1-3-1 مارکرهای سطحی خاص سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 8

1-3-2 تنظیم سیستم ایمنی توسط سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 8

1-3-3 پتانسیل تمایزی سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 10

1-4 کاربرد درمانی سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 14

1-5 انواع فاکتورهای رشد عصبی (NTFs) و ساختمان مولکولی گیرنده­های مربوط به آن­ها 17

1-5-1 فاکتورهای نوروتروفیک… 17

1-5-1-1 انواع فاکتور­های نوروتروفیک… 18

1-5-2 گیرنده­های مربوط به فاکتورهای رشد عصبی.. 20

و اتصال نوروتروفین.. 20

1-5-2-2 ساختار گیرنده Trk و اتصال نوروتروفین.. 22

1-6 سلول­های بنیادی عصبی.. 25

1-6-1 نوروسفر. 25

1-6-1-1 نوروسفر منبعی برای سلول درمانی.. 31

1-7 ضرورت اهداف تحقیق.. 33

. 35

2-2 تهیه و نگهداری حیوان آزمایشگاهی.. 36

2-2 جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان موش صحرایی بالغ. 36

2-2-1 طرز تهیه محیط کشت a-MEM.. 36

2-2-2 طرز تهیهPBS فاقد كلسیم و منیزیم (2/7 : PH) 37

2-2-3 طرز تهیه تریپسین/ EDTA. 37

2-2-4 روش جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان. 39

2-2-5 پاساژ سلولی.. 39

2-3 تأیید هویت سلول های استرومایی به روش ایمونوسیتوشیمی.. 39

2-3-1 ایمونوسیتوشیمی CD71. 40

2-3-1-1 طرز تهیه پارافرمالدئید 4%. 41

2-3-1-2 طرز تهیه ژلاتین 1/0 درصد. 41

2-3-1-3 ساخت سرم بز 10%. 41

2-3-1-4 طرز تهیه PBS ایمنوسیتوشیمی (4/7 – 2/7 = PH). 42

2-3-1-5 طرز تهیه بافر گلیسرول.. 42

2-3-2 رنگ آمیزی آلکالین فسفاتاز 43

2-4بررسی مارکر عصبی βIII-tubulin در سلول های مزانشیمی مغز استخوان به روش ایمونوسیتوشیمی.. 44

2-5 تایید هویت عصبی نوروسفر­ها به روش ایمونوسیتوشیمی.. 45

2-6 بررسی مولكولی بیان ژن­های اعضای خانواده نوروتروفین.. 46

2-6-1 استخراج RNA كل از سلول های كشت شده 46

2-6-2بررسی کمی و کیفی RNA استخراج شده 48

2-6-3 الكتروفورز ژل آگارز 49

2-6-4 واکنش ساخت cDNA (واکنش رونویسی معکوسRT-) 52

2-6-5 انتخاب پرایمر. 53

2-6-6 آماده سازی پرایمرها 54

2-6-7 واكنش PCR. 54

2-7 آنالیز آماری.. 58

… 59

3-1 مشاهده مورفولوژی سلول های مزانشیمی مغز استخوان در شرایط کشت با میکروسکوپ اینورت.. 59

3-2 تعیین هویت سلول های مزانشیمی مغز استخوان با نشانگر CD71 و آلکالین فسفاتاز. 60

3-3 ویژگی­های مورفولوژیکی سلول های مزانشیمی مغز استخوان بعد از کشت طولانی مدت.. 60

3-4 تأیید هویت سلول های عصبی با استفاده از روش ایمونوسیتوشیمی.. 60

3-5 تأیید هویت نوروسفر­ها با استفاده از نشانگر نستین.. 61

3-6 ارزیابی بیان ژن­های فاكتورهای نوروتروفیك و مارکرهای نورونی و بررسی آماری شدت باند­ها و نمودار­های مربوط به آن 61

70

4-1 مورفولوژی سلول­های بنیادی مزانشیمی در کشت طولانی مدت و تایید هویت آن­ها 71

4-2 بیان فاکتورهای رشد عصبی به وسیله سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 72

4-3 پتانسیل تمایز سلول­های بنیادی مغز استخوان به سلول­های عصبی.. 74

4-4 تولید نوروسفر از سلول­های بنیادی مغز استخوان در كشت طولانی مدت.. 76

4-5 نتیجه گیری.. 77

پیشنهادات.. 77

مراجع 79

 

فهرست شکل­ها

تنظیم می­شود.. 22

P75NTR. 23

شکل 1-3. مسیرهای سیگنالینگ که با واسطه Trk تنظیم می­شود. 24

شکل 1-4. سلول­های بنیادی عصبی و رده­های سلولی مربوط به آن.. 25

شکل 1-5 .ارزیابی شکل­گیری نوروسفر. 26

شكل 1. تصاویر فاز كنتراست سلول­های استرومایی مغز استخوان موش صحرایی در محیط كشت در پاساژهای مختلف. 62

