه پژوهش… 18

2-1. مقدمه. 19

2-2.علم­سنجی و ارزیابی بروندادهای علمی.. 20

2-2-1. تعریف علم­سنجی.. 20

2-2-2. تاریخچه پیدایش علم­سنجی.. 22

2-2-3. تعریف کتابسنجی.. 24

2-2-4. ارتباط علم­سنجی با کتاب­سنجی.. 25

2-2-5. استناد. 26

2-2-6. کاربرد تحلیل استنادی.. 27

2-3. شاخص­های ارزیابی بروندادهای علمی.. 31

2-3-1. تاریخچه پیدایش شاخص­های ارزیابی.. 31

2-3-2. اهمیت انجام مقایسه و نرمالسازی با رویکرد علم سنجی.. 35

2-4. تحلیل بروندادهای علمی کشور جمهوری اسلامی ایران. 38

2-4-1. موانع توسعه علم و فناوری در کشور جمهوری اسلامی ایران. 40

2-5. اهمیت ارزیابی پژوهشگران و مؤسسات پژوهشی.. 41

2-5-1. شاخص­های بهنجار شده موجود برای ارزیابی دانشمندان و مؤسسات پژوهشی.. 43

2-5-1-1. شاخص اچ.. 43

2-5-1-2. شاخص جی.. 45

2-5-1-3. شاخص اچ جی.. 46

2-5-1-4. شاخص پی.. 46

2-6. اهمیت مجلات… 46

2-6-1. شاخص­های ارزیابی مجلات… 47

2-6-1-2. ایجاد طرح وزندهی کردن. 49

2-6-1-3. کاربرد عملی نفوذ مجلات نارین و ضریب تأثیر گارفیلد در علم­سنجی.. 50

2-7. همکاری­های علمی.. 52

2-7-1. ضریب همکاری گروهی.. 54

2-8.چشم­انداز و نقشه جامع علمی کشور ایران. 54

2-8-1. چشم­انداز جمهوری اسلامی ایران در افق 1404 هجری شمسی.. 54

2-8-2. مفهوم شناسی نقشه جامع علمی کشور به عنوان چشم­انداز علمی کشور. 56

2-8-3. دسته­بندی حوزه­های اولویت دار. 57

2-8-4. نرخ تولید علم و کیفیت تولید علم در نقشه جامع علمی کشور. 58

2-8-5. چشم­انداز کشور ترکیه. 59

2-9.اولویت­های علم و فناوری منتخب از نقشه جامع علمی کشور. 60

2-9-1. اهمیت فناوری­های نوین در جهان. 60

2-9-1-1. فناوری نانو(تعریف، تاریخچه، اهمیت) 60

2-9-1-2. زیست­فناوری(تعریف، تاریخچه، اهمیت) 63

2-9-1-3. انرژی هسته ای.. 67

2-10.معرفی پایگاه­های استنادی مورد استفاده 68

2-10-1. وب آو ساینس… 69

شکل 2-2. صفحه جستجوی پیشرفته پایگاه وب آو ساینس… 69

جدول2-1. انواع مدارک نمایه شده در پایگاه وب آو ساینس(برگرفته از صفحه جستجوی پایگاه وب آو ساینس) 70

جدول 2-2 . انواع مختلف قالب مدارک نمایه شده در پایگاه وب آو ساینس… 71

2-10-2. پایگاه اطلاعاتی جی سی آر. 72

شکل 2-3 . صفحه اصلی پایگاه استنادی نشریات… 72

2-10-3. پایگاه ای اس آی.. 73

شکل 2- 4. صفحه اصلی پایگاه اطلاعاتی ESI 73

2-11. جمع بندی مبانی نظری.. 74

2-12. پیشینه پژوهش… 75

2-12-1. پیشینه در داخل ایران. 75

2-12-1-1. ارزیابی بروندادهای علمی در اولویت­های علم و فناوری سطح الف منتخب از نقشه جامع علمی کشور. 75

2-12-1-2. ارزیابی بروندادهای علمی در حوزه­های مختلف علم و فناوری.. 78

2-12-1-3. بررسی جایگاه ایران در علوم جهانی.. 87

2-12-1-4. ارزیابی بروندادهای علمی دانشگاه­ها و مؤسسات… 93

2-12-2. پیشینه در خارج از ایران. 96

2-12-2-1. ارزیابی بروندادهای علمی در اولویت­های علم و فناوری سطح الف نقشه جامع علمی کشور جمهوری اسلامی ایران. 96

2-12-2-2. ارزیابی بروندادهای علمی در حوزه­های مختلف علم و فناوری.. 108

2-13. جمع­بندی از مرور پیشینه­ها 117

فصل سوم. 120

3-1. مقدمه. 121

3-2. روش پژوهش… 121

3-3. جامعه آماری پژوهش… 122

3-4. روش نمونه­گیری و حجم نمونه. 123

3-5. ابزار گردآوری داده­ها 123

3-6. روش جمعآوری داده­ها 124

3-7. روش تجزیه تحلیل داده­ها 127

3-8. جمع­بندی.. 128

فصل چهارم. 129

4-1. مقدمه. 130

4-2. پاسخ به سؤالات پژوهش… 131

4-2-1. تعداد و سهم کل بروندادهای علمی کشورهای جهان در حوزه­های اولویت­دار مورد بررسی در دوره زمانی2002-2011 به تفکیک قاره­های جهان. 131

4-2-2. برترین کشورها از نظر کمّیت تولیدات علمی در حوزه­های اولویت­دار علم و فناوری منتخب 134

4-2-3. بروندادهای علمی کشورهای مورد بررسی در هر یک از حوزههای اولویت­دار علم و فناوری زیست، نانو و انرژی هسته­ای.. 138

4-2-3-1. تعداد کل بروندادهای علمی، سهم جهانی از بروندادهای علمی و رتبه جهانی و منطقه­ای کشورهای مورد بررسی در حوزه­های اولویت­دار منتخب… 139

4-2-3-2. رتبه منطقه­ای بروندادهای علمی ایران و سایر کشورهای رقیب مورد بررسی در حوزه­های اولویت­دار مورد بررسی به طور کلی و بدون اعمال محدودیت زمانی برای شناسایی جایگاه واقعی کشور ایران در حوزه­های مذکور. 143

4-2-4. میزان رشد بروندادهای علمی جهانی در سال­های مختلف مورد بررسی در اولویت­های علم و فناوری نانو، زیست و انرژی هسته­ای.. 144

