1-2-2-تکنیک های مختلف انجمادی

3

1-2-2-1-انجماد آهسته

4

1-2-2-2-انجماد شیشه ای

5

1-2-3-محلول های انجمادی

5

1-2-3-1-ضدیخ ها

5

1-2-3-2-سرم

7

1-2-4-تاثیرات انجماد بر بافت بیضه

7

3- 1-3-پیوند

9

4- 1-4-کشت

10

5- 1-5-تغییرات ملکولی متاثر از انجماد

11

1-5-1-آپوپتوزیس

12

1-5-1-1-مسیر خارجی آپوپتوز و ژن های دخیل در آن

13

1-5-1-2-مسیرداخلی آپوپتوز و ژنهای دخیل در آن

14

1-5-1-3-P53

16

1-5-1-4-کاسپاز 3

17

1-6-هدف

18

1-7-پرسش پژوهشی

18

1-8-فرضیات

18

فصل دوم: مواد و روش ها

19

2-1-تهیه ی بافت بیضه و گروه های مورد مطالعه

20

2-2-انجماد شیشه ای بافت بیضه

21

2-2-1-روش تهیه محیط پایه

21

2-2-2-روش تهیه محلول های انجماد شیشه ای

21

2-2-2-1-روش آماده سازی محلول انجمادی I

21

2-2-2-2-روش آماده سازی محلول انجمادی II

22

2-2-3-مراحل انجماد شیشه ای

22

2-2-3-1-روش انجمادی I

22

2-2-3-2-روش انجمادی II

23

2-2-4-ذوب بافت بیضه

23

2-2-4-1-روش تهیه محلول های ذوب

23

2-2-4-2-مراحل ذوب

23

2-5-مطالعات میکروسکوپی و بافت شناسی بافت بیضه

24

2-6-بررسی آپوپتوز و بقا سلولی

26

2-6-1-هضم مکانیکی و آنزیمی بافت بیضه

26

2-6-1-1-هضم مکانیکی

27

2-6-1-2-هضم آنزیمی

27

2-6-1-3-خنثی سازی اثر آنزیم و بررسی بقا با استفاده از رنگ PI

27

2-6-2-ارزیابی بقای سلولی به روش فلوسایتومتری

28

2-6-3-بررسی آپوپتوز سلولی

29

2 -7-کشت بافت بیضه

30

2-7-1-آماده سازی آگار

30

2-7-2-آماده سازی محیط کشت

31

2-7-2-1-روش تهیه محیط RPMI

31

2-7-3-کشت بافت بیضه

32

2-8-ارزیابی ژن های آپوپتوزی

32

2-8-1-نگهداری بافت در محلول RNA-later

32

2-8-2-استخراج RNA با استفاده از ترایزول

32

2-8-2-1-هموژن کردن بافت

2-8-2-2-مرحله ی جداسازی

33

33

2-8-2-3-رسوب RNA

33

2-8-2-4-شستشو RNA

33

2-8-3-بررسی کیفی RNA های استخراج شده

34

2-8-4-تیمار نمونه­یRNA با استفاده از DNase1 جهت حذف آلودگی ژنومی

34

2-8-5-سنتز cDNA

35

2-8-6-پرایمر

37

2-8-6-1-آماده سازی پرایمرها

37

2-8-6-2-بررسی جایگاه اتصال پرایمرها

39

2-8-7-الکتروفورز

39

2-8-7-1-روش ساخت بافر50X TAE

39

2-8-7-2-روش ساخت بافر X TAE1

40

2-8-7-3-طرز تهیه ی ژل آگارز

40

2-8-7-4-بررسی آلودگی پرایمر

40

-8-7-4-بررسی کیفیت RNA

41

2-8-8-بررسی گرادیانت دمایی پرایمر

41

2-8-9 Real-Time PCR

42

2-8-9-2-بررسی کمی بیان ژن با استفاده از روش Real-Time PCR

43

2-9-آنالیز آماری داده

44

فصل سوم: نتایج

45

3-1-بررسی مورفولوژی بافت بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین

46

3-2-مقایسه بقای سلولی در گروه کنترل با گروه های انجمادی I و II بلافاصله پس از ذوب

46

3-3-بررسی میزان وقوع آپوپتوز پس از کشت بافت بیضه

47

3-3-1-ارزیابی میزان بقای سلولی طی کشت بافت بیضه

47

3-3-2-آپوپتوز اولیه ی سلولی طی کشت بافت بیضه

47

3-3-3-بررسی میزان وقوع آپوپتوز پس از کشت بافت بیضه

48

3-3-4-نکروز بافتی طی کشت بافت بیضه

48

3-4-بررسی بیان ژن های آپوپتوزی در سطح رونوشت

49

3-4-1-بررسی بیان رونوشت ژن های دخیل در مسیر های آپوپتوزی

49

3-4-2-Bax

49

3-4-3-BCL2

49

3-4-4-نسبت بیان BAX به BCL2

50

3-4-5-Caspase3

50

3-4-6-Fas

50

3-4-7-Fas Ligand

51

3-4-8-P53

51

27- فصل چهارم: بحث

66

4-1-کلیات

67

4-2-بررسی هایمورفولوژیکدر ساعات مختلف کشت در گروه های مورد مطالعه

68

4-3-بررسی بقا و آپوپتوز سلولی در گروه های مورد مطالعه

69

4-4-بررسی بیان ژن های مرتبط با وقوع آپوپتوز در گروه های مورد مطالعه

71

4-5-نتیجه گیری

75

4-6-پیشنهادات

76

 

فهرست جداول

عنوان صفحه

جدول 2-1-مراحل رنگ آمیزی هماتوکسیلین ایوزین	26
جدول2-2-مشخصات پرایمرهای مورد استفاده	39
جدول 2-3-برنامه ی مورد استفاده جهت بررسی گرادیانت دمایی پرایمرها	42
جدول 3-1- میانگین بقای سلولی درگروه های کنترل، انجمادی I و انجمادی II	53
جدول3-2- میانگین بقای سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف	53
جدول 3-3- میانگین درصد آپوپتوز اولیه ی سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	54
جدول 3-4-میانگین درصد آپوپتوز ثانویه ی سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	54
جدول 3-5- میانگین درصد سلول های نکروتیک در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	55
جدول 3-6-میزان بیان ژن Bax در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	55
جدول 3-7-میزان بیان ژن BCL2 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت53	56
جدول3-8-نسبت بیان BAX به BCL2 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	56
جدول3-9-میزان بیان ژن Caspase3 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	57
جدول 3-10-میزان بیان ژن Fas در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	57
جدول 3-11-میزان بیان ژنLigand Fas در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	58
جدول 3-12- میزان بیان ژن P53 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	58

فهرست اشکال

عنوان صفحه

ی نوشته‌ها