شكل 2. شناسایی سلول­های استرومایی مغز استخوان موش صحرایی.. 63

شکل 3. تصویر فاز کنتراست از MSCs در پاساژ پنجم بعد از دو هفته 64

شکل 3. تصویر فاز کنتراست از پاساژ پنجم MSCs پس از هفته سوم. 65

شکل4 تأیید هویت سلول های عصبی با استفاده از روش ایمونوسیتوشیمی 66

شکل 5 تأیید هویت نوروسفر­ها با استفاده از نشانگر نستین 66

شكل6 A.الگوی بیان ژن­ فاکتورهای نوروتروفیک در پاساژ پنجم سلول­های بنیادی مزانشیمی (گروه کنترل) و B: گروه آزمایشی (کشت طولانی مدت). 67

شكل 6. C الگوی بیان ژن پیش­ساز عصبی و ژن­های اختصاصی سلول­های دوپامینرژیک در پاساژ پنجم سلول­های بنیادی مزانشیمی (گروه کنترل) و D. گروه آزمایشی (کشت طولانی مدت). 67

نمودار 6 A. مقایسه میزان بیان نسبی ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک در گروه آزمایشی و کنترل.. 68

نمودار6 B.مقایسه میزان بیان نسبی ژن­های نورونی در گروه آزمایشی و کنترل.. 69

فهرست جدول­ها

جدول1-1 . اسامی گوناگون سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 6

جدول1-2 اطلاعات مربوط به پرایمرها، F : پرایمر بالادست ، R : پرایمر پایین دست.. 57

مقدمه

امروزه تحقیق بر روی سلول­های بنیادی به دانش پیشرفته­ای تبدیل شده است که نه تنها در حیات علمی، بلکه در بعد اقتصادی نیز موثر قلمداد می­شود ]1[. سال­هاست که این تفکر در ذهن دانشمندان شکل گرفته که با توجه به امکان تقسیم سلولی آیا می­توان درمان را بر پایه این سلول­ها بنا نهاد. این تفکر و تحقیق به تدریج به طرف طب جدیدی سوق داده می­شود که از آن به عنوان reparative (regenerative) medicine نام برده می­شود] 2[. پر واضح است برای رسیدن به این هدف، درک کامل بیولوژی سلولی و ماهیت سلول­های بنیادی از اهمیت ویژه­ای برخوردار است. خصوصا” علی­رغم تحقیقات وسیع، هنوز ابهامات متعددی پیرامون نحوه عملکرد سلول­های بنیادی وجود دارد ]3[.

سلول­های بنیادی، سلول­های زایای غیر بالغ­اند که قادر به خود تکثیری (Self-renewal) هستند و از این طریق جمعیت سلولی خود را حفظ می­کنند]4[. هر سلول بنیادی در کنام یا نیچ تنظیمی خود قرار گرفته است. کنام یک سلول، مجموعه­ای از عوامل فیزیکی و شیمیایی است که سلول را احاطه کرده است. از اعمال مهم کنام سلول­های بنیادی، تنظیم توازن بین خود نوزایی و تمایز است. یکی از مکانیسم­های تنظیم کننده این توازن کنترل تقسیم متقارن و نامتقارن می­باشد. در تقسیم نامتقارن، از تقسیم سلول ­بنیادی دو سلول دختری ایجاد می­گردد که یکی در کنام باقی مانده و دیگری کنام را ترک کرده تا تعداد زیادی پیش­ ساز ایجاد نماید و در نهایت به سلول­های بالغ تمایز پیدا می­کنند. در عوض در تقسیم متقارن، دو سلول­دختری ایجاد می­گردد که هر دو در کنام باقی مانده و به صورت بنیادی باقی می­مانند] 5، 6[. بنابراین سلول­های بنیادی، سلول­های تمایز نیافته­ای می­باشند که توانایی خود تکثیری، تولید نسل تمایز یافته عملکردی و ترمیم بافت بعد از صدمه را دارا هستند ]7[.

سلول­های بنیادی بر اساس قابلیت تمایز به سه گروه تقسیم می­شوند:

همه توان: جزء اولین سلول­هایی هستند که در جنین شکل می­گیرند ( از تخمک لقاح یافته 1-3 روزه)، قابلیت تمایز به انواع سلول­های ارگانیسم را دارند] 4[.

پر توان: از توده سلولی داخلی در مرحله بلاستوسیست 100تا 200 سلولی منشاء می­گیرند. این سلول­ها دارای توانایی تمایز و تکثیر نامحدود هستند و قادرند به هر سه لایه سلولی تمایز یابند]7[.