4-2-4-1. تعداد و میزان رشد بروندادهای علمی کشور جمهوری اسلامی ایران در اولویت­های علم و فناوری زیست، نانو و انرژی هسته­ای.. 147

4-2-5. میزان کیفیت بروندادهای علمی 23 کشور مورد بررسی در هر یک از اولویت­های علم و فناوری زیست، نانو و انرژی هسته­ای.. 148

4-2-6. تعداد نویسندگان، دانشگاهها، کشورهای همکار و تعداد نشریات در کشورهای مورد بررسی برای ارائه فرمولی برای پیش­بینی آینده 155

4-2-6-1. آزمون رگرسیون. 158

4-2-6-1-1. بررسی عوامل مؤثر بر رشد استنادات در حوزه اولویتدار انرژی هسته­ای.. 158

4-2-6-1-2. بررسی عوامل مؤثر بر رشد استنادات در رشته فناوری نانو. 160

4-2-6-1-3. بررسی عوامل مؤثر بر رشد استنادات در حوزه اولویت­دار زیست فناوری.. 161

4-2-7. دستهبندیهای موضوعی مرتبط با اولویت­های علم و فناوری در بروندادهای علمی کشور ایران 163

4-2-8. وضعیت شاخصهای کیفی علمسنجی مانند شاخص اچ، جی، اچجی، پی در اولویتهای علم و فناوری زیست، نانو و انرژی هستهای بروندادهای علمی کشور ایران. 166

4-2-9. میزان همکاریهای علمی بین المللی ایران در اولویت­های علم و فناوری زیست، نانو و انرژی هسته­ای با سایر کشورهای جهان. 167

2-4-9-1. کشورهای برتر از نظر تعداد همکاریهای علمی بین­المللی با کشور ایران و همچنین شاخصهای ارزیابی کیفیت مانند تعداد استنادات، میانگین استنادات به ازای انتشارات و شاخص اچ در اولویت­های علم و فناوری زیست، نانو و انرژی هسته­ای.. 168

2-4-9-1-1. کشورهای برتر همکاری کننده با ایران در حوزه زیست فناوری.. 168

2-4-9-1-2. کشورهای برتر همکاری کننده با ایران در حوزه فناوری نانو. 169

2-4-9-1-3. کشورهای برتر همکاری کننده با ایران در حوزه انرژی هسته­ای.. 170

4-2-9-2. مقایسه بروندادهای علمی با همکاری­های علمی بینالمللی و ملّی بر اساس شاخص­های کمّی و کیفی در هر یک از اولویتهای علم و فناوری زیست، نانو و انرژی هسته­ای.. 171

4-2-10. شبکه هم­نویسندگی برای بروندادهای علمی کشور ایران با همکاری­های علمی بینالمللی در هر یک از حوزههای اولویتدار مورد بررسی در طی سالهای 2002 تا 2011. 172

4-2-10-1. شبکه هم­نویسندگی بروندادهای علمی ایران در حوزه زیست فناوری.. 173

4-2-10-2. شبکه هم­نویسندگی بروندادهای علمی ایران در حوزه فناوری نانو. 174

4-2-10-3. شبکه هم­نویسندگی بروندادهای علمی ایران در حوزه انرژی هسته­ای.. 175

4-2-11. ضریب همکاری گروهی نویسندگان ایرانی در طی سال­های 2002 تا 2011. 176

4-2-12. وضعیت نویسندگان برتر ایرانی در اولویتهای علم و فناوری زیست، نانو و انرژی هسته­ای بر اساس شاخص­های ارزیابی کمّی و کیفی.. 177

جدول 4-23. وضعیت کمّی و کیفی نویسندگان ایرانی در حوزه اولویتدار زیست فناوری در سال­های 2002 تا 2011 177

4-2-13. برترین دانشگاهها و مؤسسات ایرانی در حوزههای اولویتدار زیست، نانو و انرژی هسته­ای در دوره زمانی 2002 تا 2011. 180

4-2-13-1. دانشگاهها و مؤسسات برتر ایرانی از لحاظ دارا بودن بیشترین تعداد بروندادهای علمی در حوزه­های اولویت­دار علم و فناوری و بررسی کیفیت آنها بر اساس شاخص­های بروندادی.. 180

4-2-14. مجلات معتبر بین­المللی که بیشترین تولیدات علمی نویسندگان ایرانی در زمینه­های موضوعی مذکور در آنها چاپ شده است، کدامند؟. 186

4-2-15. مجلاتی که تولیدات علمی ایرانیان در آنها به چاپ رسیده اند در مقایسه با مجلات بین المللی ، در حوزه­های موضوعی مورد بررسی به صورت تفکیک سال­های مورد بررسی از نظر شاخص­های مختلف ارزیابی کیفیت در چه وضعیتی قرار دارند؟. 192

4-2-16. بررسی ارتباط بین تعداد انتشارات(کمّیت) و استنادات(کیفیت) 198

4-2-16-1. ارتباط بین میزان انتشارات(کمّیت) و استنادات(کیفیت) در حوزه اولویت­دار انرژی هسته­ای 198

4-2-16-2. ارتباط بین میزان انتشارات(کمّیت) و استنادات(کیفیت) در حوزه اولویت­دار فناوری نانو 198

4-2-16-3. ارتباط بین میزان انتشارات(کمّیت) و استنادات(کیفیت) در حوزه اولویت­دار زیست فناوری 199

4-2-17. بررسی ارتباط بین تعداد انتشارات و شاخص اچ بروندادهای علمی 23 کشور رقیب مورد بررسی در حوزه­های اولویت­دار علم و فناوری انرژی هسته­ای، فناوری نانو و زیست فناوری.. 199

4-2-17-1. ارتباط بین تعداد انتشارات و شاخص اچ در حوزه اولویت­دار انرژی هسته­ای.. 199

جدول4-38. ضریب همبستگی اسپیرمن بین تعداد انتشارات و شاخص اچ در حوزه اولویت­دار انرژی هسته­ای 199

4-2-17-2. ارتباط بین تعداد انتشارات و شاخص اچ در حوزه اولویت­دار فناوری نانو. 200

4-2-17-3. ارتباط بین تعداد انتشارات و شاخص اچ در حوزه اولویت­دار زیست فناوری.. 200

4-2-18. بررسی ارتباط بین تعداد استنادات به ازای انتشارات و شاخص اچ بروندادهای علمی 23 کشور رقیب مورد بررسی در حوزه­های اولویتدار علم و فناوری انرژی هسته­ای ، نانو و زیست… 200