چند توان: این گروه را سلول­های بنیادی بالغ و یا سلول­های بنیادی سوماتیك نیز می نامند که بصورت خاموش و غیر متعهد حفظ می­شوند تا در آینده و بر اساس نیاز فعال شده و به سایر دودمان­های مربوط به همان بافت تمایز یابند]8[، به عنوان مثال سلول­های بنیادی خونساز در مغز استخوان به تمام انواع سلول­های خونی مانند گلبول های قرمز، لنفوسیت های B وT و … تمایز می یابند [9،10[.

سلول­های بنیادی از لحاظ منشاٴ به دو دسته­ی، سلول­های بنیادی جنینی (ESCs) و سلول­های بنیادی بالغ تقسیم می­شوند. از آنجا که استفاده از سلول­های بنیادی جنینی با مسائل اخلاقی و قانونی بسیار مواجه است و یا پیوند این سلول­ها خطر ایجاد بافت توموری را در پی خواهد داشت ]7،11[، بنابراین کلید حل این مشکل به دست آوردن منبع عظیمی از سلو­ل­هاست به گونه­ای­که قابلیت تمایز بالایی داشته باشد و قادر باشند به دفعات نامحدودی در محیط کشت تکثیر شوند تا تعداد کافی سلول قابل دسترس برای پیوند و یا هر کاربرد درمانی و پژوهشی فراهم آورد]4[.

سلول­های بنیادی مزانشیمی از مهم­ترین سلول­های بنیادی بالغ است. این سلول­ها اولین بار توسط مطالعات Friedenstein و Petrokova در سال 1966 استخراج شدند ]12[. سلول­های بنیادی مزانشیمی توان تمایز به چندین دودمان سلولی ازجمله استخوان، عصب، غضروف و كبد را دارند] 13 .[این سلول­ها به عنوان یك منبع ایده­آل برای سلول درمانی، ژن درمانی و به عنوان ابزاری برای درمان بیماری­های مادرزادی محسوب می­گردند] 14[. گزارش­هایی مبنی بر استفاده از این سلول­ها در مدل­های حیوانی برای درمان جراحات نخاعی] 15،16[، سكتة مغزی ]17 [و پاركینسون] 18 [وجود دارد.

لیشمانیا…………………………………………………………………………………………………………………… 20

1-5-1 خصوصیات بیماری لیشمانیا…………………………………………………………………………………………………. 19

1-5-2 لیشمانیوز احشایی…………………………………………………………………………………………………………………. 20

1-5-3 لیشمانیوز جلدی پس از کالاآزار (PKDL)……………………………………………………………………… 21

1-5-3-1 لیشمانیوز جلدی و اشکال بالینی آن………………………………………………………………………………. 22

1-5-3-2 لیشمانیوز جلدی خشک…………………………………………………………………………………………………. 22

1-5-3-3 لیشمانیوز جلدی مرطوب… 22

1-5-3-4 لیشمانیوز جلدی مزمن (Chronic Cutaneous Leisniasihmas)………………… 23

1-5-3-4-1 شکل لوپوئید یا عود کننده سالک (Lupoid or Recidivan form)…………….. 24

1-5-3-5 لیشمانیوز جلدی- مخاطی……………………………………………………………………………………………… 24

1-6 ایمنولوژی عفونت­های لیشمانیا…………………………………………………………………………………………………. 25

1-6-1 مشخصات ایمنولوژیكی در لیشمانیوز پوستی……………………………………………………………………. 25

1-6-1-1 نقش آنتی بادی یا ایمنی همورال…………………………………………………………………………………… 25

1-6-1-2 نقش ایمنی سلولی در لیشمانیوز جلدی………………………………………………………………………… 26

1-6-1-3 عمل سلولهای نوتروفیل و ماكروفاژ در لیشمانیوز………………………………………………………….. 26

1-6-1-3 عملکرد T-CELL……………………………………………………………… 27

1-6-2 مشخصات ایمنولوژیكی در لیشمانیوز احشایی…………………………………………………………………… 28

1-6-2-1 نقش ایمنی همورال در كالاآزار………………………………………………………………………………………. 28

1-6-2-3 نقش ایمنی سلولی در كالاآزار………………………………………………………………………………………… 28

4……………………………………………………. 29

1-7 روشهای تشخیص و مطالعه لیشمانیوز…………………………………………………………………………………….. 30

1-7-1 روشهای مستقیم تشخیص انگل…………………………………………………………………………………………… 30

1-7-1-1 . جداسازی انگل از کناره ضایعات پوستی یا بافتهای آلوده…………………………………………… 31