4-2-18-1. رابطه بین تعداد استنادات به ازای تعداد انتشارات و شاخص اچ در حوزه اولویت­دار انرژی هسته­ای 201

4-2-18-2. رابطه بین تعداد استنادات به ازای تعداد انتشارات و شاخص اچ در حوزه اولویت­دار فناوری نانو 201

4-2-18-3. رابطه بین تعداد استنادات به ازای تعداد انتشارات و شاخص اچ در حوزه اولویت­دار زیست فناوری 202

4-2-19. بررسی ارتباط بین تعداد نویسندگان و تعداد استنادات دریافتی بروندادهای علمی 23 کشور رقیب مورد بررسی در حوزه­های اولویت­دار علم و فناوری انرژی هسته­ای، فناوری نانو و زیست فناوری.. 202

4-2-19-1. ارتباط بین تعداد نویسندگان و تعداد استنادات دریافتی در حوزه اولویتدار انرژی هسته­ای 202

4-2-19-2. ارتباط بین تعداد نویسندگان و تعداد استنادات دریافتی در حوزه اولویت­دار فناوری نانو 203

4-2-19-3. ارتباط بین تعداد نویسندگان و تعداد استنادات دریافتی در حوزه اولویت­دار زیست فناوری 203

4-2-20. بررسی ارتباط بین تعداد کشورهای همکاری کننده در تولید بروندادهای علمی و استنادات دریافتی بروندادهای علمی 23 کشور رقیب مورد بررسی در حوزه­های اولویت­دار انرژی هسته­ای ، نانو و زیست فناوری.. 203

4-2-20-1. ارتباط بین تعداد کشورهای همکاری کننده در تولید بروندادهای علمی و استنادات دریافتی در حوزه اولویتدار انرژی هسته­ای.. 204

4-2-20-2. ارتباط بین تعداد کشورهای همکاری کننده در تولیدات علمی و استنادات دریافتی در زمینه فناوری نانو 204

4-2-20-3. ارتباط بین تعداد کشورهای همکاری کننده در تولیدات علمی و استنادات دریافتی در حوزه اولویت­دار زیست فناوری.. 205

4-2-21. آزمون­های آماری مربوط به بررسی وجود و یا عدم وجود تفاوت معنادار آماری در شاخصهای ارزیابی بروندادهای علمی 23 کشور رقیب مورد بررسی.. 205

4-2-21-1. بررسی وجود یا عدم وجود تفاوت معنادار آماری بین شاخص اچ بروندادهای علمی 23 کشور رقیب مورد بررسی در سه حوزه اولویت­دار علم و فناوری منتخب… 205

4-2-21-2. بررسی وجود یا عدم وجود تفاوت معنادار آماری بین شاخص تعداد استنادات به ازای انتشارات 23 کشور رقیب مورد بررسی.. 206

4-2-22. آزمونهای بررسی تفاوت برای بروندادهای علمی کشور ایران. 207

4-2-22-1. بررسی وجود یا عدم وجود تفاوت معنادار میان میزان رشد بروندادهای علمی کشور ایران در هر یک از اولویت­های علم و فناوری نانو، زیست و انرژی هسته­ای.. 207

4-2-22-2. بررسی وجود یا عدم وجود تفاوت معنادار آماری تفاوت بین میزان استناد به بروندادهای علمی ایران در اولویت­های علم و فناوری.. 207

4-2-22-3. بررسی وجود یا عدم وجود تفاوت معنادار آماری بین نسبت بین استنادات و انتشارات نویسندگان برتر ایرانی در اولویت­های علم و فناوری مورد بررسی.. 208

4-2-22-4. بررسی وجود یا عدم وجود تفاوت معنادار بین بروندادهای علمی اولویت­های علم و فناوری و میزان استنادات دریافتی نویسندگان برتر ایرانی.. 208

4-2-22-5.بررسی وجود یا عدم وجود تفاوت معنادار آماری بین شاخص اچ بروندادهای علمی نویسندگان برتر ایرانی در اولویت­های علم و فناوری مورد بررسی 209

فصل پنجم. 210

5-1. مقدمه. 211

5-2. نتیجه­گیری از یافته­های پژوهش… 211

5-2-1. کمّیت و سهم بروندادهای علمی جهان به تفکیک قاره­های مختلف در حوزههای اولویت­دار علم و فناوری چگونه می­باشد؟. 212

5-2-2. برترین کشورهای جهان از نظر تعداد بروندادهای علمی و بررسی زبان و قالب بروندادهای علمی جهانی و ایرانی کدامند؟ 212

5-2-3. رتبه جهانی و منطقه­ای ایران و کشورهای رقیب در چشم­انداز 1404، بر اساس کمّیت و سهم جهانی بروندادهای علمی آنها، در طی ده سال مذکور به چه نحوی میباشد؟. 213

5-2-4. ضریب رشد تولیدات علمی کشورهای مورد بررسی در هر یک از سه اولویت منتخب در طی سال­های مذکور چقدر است؟. 213

5-2-5. وضعیت کیفی بروندادهای علمی کشور جمهوری اسلامی ایران و کشورهای رقیب در چشم­انداز 1404، به چه نحو میباشد؟. 214

5-2-6. وضوعاتی که بیشترین تعداد بروندادهای علمی را در هر یک از حوزه­های اولویت­دار مورد بررسی دارا می­باشند کدامند؟ 215

5-2-7. کمّیت و کیفیت تولیدات علمی کشور ایران با همکاری­های علمی بین المللی و ملّی در اولویت­های منتخب علم و فناوری به چه نحوی میباشد؟. 215

5-2-8. میانگین ضریب همکاری گروهی نویسندگان ایرانی در هر یک از سه حوزه اولویتدار مورد بررسی در دوره زمانی 2002 تا 2011 به چه میزانی میباشد؟. 217

1-2-2-تکنیک های مختلف انجمادی

3

1-2-2-1-انجماد آهسته

4

1-2-2-2-انجماد شیشه ای

5

1-2-3-محلول های انجمادی

5

1-2-3-1-ضدیخ ها

5

1-2-3-2-سرم

7

1-2-4-تاثیرات انجماد بر بافت بیضه

7

3- 1-3-پیوند

9

4- 1-4-کشت

10

5- 1-5-تغییرات ملکولی متاثر از انجماد

11

1-5-1-آپوپتوزیس

12

1-5-1-1-مسیر خارجی آپوپتوز و ژن های دخیل در آن

13

1-5-1-2-مسیرداخلی آپوپتوز و ژنهای دخیل در آن

14

1-5-1-3-P53

16

1-5-1-4-کاسپاز 3

17

1-6-هدف

18

1-7-پرسش پژوهشی

18

1-8-فرضیات

18

فصل دوم: مواد و روش ها

19

2-1-تهیه ی بافت بیضه و گروه های مورد مطالعه

20

2-2-انجماد شیشه ای بافت بیضه

21

2-2-1-روش تهیه محیط پایه

21

2-2-2-روش تهیه محلول های انجماد شیشه ای

21

2-2-2-1-روش آماده سازی محلول انجمادی I

21

2-2-2-2-روش آماده سازی محلول انجمادی II

22

2-2-3-مراحل انجماد شیشه ای

22

2-2-3-1-روش انجمادی I

22

2-2-3-2-روش انجمادی II

23

2-2-4-ذوب بافت بیضه

23

2-2-4-1-روش تهیه محلول های ذوب

23

2-2-4-2-مراحل ذوب

23

2-5-مطالعات میکروسکوپی و بافت شناسی بافت بیضه

24

2-6-بررسی آپوپتوز و بقا سلولی

26

2-6-1-هضم مکانیکی و آنزیمی بافت بیضه

26

2-6-1-1-هضم مکانیکی

27

2-6-1-2-هضم آنزیمی

27

2-6-1-3-خنثی سازی اثر آنزیم و بررسی بقا با استفاده از رنگ PI

27

2-6-2-ارزیابی بقای سلولی به روش فلوسایتومتری

28

2-6-3-بررسی آپوپتوز سلولی

29

2 -7-کشت بافت بیضه

30

2-7-1-آماده سازی آگار

30

2-7-2-آماده سازی محیط کشت

31

2-7-2-1-روش تهیه محیط RPMI

31

2-7-3-کشت بافت بیضه

32

2-8-ارزیابی ژن های آپوپتوزی

32

2-8-1-نگهداری بافت در محلول RNA-later

32

2-8-2-استخراج RNA با استفاده از ترایزول

32

2-8-2-1-هموژن کردن بافت

2-8-2-2-مرحله ی جداسازی

33

33

2-8-2-3-رسوب RNA

33

2-8-2-4-شستشو RNA

33

2-8-3-بررسی کیفی RNA های استخراج شده

34

2-8-4-تیمار نمونه­یRNA با استفاده از DNase1 جهت حذف آلودگی ژنومی

34

2-8-5-سنتز cDNA

35

2-8-6-پرایمر

37

2-8-6-1-آماده سازی پرایمرها

37

2-8-6-2-بررسی جایگاه اتصال پرایمرها

39

2-8-7-الکتروفورز

39

2-8-7-1-روش ساخت بافر50X TAE

39

2-8-7-2-روش ساخت بافر X TAE1

40

2-8-7-3-طرز تهیه ی ژل آگارز

40

2-8-7-4-بررسی آلودگی پرایمر

40

-8-7-4-بررسی کیفیت RNA

41

2-8-8-بررسی گرادیانت دمایی پرایمر

41

2-8-9 Real-Time PCR

42

2-8-9-2-بررسی کمی بیان ژن با استفاده از روش Real-Time PCR

43

2-9-آنالیز آماری داده

44

فصل سوم: نتایج

45

3-1-بررسی مورفولوژی بافت بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین

46

3-2-مقایسه بقای سلولی در گروه کنترل با گروه های انجمادی I و II بلافاصله پس از ذوب

46

3-3-بررسی میزان وقوع آپوپتوز پس از کشت بافت بیضه

47

3-3-1-ارزیابی میزان بقای سلولی طی کشت بافت بیضه

47

3-3-2-آپوپتوز اولیه ی سلولی طی کشت بافت بیضه

47

3-3-3-بررسی میزان وقوع آپوپتوز پس از کشت بافت بیضه

48

3-3-4-نکروز بافتی طی کشت بافت بیضه

48

3-4-بررسی بیان ژن های آپوپتوزی در سطح رونوشت

49

3-4-1-بررسی بیان رونوشت ژن های دخیل در مسیر های آپوپتوزی

49

3-4-2-Bax

49

3-4-3-BCL2

49

3-4-4-نسبت بیان BAX به BCL2

50

3-4-5-Caspase3

50

3-4-6-Fas

50

3-4-7-Fas Ligand

51

3-4-8-P53

51

27- فصل چهارم: بحث

66

4-1-کلیات

67

4-2-بررسی هایمورفولوژیکدر ساعات مختلف کشت در گروه های مورد مطالعه

68

4-3-بررسی بقا و آپوپتوز سلولی در گروه های مورد مطالعه

69

4-4-بررسی بیان ژن های مرتبط با وقوع آپوپتوز در گروه های مورد مطالعه

71

4-5-نتیجه گیری

75

4-6-پیشنهادات

76

 

فهرست جداول

عنوان صفحه

جدول 2-1-مراحل رنگ آمیزی هماتوکسیلین ایوزین	26
جدول2-2-مشخصات پرایمرهای مورد استفاده	39
جدول 2-3-برنامه ی مورد استفاده جهت بررسی گرادیانت دمایی پرایمرها	42
جدول 3-1- میانگین بقای سلولی درگروه های کنترل، انجمادی I و انجمادی II	53
جدول3-2- میانگین بقای سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف	53
جدول 3-3- میانگین درصد آپوپتوز اولیه ی سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	54
جدول 3-4-میانگین درصد آپوپتوز ثانویه ی سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	54
جدول 3-5- میانگین درصد سلول های نکروتیک در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	55
جدول 3-6-میزان بیان ژن Bax در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	55
جدول 3-7-میزان بیان ژن BCL2 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت53	56
جدول3-8-نسبت بیان BAX به BCL2 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	56
جدول3-9-میزان بیان ژن Caspase3 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	57
جدول 3-10-میزان بیان ژن Fas در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	57
جدول 3-11-میزان بیان ژنLigand Fas در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	58
جدول 3-12- میزان بیان ژن P53 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	58