1-7-1-1 رنگ آمیزی……………………………………………………………………………………………………………………….. 31

1-7-1-2 کشت انگل………………………………………………………………………………………………………………………… 32

1-7-2 روشهای ایمنولوژی در شناسایی انگل………………………………………………………………………………… 32

1-7-2-1 آزمایشات سرولوژی برای بررسی ایمنی همورال…………………………………………………………… 32

1-7-2-2 آزمایشات ایمنولوژیکی جهت بررسی ایمنی سلولی………………………………………………………. 33

1-7-2-2-1 تستهای پوستی……………………………………………………………………………………………………………. 33

1-7-2-3 ماهیت پاسخهای ازدیاد حساسیت تاخیری (DTH)……………………………………………………. 34

1-7-3 آزمون پوستی لیشمانین یا تست مونتنگرو…………………………………………………………………………. 35

1-7-3-1 معرف آنتی­ژنی لیشمانین برای تست پوستی………………………………………………………………… 35

…………………….. 37

: بر متون گذشته

مواد و روشها

3-1کشت انگل……………………………………………………………………………………………………………………………………. 43

3 -1-1 مواد مورد نیاز جهت كشت انگل……………………………………………………………………………………….. 43

3-1-2. وسایل مورد نیاز جهت كشت انگل……………………………………………………………………………………… 43

3-1-3. طرز تهیه محیط كشت مایع RPMI- 1640 ………………………………………………………………….. 44

3-1-4. طرز تهیه محیط كشت كامل……………………………………………………………………………………………….. 44

3-1-5. طرز تهیه محیط كشت NNN……………………………………………………… 44

3-1-6. طرز تهیه (PBS) Phosphate Buffered Saline…………………………….. 45

3-1-7. روش كشت انگل…………………………………………………………………………………………………………………… 45

3-1-8. روش شمارش سلولها……………………………………………………………………………………………………………. 46

3-1-8-1. مواد و وسایل لازم جهت شمارش انگل…………………………………………………………………………. 46

3-1-8-2. شمارش با لام نئوبار………………………………………………………………………………………………………… 46

3-2. جداسازی انگلها با limiting dilution assay………………………………………. 47

3-2-1. مواد و وسایل مورد نیاز برای Limiting dilution assay……………………….. 48

3-2-2. مراحل Limiting dilution assay……………………………………………… 48

3-3. تهیه کرایو برای ذخیره در بانک سلولی…………………………………………………………………………………… 50

3-3-1. مواد و وسایل لازم جهت تهیه کرایو……………………………………………………………………………………. 50

3-4 تهیه آنتی­ژن Freeze – thaw از انگلها جهت درهم ریختگی غشاء و بروز تمامی آنتی­ژن­ها…………….. 52

3-5 الکتروفورز آنتی­ژن­های پروتئینی در ژل پلی­آکریل­آمید ( SDS-PAGE )………………………. 53

3-5-1 اصول الکتروفورز در ژل پلی­آکریل­آمید……………………………………………………………………………….. 53

3-5-2 سیستم بافری………………………………………………………………………………………………………………………… 54

3-5-3 مواد و وسایل مورد نیاز برای SDS-PAGE…………………………………………………………………… 54

3-5-4 آماده­سازی نمونه……………………………………………………………………………………………………………………. 57

3-5-6 طرز تهیه بافر الکترود……………………………………………………………………………………………………………. 57

3-5-7. روش انجام SDS-PAGE………………………………………………………… 58

3-5-8 روش رنگ­آمیزی با کوماسی آبی R- 250………………………………………….. 59

مواد مورد نیاز رنگ­آمیزی کوماسی آبی R- 250:…………………………………………………………………………… 59

3-6 سنجش میزان پروتئین تام با Bradford assay…………………………………….. 60

3-6-1 مواد و معرف­های مورد نیاز تست Bradford………………………………………. 60

3-6- 2 روش کار سنجش پروتئین تام……………………………………………………………………………………………. 61

3-7 تست Lymphocyte transformation test (L.T.T)………………………….. 62

3-7-1 روش انجام تست L.T.T……………………………………………………………. 63

1-3-7-1. مواد و وسایل لازم جهت انجام تست L.T.T…………………………………….. 64

3-8 ایمنی­زایی در خوکچه هندی…………………………………………………………………………………………………….. 66

3-8-1 مواد و وسایل مورد نیاز ایمنی­زایی در خوکچه هندی……………………………………………………….. 67

3-8-2 نحوه ایمنی­زایی در خوکچه………………………………………………………………………………………………… 67

3-9 تزریق داخل پوستی آنتی­ژن­ها و سنجش میزانDTH…………………………………. 69

3-9-1 مواد و وسایل لازم برای تزریق داخل پوستی و سنجش میزان DTH……………….. 69

3-9-2 مراحل تزریق داخل پوستی………………………………………………………………………………………………… 69

3-9-3 نحوه سنجش میزان DTH………………………………………………………… 70

4-1 کشت اولیه و جداسازی تک کلون­ها با روش limiting dilution…………………….. 72

4-2 بررسی پروفایل پروتئینی در آنالیز تک کلون­ها………………………………………………………………………. 72

4-3 نتایج میزان پروتئین تام آنتی­ژن­ها به روش Bradford……………………………….. 73

4-4 بررسی نتایج تست L.T.T…………………………………………………………….. 74

4-4-1 نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن B……………………………………………. 74