فهرست اشکال

عنوان صفحه

ی نوشته‌ها

هیپرپرولاکتینمی…………………………………………………………………………………………….. 31

2-6-3- بالا بودن غلظت استروژن به طور مزمن……………………………………………………………………. 31

2-6-4- نقص در فوران LH……………………………………………………………………………………………. 32

2-7- بیماری های موضعی تخمدان……………………………………………………………………………………… 33

2-7-1- سندرم تخمدان چند کیستی…………………………………………………………………………………… 33

2-7-1-1- زنان با یک مشخصه ی منحصر تخمدان های پلی کیستیک………………………………………….. 36

2-7-1-2- تعریف حاضر از تخمدان پلی کیستیک…………………………………………………………………. 36

2-7-1-3- ویژگی های بالینی و بیوشیمیایی PCOS……………………………………………………………….. 39

2-7-1-3-1- گنادوتروپین ها در PCOS……………………………………………………………………………. 39

2-7-1-3-1-1- ترشح نامناسب گنادوتروپین……………………………………………………………………… 39

2-7-1-3-2- تولید استروئید در زنان PCOS………………………………………………………………………. 40

2-7-1-3-2-1- ترشح آندروژن………………………………………………………………………………………. 40

2-7-1-3-2-2- تولید استروئید در تخمدان………………………………………………………………………… 40

2-7-1-3-2-3- هیپرآندروژنمی………………………………………………………………………………………. 43

2-7-1-3-2-3-1- هیپرآندروژنیسم بالینی…………………………………………………………………………. 45

2-7-1-3-3- اختلالات تیروئیدی…………………………………………………………………………………….. 46

2-7-1-3-4- هیپرپرولاکتینمی…………………………………………………………………………………………. 46

2-7-1-3-5- خصوصیات متابولیکی در PCOS…………………………………………………………………… 46

2-7-1-3-5-1- تحمل گلوکز…………………………………………………………………………………………. 46

2-7-1-3-5-2- مقاومت به انسولین…………………………………………………………………………………. 47

2-7-1-3-5-3- کلیرانس و ترشح انسولین………………………………………………………………………… 49

2-7-1-3-5-4- مقاومت انسولینی در زنان PCO………………………………………………………………… 50

2-7-1-3-5-5- فاکتورهای رشد شبه انسولینی در PCOS………………………………………………………. 50

2-7-1-3-6- لپتین و PCOS………………………………………………………………………………………….. 52

2-7-1-3-7- لیپیدها و PCOS………………………………………………………………………………………… 54

2-7-1-3-7-1- دیس لیپیدمی…………………………………………………………………………………………. 55

2-7-1-3-8- تنظیم وزن و انرژی…………………………………………………………………………………….. 55

2-7-1-3-9- هیرسوتیسم………………………………………………………………………………………………. 56

2-7-1-3-9-1- هیرسوتیسم ایدیوپاتیک……………………………………………………………………………. 57

2-7-1-3-10- اختلالات قاعدگی و خطر ابتلا به سرطان آندومتر…………………………………………….. 58

2-7-1-3-11- ژنتیک PCOS…………………………………………………………………………………………. 59

2-7-1-3-12- مدیریت بالینی………………………………………………………………………………………… 60

2-7-1-3-13- تغییرات نحوه ی زندگی……………………………………………………………………………… 61

2-8- ناهنجاری های متابولیک و خطرات سلامت همراه با آن ها…………………………………………………. 62

2-9- معیارهای تشخیص PCOS………………………………………………………………………………………. 64

فصل سوم: مواد و روش ها

3- 1- منشور اخلاقی……………………………………………………………………………………………………… 66

3- 2- جامعه ی مورد مطالعه……………………………………………………………………………………………… 66

3- 3- نمونه گیری…………………………………………………………………………………………………………… 67

3-3-1- خون گیری وریدی………………………………………………………………………………………………. 67

3-4- آزمایش های بیوشمیایی……………………………………………………………………………………………. 67

3-4-1- اندازه گیری گلوکز………………………………………………………………………………………………. 67

3-4-2- اندازه گیری پروفایل لیپیدی…………………………………………………………………………………… 68

3-4-3- اندازه گیری تری گلیسرید………………………………………………………………………………………. 68

3-4-4- اندازه گیری کلسترول…………………………………………………………………………………………… 69

3-4-5- اندازه گیری لیپوپروتئین………………………………………………………………………………………… 70

3-4-5-1- اندازه گیری لیپوپروتئین با دانسیته ی بالا به روش مستقیم…………………………………………… 70

3-4-5-2- اندازه گیری لیپوپروتئین با دانسیته ی پایین……………………………………………………………… 70

3-4-6- سنجش هورمونی……………………………………………………………………………………………….. 71

3-4-6-1- اندازه گیری هورمون LH در سرم………………………………………………………………………… 71

3-4-6-2- اندازه گیری هورمون FSH در سرم………………………………………………………………………. 72

3-4-6-3- اندازه گیری هورمون تستوسترون در سرم………………………………………………………………. 73

3-4-6-4- اندازه گیری هورمون DHEA-S………………………………………………………………………….. 74

3-4-6-5- اندازه گیری هورمون پرولاکتین در سرم………………………………………………………………… 75

3-4-6-6- اندازه گیری هورمون آندروستندیون……………………………………………………………………… 76

3-4-6-7- اندازه گیری هورمون پروژسترون در سرم………………………………………………………………. 76

3-4-6-8- اندازه گیری هورمون استروژن در سرم………………………………………………………………….. 77

3-4-6-9- اندازه گیری هورمون TSH در سرم………………………………………………………………………. 78

3-5- تکمیل پرسش نامه ها………………………………………………………………………………………………… 79

3-5-1- پرسش نامه ی کیفیت زندگی…………………………………………………………………………………… 79

3-5-2- پرسش نامه ی دموگرافیک……………………………………………………………………………………… 79

3-6- تجزیه و تحلیل های آماری……………………………………………………………………………………….. 79

فصل چهارم: نتایج

4-1- بررسی ویژگی های جمعیت شناختی زنان مورد مطالعه……………………………………………………… 81

4-2- مقایسه ی هورمون ها در زنان PCOS با زنان سالم…………………………………………………………… 82

4-3- مقایسه ی عوامل خونی در زنان PCOS با زنان سالم……………………………………………………….. 87

4-4- مقایسه ی عوامل بالینی در زنان PCOS با زنان سالم………………………………………………………… 89

4-5- بررسی ارتباط نمایه ی توده ی بدنی با پارامترهای مورد مطالعه……………………………………………. 90

4-5-1- بررسی ارتباط نمایه ی توده ی بدنی با هورمون های مورد مطالعه………………………………………. 90