4-4-2 نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن C……………………………………………. 75

4-4-3. نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن D…………………………………………… 76

4-4-4 نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن لیشمانین استاندارد (M)…………………………………….. 76

4-4-5. بررسی نتایج حاصل از اندکس تحریکی تمامی آنتی­ژن­ها و میانگین آنها در مقایسه با Con-A 77

4-4-6 بررسی نتایج کلی L.T.T…………………………………………………………… 79

4-5 بررسی نتایج تست­های DTH بر روی خوکچه­های هندی……………………………………………………. 79

4-5-1 نتایج تست DTH 24 ساعته……………………………………………………………………………………………. 79

4-5-2 نتایج تست DTH 48 ساعته…………………………………………………………………………………………….. 82

4-5-3 نتایج تست DTH 72 ساعته…………………………………………………………………………………………….. 83

95

خلاصه انگلیسی………………………………………………………………………………………………..106

فهرست اشکال و جداول و نمودارها

عنوان صفحه

شکل 1-1. اشکال مختلف انگل های لیشمانیا ………………………………………………………………………………… 11

شکل1-2. پروماستیگوت لیشمانیا (خارج سلولی) …………………………………………………………………………… 14

شکل -1-3. اشکال اماستیگوت و پروماستیگوت …………………………………………………………………………….. 15

شکل 1-4. پشه خاکی ………………………………………………………………………………………………………………………. 17

شکل1-5. چرخه زندگی لیشمانیا در میزبان مهره دار …………………………………………………………………… 18

شکل 1-6.. اشکال مختلف لیشمانیوز جلدی (سالک) ……………………………………………………………………. 24

شکل 1-7. بلعیده شدن پروماستیگوت لیشمانیا توسط یک سلول ماکروفاژی …………………………….. 28

شکل3-1. شکل شماتیک لام نئوبار …………………………………………………………………………………………………. 48

جدول3-1. جدول تهیه ژل جدا کننده پایین SDS-PAGE ………………………………………………….. 56

جدول3-1. جدول تهیه ژل جدا کننده بالا SDS-PAGE ……………………………….. 57

جدول3-1. جدول تنظیم رقت دستگاه spect ……………………………………………………………………………… 62

شکل 4-1. پروفایل پروتئینی باندهای حاصل از تک­کلون­ها در مقایسه با نمونه لیشمانین استاندارد…………. 74

جدول 4-1. نتایج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتی­ژنB ……………………………………………………. 75

جدول 4-2. نتایج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن c……………………………………………………. 76

جدول 4-3. نتایج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتی­ژنی D……………………………… 77

جدول 4-4. نتایج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتی­ژنیM…………………………………………………… 78

جدول 4-5. مقایسه نتایج اندکس تحریکی به دست آمده در حضور نمونه­های آنتی­ژنی تک کلونی

و Con-A…………………………………………………………………………………… 79

نمودار1-4. نتایج میانگین اندکس تحریکی هر یک از تک کلون­ها در تست L.T.T………….. 80

جدول4-6. میانگین تست­های DTH ،24 ساعته………………………………………………………………………… 81

نمودار 2-4. بررسی نتایج تست­های داخل پوستی پس از 24 ساعت ………………………………………. 81

جدول4-7. میانگین تست­های DTH ، 48 ساعته ……………………………………………………………………….. 82

نمودار 4-3. بررسی نتایج تست­های داخل پوستی پس از 48 ساعت ………………………………………. 82

جدول4-8. میانگین تست­های DTH ،72ساعته ………………………………………………………………………… 83

نمودار 4-4. بررسی نتایج تست­های داخل پوستی پس از 72 ساعت …………………………………………. 83

خلاصه فارسی

 

مقدمه: لیشمانیا ماژور یک انگل پاتوژن پروتوزوأ داخل سلولی است که عامل طیف وسیعی از عفونت­های پوستی با پیامدهای بالینی متنوع، از یک زخم پوستی خود بهبود شونده تا زخم­های گسترش یافته غیر بهبود شونده می­باشد. ایمنی سلولی نقش مهمی در مقاومت در برابر لیشمانیا ماژور بازی می­کند. واکنش­های حساسیت شدید دیررس که با تست­های پوستی لیشمانین تشخیص داده می­شوند یک روش تشخیصی برای سنجش ایمنی سلولی است و بطور وسیع برای سنجش اپیدمیولوژیکی افراد در معرض آنتی­ژن­های لیشمانیایی، سنجش واکسن­های کاندید و در کمک به تشخیص، مورد استفاده است. تست پوستی لیشمانین پبطور عمومی به نام تست مونتنگرو یا تست لیشمانین شناخته می­شود، که نیازمند یک آنتی­ژن استاندارد خالص و هموژن می­باشد.