4-5-2- بررسی ارتباط نمایه ی توده ی بدنی با عوامل خونی مورد مطالعه……………………………………… 91

4-6- بررسی ارتباط سن با پارامترهای مورد مطالعه………………………………………………………………… 92

4-6-1- بررسی ارتباط سن با هورمون های مورد مطالعه………………………………………………………….. 92

4-6-2- بررسی ارتباط سن با عوامل خونی مورد مطالعه…………………………………………………………. 92

4-7- بررسی ارتباط سطوح هورمون ها با تشخیص نهایی (PCOS- سالم)……………………………………. 94

4-8- بررسی ارتباط سطوح عوامل خونی با تشخیص نهایی (PCOS- سالم)………………………………… 96

4-9- بررسی ارتباط بین هورمون های مورد مطالعه………………………………………………………………….. 98

4-10- بررسی ارتباط بین عوامل خونی مورد مطالعه………………………………………………………………. 98

4-11- بررسی ارتباط بین عوامل خونی و هورمون های مورد مطالعه……………………………………………. 100

فصل پنجم: بحث

5-1- شایع ترین علایم بالینی در افراد مبتلا به PCOS…………………………………………………………….. 101

5-2- شایع ترین عوامل خونی غیر طبیعی در افراد PCOS………………………………………………………… 104

5-3- تغییرات هورمونی افراد PCOS………………………………………………………………………………….. 105

5-4- متغیرهای دموگرافیک در بیماران PCOS……………………………………………………………………… 106

5-4-1- رابطه ی توده ی بدنی با هورمون ها و عوامل خونی در بیماران PCOS……………………………….. 106

5-4-1-1- رابطه ی توده ی بدنی و هورمون ها……………………………………………………………………….. 106

5-4-2- رابطه ی توده ی بدنی با عوامل خونی……………………………………………………………………….. 107

5-4-3- رابطه ی سن با هورمون ها و عوامل خونی در بیماران PCOS…………………………………………. 107

5-4-3-1- رابطه ی سن با هورمون ها………………………………………………………………………………….. 107

5-4-3-2- رابطه ی سن با عوامل خونی………………………………………………………………………………. 108

5-5- اثرات متقابل متغیرهای دموگرافیکی، هورمونی و خونی در بیماران PCOS……………………………. 109

5-6- کیفیت زندگی بیماران PCOS……………………………………………………………………………………. 110

5-7- نتیجه گیری کلی……………………………………………………………………………………………………… 111

6- منابع……………………………………………………………………………………………………………………….. 114

7- پیوست ها…………………………………………………………………………………………………………………. 127

8- چکیده ی انگلیسی………………………………………………………………………………………………………. 129

فهرستجدول ها

عنوان صفحه

جدول 2-1- خلاصه ای از مطالعاتی نشان دهنده ی میزان شیوع تخمدان پلی کیستیک PCO به کمک اولتراسونوگرافی (برگرفته از Koivunen, 2001)…………………………………………………………………………………………… 36

جدول 2-2- مشخصات بافت شناسی تخمدان پلی کیستیک (برگرفته از Koivunen, 2001)……………….. 37

جدول 2-3- معیار اولتراسونوگرافی برای تشخیص PCO (برگرفته از Koivunen, 2001)………………… 37

جدول 2-4- کرایتریای تشخیصی برای سندرم تخمدان پلی کیستیک برطبق تعاریف مختلف منتشر شده، برگرفته از Conder & Escobar-Morreale, 2007 )………………………………………………………………………………. 65

جدول3-1- تعداد افراد مورد مطالعه…………………………………………………………………………………… 67

جدول 3-2- مقادیر مورد انتظار برای سیستم تست LH به روش ELISA……………………………………. 72

جدول 3-3- مقادیر مورد انتظار برای سیستم تست FSH به روش ELISA………………………………….. 73

جدول 3-4- مقادیر مورد انتظار برای سیستم تست تستوسترون به روش ELISA………………………….. 74

جدول 3-5- مقادیر مورد انتظار برای سیستم تست پرولاکتین به روش ELISA…………………………….. 76

جدول 4-1- مقایسه ی ویژگی های جمعیت شناختی زنان مبتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک و زنان سالم (کنترل) 82

جدول 4-2- مقایسه ی هورمون های مورد بررسی زنان مبتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک و زنان سالم (کنترل) 83

جدول 4-3- مقایسه عوامل خونی زنان مبتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک و زنان سالم (کنترل)……….. 87

جدول 4-4- مقایسه ی عوامل بالینی زنان مبتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک و زنان سالم (کنترل)…….. 89

جدول 4-5- ضریب همبستگی اسپیرمن بین نمایه ی توده ی بدنی با هورمون های مورد بررسی در دو گروه زنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS…………………………………………………………………………………………………………… 91

جدول 4-6- ضریب همبستگی اسپیرمن بین نمایه ی توده ی بدنی با عوامل خونی مورد بررسی در دو گروه زنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS…………………………………………………………………………………………………………… 92

جدول 4-7- ضریب همبستگی اسپیرمن بین سن با هورمون های مورد بررسی در دو گروه زنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS………………………………………………………………………………………………………………………………….. 93

جدول 4-8- ضریب همبستگی اسپیرمن بین سن با عوامل خونی مورد بررسی در دو گروه زنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS………………………………………………………………………………………………………………………………….. 93

جدول 4-9- مقادیر حساسیت، ویژگی، ارزش اخباری مثبت و ارزش اخباری منفی هورمون های مورد بررسی در نقطه ی برش تعیین شده……………………………………………………………………………………………………………… 96

جدول 4-10- مقادیر حساسیت، ویژگی، ارزش اخباری مثبت و ارزش اخباری منفی عوامل خونی مورد بررسی در نقطه ی برش تعیین شده……………………………………………………………………………………………………………… 97

جدول 4-11- ضریب همبستگی اسپیرمن بین هورمون های مورد مطالعه در دو گروه زنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS 99

جدول 4-12- ضریب همبستگی اسپیرمن بین عوامل خونی مورد مطالعه در دو گروه زنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS 98

جدول 4-13- ضریب همبستگی اسپیرمن بین عوامل خونی و هورمون های مورد مطالعه در دو گروه زنان مبتلا و غیر مبتلا به PCOS …………………………………………………………………………………………………………………….. 100

فهرستنمودارها

عنوان صفحه

نمودار 4-1- مقایسه ی هورمون LH زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای……………… 83