هدف: تهیه و سنجش تک­کلون­های جداشده از لیشمانیا ماژور برای تست­ پوستی

روش: جداسازی تک­کلون­ها از سوش لیشمانیا ماژور مرجع (MRHO/IR/75/ER) به روش رقت دهی محدود شونده انجام گرفت. کلون­های جداشده با استفاده از روش­های برون­تنی، SDS-PAGE و تست تکثیر لنفوسیتی با استفاده از سلول­های تک­هسته­ایخون محیطیافراد بهبود یافته از عفونت لیشمانیا ماژور مورد ارزیابی قرار گرفتند. توانایی هر تک­کلون جداشده با تست پوستی چهار خوکچه هندی ایمن شده دربرابر لیشمانیا ماژور مورد سنجش قرار گرفته شدند. تک­کلون­های جداشده به­همراه لیشمانین در ناحیه اصلاح شده شکمی حیوان­ها بطور داخل پوستی تزریق شدند.

 

نتایج: نتایج نشان دادند که سه نمونه از هفت تک­کلون­ ( نمونهDو(B,Cدر آنالیزهای SDS-PAGE یک تک باند را نشان دادند. این تک­کلون­ها برای سنجش در تست تکثیر لنفوسیتی مورد استفاده قرار گرفتند که همگی میزان ضریب تحریک (03/2±71/8، 65/2±71/8، 13/2±43/8 به ترتیب) قابل مقایسه­ای با لیشمانین ( 512/3±10) نشان دادند. سنجش درون­تنی تک­کلون­های جداشده، در خوکچه­های هندی نشان داد که هر سه تک­کلون میزان القاء قابل قبولی در مقایسه با لیشمانین از خود نشان دادند. بعلاوه، کلونC(83/0±333/7) میزان القاء معنادار بیشتری از لیشمانین ( mm00/4) در خوکچه­های هندی تست شده با آنتی­ژنCنشان داد.

2-5- تغییرات نفت پس از ورود به آب دریا.. 17

2-5-1 پراکنده شدن.. 18

2-5-2 پخش شدن مواد نفتی در سطح آب.. 18

2-5-3 حل شدن.. 18

2-5-4 تبخیر شدن.. 18

2-5-5 اکسیداسیون فتوشیمیایی.. 18

2-5-6 بحالت امولسیون در آمدن.. 19

2-5-7 قابلیت تجزیه زیستی.. 19

2-5-8 ته نشین شدن.. 19

2-6- تجزیه زیستی.. 20

2-7- معرفیهیدروکربنهای آروماتیک.. 20

2-7-1 طبقه بندی ترکیبات آروماتیک.. 20

2-7-2 فرمولاسیون ترکیبات آروماتیک.. 21

2-7-3 خواص فیزیکی و شیمیایی.. 22

2-7-4 درجه سمیت ترکیبات آروماتیک.. 23

2-7-5 اثرات هیدروکربن های پلی آروماتیک روی سلامتی انسان ها و موجودات زنده.. 27

2-7-6 هیدروکربن های پلی سیکلیک آروماتیک و سرطان.. 27

2-7-7 چه عاملی ترکیب را سرطان زا می کند؟.. 27

2-8- فنل.. 28

2-8-1 کلیات ترکیب فنل.. 28

2-8-2 نام گذاری.. 28

2-8-3 فنول های طبیعی.. 29

2-8-4 ساختمان مولکولی و خواص فیزیکی.. 29

2-8-5 خواص فیزیکی.. 29

2-8-6 تأثیر فنل بر محیط زیست و موجودات زنده.. 30

2-8-7 کاربردها.. 30

2-9- تجزیه زیستی.. 30

2-9-1 روش های پاکسازی بیولوژیکی.. 31

2-9-2 مبانی زیست درمانی.. 32

2-9-3 میکروارگانیسم های هوازی.. 32

2-9-4 میکروارگانیسم های بی هوازی.. 32

2-9-5 مخمرها و قارچ ها.. 33

2-9-6 استفاده ازبیوراکتورها.. 33

2-9-7 کو متابولیسم.. 34

2-9-8 دی نیتریفیکاسیون.. 34

2-9-9 کمپوست کردن.. 34

2-9-10 درمان بیولوژیکی.. 34

2-10- میکروارگانیسم های تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک.. 35