نمودار 4-2- مقایسه ی هورمون FSH زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای……………. 84

نمودار 4-3- مقایسه ی نسبت LH/FSH زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای………… 84

نمودار 4-4- مقایسه ی هورمون تستوسترون زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای……. 84

نمودار 4-5- مقایسه ی هورمون DHEA-S زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای…….. 85

نمودار 4-6- مقایسه ی هورمون پرولاکتین زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای……… 85

نمودار 4-7- مقایسه ی هورمون آندروستندیون زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای… 85

نمودار 4-8- مقایسه ی هورمون پروژسترون زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای……. 86

نمودار 4-9- مقایسه ی هورمون استروژن زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای……….. 86

نمودار 4-10- مقایسه ی هورمون TSH زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای…………. 86

نمودار 4-11- مقایسه ی گلوکز زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای…………………… 87

نمودار 4-12- مقایسه ی کلسترول زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای……………….. 88

نمودار 4-13- مقایسه ی LDL زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای……………………. 88

نمودار 4-14- مقایسه ی HDL زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای…………………… 88

نمودار 4-15- مقایسه ی تری گلیسرید زنان گروه PCOS و کنترل با استفاده از نمودار جعبه ای…………… 89

نمودار 4-16- مقایسه عوامل بالینی درزنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS…………………………………………. 90

نمودار 4-17- منحنی مشخصه ی عملکرد (ROC) در نقاط برش مختلف هورمون های مورد مطالعه در دو گروه زنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS………………………………………………………………………………………………………… 94

نمودار 4-17- ادامه………………………………………………………………………………………………………… 95

نمودار 4-18- منحنی مشخصه ی عملکرد (ROC) در نقاط برش مختلف عوامل خونی مورد مطالعه در دو گروه زنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS………………………………………………………………………………………………………… 98

نمودار 4-18- ادامه………………………………………………………………………………………………………… 98

فهرستشکل ها

عنوان صفحه

شکل 2-1- برش عرضی تخمدان (برگرفته از Chedumbarum Pillay, 2009)………………………………. 12

شکل 2-2- تصویر سونوگرافی یک تخمدان پلی کیستیک (برگرفته از Koivunen, 2001)…………………. 38

شکل 2-3- مسیرهای ساخته شدن استروئیدها در فولیکول انترال تخمدان بر اساس دو گنادوتروپین (برگرفته از Koivunen, 2001)………………………………………………………………………………………………………….. 42

1-2-8-2 اصول پایه ای.. 13

1-2-9- هیبریداسیون در محل فلورسنتی (FISH) 15

1-2-9-1 تاریخچه. 15

1-2-9-2 اصول بنیادی.. 15

1-2-9-3 استفاده از FISH در پژوهش های ستوژنتیک حیوانات اهلی.. 16

1-2-9-4 استفاده از مكان یابی فیزیكی ژن ها با تكنیك FISH برای تایید صحت گردآوری های ژنوم موجودات.. 17

1-2-9-5 استفاده از مكان یابی فیزیكی ژن ها با تكنیك FISH برای اتصال نقشه های لینكاژی و RH روی كروموزوم ها 19

1-2-9-6 استفاده از مكان یابی فیزیكی ژن ها با تكنیك FISH در رهیافت كلونینگ موقعیتی ژن ها و QTLها 20

1-2-10 انواع پروب های کلون DNA ژنومی استفاده شده در FISH.. 21

1-2-11 ایمونوفلوروسنس… 21

1-2-12 ویژگی های متافاز ها و نقشه های سیتوژنتیك خانواده گاو سانان. 22

1-2-12-1 آتوزوم ها و نقشه های سیتوژنتیك… 22

1-2-12-2 كروموزوم های جنسی.. 26

1-2-13 بررسی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9. 27

1-2-13-1 ژن برولا (FecB) 27

) 28

1-2-13-3 ژن BMP15 (FecX) 29

1-2-13-4 اثر متقابل بین جهش های موثر بر باروری.. 30

فصل دوم. 32

بررسی منابع. 32

2-1 سابقه مطالعات سیتوژنتیک و نقشه یابی ژن ها با تكنیك FISH در حیوانات مزرعه ای.. 33

2-2 سابقه مطالعه ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در حیوانات مزرعه ای.. 37

فصل سوم. 40

مواد و روش ها 40

3- مواد و روش ها 41

3 – 1 تهیه نمونه های خون و کشت سلول های خونی.. 41

3 – 1- 1 تهیه ی نمونه های خون. 41

3 – 1- 2 کشت سلول های خونی با روش RB و انتخاب اسلاید های مناسب برای FISH.. 41

3-2 انتخاب و سفارش كلون های BAC.. 42

3-2-1 شناسایی كلون های BAC حاوی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9. 44

3-2-1-1 ژن BMPR1B.. 45

3-2-1-2 ژن BMP15. 46

3-2-1-3 ژن GDF9. 47

3-3 كشت باكتری های حاوی كلون های BAC و استخراج DNA.. 48

3-4 نشاندارسازی DNA استخراج شده از كلون های BAC.. 51

3-5 تهیه كاریوتایپ گاو، گاومیش رودخانه ای، گوسفند و بز. 51

3-6 هیبریداسیون در محل فلورسنتی (FISH) 51

3-7 مراحل بعد از FISH.. 52

3-7-1 آشكار سازی سیگنال های FITC.. 53

3-7-2 RBPI- باندینگ… 53

3-8 بررسی میكروسكوپی اسلایدها و ردیابی سیگنال های FITC.. 53

3-9 تعیین محل دقیق (باند كروموزومی) ژن های مورد مطالعه روی كروموزوم ها 54

فصل چهارم. 55

نتایج.. 55

4- نتایج.. 56

4-1 كیفیت DNA استخراج شده از كلون های BAC.. 56

4-2 نتایج حاصل از كشت سلولی و كاریوتایپ های تهیه شده برای گاو، گاو میش رودخانه ای، گوسفند و بز با روش RBA- باندینگ 56

) 56

) 56

) 56

) 57

4-3 جایگاه فیزیكی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 با استفاده از تكنیك FISH روی كروموزوم های RBPI- باندینگ گونه های مورد مطالعه. 57

) 57

) 57

) 57

) 58

4-4 مقایسه جایگاه فیزیكی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در گاو، گاو میش رودخانه ای، گوسفند و بز با انسان. 58