2-11- مسیر های تجزیه زیستی.. 36

2-11-1 تجزیه میکروبی فنل.. 36

2-11-2 تجزیه میکروبی نفتالین.. 39

فصل سوم:روش شناسی تحقیق

3-1- محیط کشت های مورد استفاده.. 44

3-1-1 محیط ONR7a. 44

3-1-2 محیط (ONR7a + نفتالین) آگار.. 45

3-1-3 محیط) +ONR7a فنل( آگار.. 45

3-1-4 محیط مارین براث (MB).. 45

3-1-5 محیط مارین آگار (MA).. 46

3-1-6 محیط نوترینت براث (NB).. 46

3-1-7 محیط نوترینت آگار (NA).. 46

3-2- محلول ها.. 47

3-2-1 سرم فیزیولوژی.. 47

3-2-2 محلول اتیلن دی آمینو تترا استیک اسید (EDTA).. 47

3-2-3 محلول Tris-Base. 48

3-2-4 محلول TBE.. 48

3-2-5 محلول EDTA Tris-Base- (TE) 48

3-2-6 محلول اتیدیوم بروماید.. 48

3-3- مواد مصرف شده در PCR.. 49

3-4- دستگاه های مورد استفاده.. 49

3-5- روش عملی.. 50

3-5-1 نمونه برداری به منظور جداسازی باکتری های تجزیه کننده 50

3-5-2 شمارش باکتری های موجود در محیط.. 51

3-5-2-1 شمارش باکتری های هتروتروف.. 51

3-5-2-2 شمارش باکتری های تجزیه کننده نفتالین.. 51

3-5-2-3 شمارش باکتری های تجزیه کننده فنل.. 51

3-5-3 جداسازی باکتری های تجزیه کننده.. 51

3-5-3-1 جداسازی و غربالگری باکتری های تجزیه کننده.. 51

3-5-3-2 تست های تکمیلی.. 52

3-5-3-2-1 سنجش رشد باکتری.. 52

3-5-3-2-2 فعالیت امولسیون کنندگی (E24) 52

3-5-3-2-3 سنجش حذف فنل.. 52

3-5-3-2-4 سنجش حذف نفتالین.. 52

3-5-4 شناسایی باکتری ها.. 53

3-5-4-1 استخراج DNA ژنومی با روش فنل کلروفورم.. 53

3-5-4-2 تعیین غلظت DNA استخراج شده.. 54

3-5-4-3 برنامه وغلظت مواد مورد استفاده در PCR.. 54

3-5-4-4 بررسی محصول PCR.. 54

3-5-4-5BLAST کردن نتایج حاصل از توالی یابی نوکلئوتیدی نمونه ها.. 55

 

 

فصل چهارم:نتایج یافته های تحقیق

4-1- نمونه برداری.. 57

4-2- شمارش باکتری ها.. 58

4-2-1 شمارش تعداد کل هتروتروف ها.. 58

4-2-2 شمارش تعداد کل تجزیه کننده ها.. 60

4-3- نکات ایمنی جهت استفاده از فنل و نفتالین.. 61

4-4- جداسازی میکروارگانیسم های تجزیه کننده.. 62

4-4-1 کشت نمونه ها در محیط ONR7a به اضافه فنل جهت جداسازی باکتری های تجزیه کننده فنل.. 62

4-4-2 کشت نمونه ها در محیط ONR7a به اضافه نفتالین جهت جداسازی باکتری های تجزیه کننده نفتالین.. 62

4-5- تست های تکمیلی جهت انتخاب باکتری هایی با توان بالای تجزیه فنل و نفتالین.. 63

4-5-1 سنجش میزان رشد باکتری های تجزیه کننده فنل و نفتالین 63

4-5-2 فعالیت امولسیون کنندگی (E24).. 67

4-5-3 سنجش حذف ترکیبات آروماتیک.. 71

4-5-3-1 سنجش حذف نفتالین.. 71

4-5-3-2 سنجش حذف فنل.. 73

4-6- شناسایی مولکولی نمونه های تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک 75

4-6-1 بررسی محصول PCR.. 75

4-6-2 BLAST کردن توالی نوکلئوتیدی نمونه ها.. 76

4-7- رسم درخت فیلوژنی برای سویه ها.. 92

4-8- فاصله ژنتیکی بین سویه ها.. 94

 

 

فصل پنجم:بحث و نتیجه گیری

5-1- بحث و نتیجه گیری.. 97

5-2- پیشنهادات.. 100

منابع و مآخذ.. 101

فهرست منابع فارسی.. 101

فهرست منابع انگلیسی.. 103

چکیده انگلیسی.. 108

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست جداول

عنوان شماره صفحه

جدول 2-1: 28 ترکیبات آروماتیک به ترتیب میزان سمیت. 23

جدول 3-1: ترکیبات محیط کشت ONR7a. 44

جدول 3-2: ترکیبات محیط کشت مارین براث (MB) 45

جدول 3-3: ترکیبات محیط کشت نوترینت براث. 46

جدول 3-4: ترکیبات سرم فیزیولوژی. 47

جدول 3-5: ترکیبات سرم فیزیولوژی. 47

جدول 3-6: توالی و خصوصیات پرایمر های مورد استفاده جهت شناسایی ژن 16 SrRNA.. 49

جدول 3-7: دستگاه های مورد استفاده و مدل آنها. 49

جدول 3-8: غلظت مواد مورد استفاده در PCR با پرایمرهایAlk 54

جدول 4-1: نامگذاری و معرفی نقاط نمونه گیری بر حسب مشخصات جغرافیایی 57

جدول 4-2: نتایج شمارش باکتری های هتروتروف. 59

جدول 4-3: نتایج شمارش کل باکتری های تجزیه کننده. 60

جدول 4-4: نتایج میزان جذب نوری نمونه های تجزیه کننده فنل در طول موج 600 نانومتر. 64