فصل پنجم. 96

بحث و نتیجه گیری.. 96

5- بحث.. 97

5-1 نقشه های ژنتیکی.. 97

5-2 تفاوت های نقشه های فیزیكی و لینكاژی.. 98

5-3 ژنومیکس مقایسه ای.. 99

5-4 نتیجه گیری نهایی.. 103

5-5 پیشنهادات.. 103

واژه نامه. 104

منابع و مآخذ. 106

Abstract 121

فهرست جداول

جدول 3-1. مواد استفاده شده در كشت سلول های لنفوسیت خون در پژوهش حاضر. 43

جدول 3-2. مشخصات كتابخانه BAC ژنوم گاوی موسسه INRA فرانسه. 44

جدول 3-3. مشخصات كامل كلون های BAC استفاده شده در پژوهش حاضر.44

جدول 3-4. تركیبات محلول های P1، P2 و P3 استفاده شده در استخراج DNA.. 50

جدول 4-1. جایگاه های ژنی نقشه یابی شده، کلون های BAC شناسایی شده

فهرست شکل ها

شکل 2-1. مقایسه ایمونوفلوروسنس مستقیم و غیر مستقیم. 22

شکل 3-1. اطلاعات كلون BtINRA-152G11استفاده شده به عنوان پروب در مكان یابی ژن BMPR1B.. 45

شکل 3-2. اطلاعات كلون BtINRA-745D07 استفاده شده به عنوان پروب در مكان یابی ژن BMPR1B. 46

شکل 3-3. اطلاعات كلون BtINRA-320H10 استفاده شده به عنوان پروب در مكان یابی ژن BMP15. 47

شکل 3-4. اطلاعات كلون BtINRA-748C10 استفاده شده به عنوان پروب در مكان یابی ژن BMP15. 48

شکل 3-5. اطلاعات كلون BtINRA-544F11 استفاده شده به عنوان پروب در مكان یابی ژن GDF9. 49

شکل 3-6. اطلاعات كلون BtINRA-444D9 استفاده شده به عنوان پروب در مكان یابی ژن GDF9. 50

شکل 3-7. مراحل نشاندار سازی DNA با روش Nick Translation. 52

شکل 4-1. نتایج حاصل از استخراج DNA از كلون های BAC استفاده شده در پژوهش حاضر. 60

شکل 4-2. كاریوتایپ RBA- باندینگ تهیه شده برای گاو (BTA) در پژوهش حاضر. 61

شکل 4-3. آیدیوگرام های G- باندینگ (چپ) و R- باندینگ (راست) گاو 62

شکل 4-4. كاریوتایپ RBA- باندینگ تهیه شده برای گاومیش رودخانه ای (BBU) در پژوهش حاضر. 63

شکل 4-5. آیدیوگرام های G- باندینگ (چپ) و R- باندینگ (راست) گاو میش رودخانه ای.. 64

شکل 4-6. كاریوتایپ RBA- باندینگ تهیه شده برای گوسفند (OAR) در پژوهش حاضر. 65

شکل 4-7. آیدیوگرام های G- باندینگ (چپ) و R- باندینگ (راست) گوسفند. 66

شکل 4-8. كاریوتایپ RBA- باندینگ تهیه شده برای بز (CHI) در پژوهش حاضر. 67

شکل 4-9. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMPR1B با استفاده ازتکنیک FISHو کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاو (BTA). 68

شکل 4-10. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMPR1B روی كروموزوم شماره 6 گاو (BTA) 69

شکل 4-11. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMP15 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاو (BTA). 70

شکل 4-12. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMP15 روی كروموزوم X گاو (BTA) 71

شکل 4-13. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن GDF9 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاو (BTA). 72

شکل 4-14. موقعیت دقیق کروموزومی ژن GDF9 روی كروموزوم شماره 7 گاو (BTA) 73

شکل 4-15. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMPR1B با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاومیش رودخانه ای (BBU). 74

شکل 4-16. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMPR1B روی كروموزوم شماره 7 گاو میش رودخانه ای (BBU) 75

شکل 4-17. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMP15 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاومیش (BBU). 76

شکل 4-18. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMP15 روی كروموزوم X گاو میش رودخانه ای (BBU) 77

شکل 4-19. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن GDF9 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاومیش (BBU). 78

شکل 4-20. موقعیت دقیق کروموزومی ژن GDF9 روی كروموزوم شماره 9 گاو میش رودخانه ای (BBU) 79

شکل 4-21. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMPR1B با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گوسفند (OAR). 80

شکل 4-22. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMPR1B روی كروموزوم شماره 6 گوسفند (OAR) 81

شکل 4-23. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMP15 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گوسفند (OAR). 82

شکل 4-24. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMP15 روی كروموزوم X گوسفند (OAR) 83

شکل 4-25. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن GDF9 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گوسفند (OAR). 84

شکل 4-26. موقعیت دقیق کروموزومی ژن GDF9 روی كروموزوم شماره 5 گوسفند (OAR) 85

شکل 4-27. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMPR1B با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در بز (CHI). 86

شکل 4-28. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMPR1B روی كروموزوم شماره 6 بز (CHI) 87

شکل 4-29. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMP15 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در بز (CHI). 88

شکل 4-30. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMP15 روی كروموزوم شماره X بز (CHI) 89

شکل 4-31. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن GDF9 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در بز (CHI). 90

شکل 4-32. موقعیت دقیق کروموزومی ژن GDF9 روی كروموزوم شماره 7 بز (CHI) 91

شکل 4-33. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاو (BTA)، گاومیش رودخانه ای (BBU)، گوسفند (OAR) و بز (CHI). 92

شکل 4-34. جایگاه فیزیکی ژن BMPR1B روی کروموزوم های R-باندینگ در گاو (BTA)، گاومیش رودخانه ای (BBU)، گوسفند (OAR) و بز (CHI) و مقایسه آن با انسان (HSA). 93

شکل 4-35. جایگاه فیزیکی ژن BMP15 روی کروموزوم های R-باندینگ در گاو (BTA)، گاومیش رودخانه ای (BBU)، گوسفند (OAR) و بز (CHI) و مقایسه آن با انسان (HSA). 94

شکل 4-36. جایگاه فیزیکی ژن GDF9 روی کروموزوم های R-باندینگ در گاو (BTA)، گاومیش رودخانه ای (BBU)، گوسفند (OAR) و بز (CHI) و مقایسه آن با انسان (HSA). 95

چکیده