جدول 4-5: نتایج میزان جذب نوری نمونه های تجزیه کننده نفتالین در طول موج 600 نانومتر. 65

جدول 4-6: نتایج تست E24 برای نمونه های تجزیه کننده نفتالین 68

جدول 4-7: نتایج تست E24 برای نمونه های تجزیه کننده فنل. 70

جدول 4-8: نتایج جذب UV جهت بررسی درصد حذف نفتالین. 72

جدول 4-9: نتایج جذب UV جهت بررسی درصد حذف فنل. 74

جدول 4-10: برنامه رسم درخت فیلوژنی سویه ها. 92

جدول 4-11: برنامه رسم جدول فاصله های ژنتیکی سویه ها. 94

جدول 4-12: فاصله ژنتیکی سویه ها. 94

 

فهرست نمودارها

عنوان شماره صفحه

نمودار 2-1: مسیر تجزیه میکروبی فنل. 36

نمودار 2-2: مسیر تجزیه میکروبی نفتالین. 39

نمودار 4-1: درصد حذف فنل توسط سویه های تجزیه کننده این ترکیب 73

نمودار 4-2: درصد حذف فنل توسط سویه های تجزیه کننده این ترکیب 74

 

 

 

فهرست شکل ها

عنوان شماره صفحه

شکل 2-1: فرمول ککوله حلقه بنزن. 21

شکل 2-2: فرمول ساختاری بنزن. 21

شکل 2-3: نمایش موقعیت جانشینی روی حلقه دی متیل بنزن. 21

شکل 2-4: برخی از آروماتیک های چند هسته ای فشرده. 22

شکل 2-5: فرمول تترالین یا تتراهیدرونفتالن. 22

شکل 2-6: مکانیسم های بروز سرطان. 26

شکل 2-7: فرمول ساختاری فنل. 28

شکل 4-1: پوشش کارشناس و نحوه قرار گیری صحیح در حین انجام کار با ترکیبات آروماتیک زیر هود. 62

………………………………………………9

1-4-1- طبقه بندی تالابها توسط کنوانسیون رامسر………………………………………………………………………………..9

1-5- عملکرد و ارزش تالاب………………………………………………………………………………………………………………………….10

1-5-1- زیستگاهی برای حیات وحش و آبزیان …………………………………………………………………………………….10

1-5-2- مکانی برای تحقیقات علمی و آموزشی ……………………………………………………………………………………11

1-5-3- چرخه وتغییر شکل (دگرگونی) مواد…………………………………………………………………………………………11

1-5-4-تغییر و کاهش قدرت تخریب سیلاب…………………………………………………………………………………………11

1-5-5-تغذیه آب های زیر زمینی…………………………………………………………………………………………………………..12

1-5-6- حفظ و نگهداری ذرات معلق ……………………………………………………………………………………………………12

1-5-7- صادرات محصولات…………………………………………………………………………………………………………………….12

1-5-8- مواد خام ………………………………………………………………………………………………………………………………….12

1-5-9- تفرج ………………………………………………………………………………………………………………………………………….13

1-5-10-تثبیت خاک …………………………………………………………………………………………………………………………….13

1-6- عوامل تهدید و تخریب تالابها ……………………………………………………………………………………………………………..13

1- 6-1- عوامل انسانی …………………………………………………………………………………………………………………………..13

1-6-2- تبدیل اکوسیستم های تالابی به زمینهای کشاورزی………………………………………………………………..13

1-6-3- رودخانه ها و جریانات آبی آلوده ………………………………………………………………………………………………14

1-6-4- رسوبات حمل شده به تالاب …………………………………………………………………………………………………….14

1-6-5- عدم وجود مدیریتی هدفدار و توانمند……………………………………………………………………………………….14

1-6-6- استفاده از تالابها به عنوان مناطق تفرجگاهی…………………………………………………………………………..14

1-7 – جوامع جلبكی در اكوسیستم های آبی………………………………………………………………………………………………15

1-8- فیتوپلانکتون ها……………………………………………………………………………………………………………………………………16

1- 9- رده های مهم فیتوپلانکتون ها……………………………………………………………………………………………………………18

1- 9- 1- رده باسیلاریوفیسه یا دیاتومه ها…………………………………………………………………………………………….18

1-9- 2- رده داینوفیسه ( داینوفلاژله ها )……………………………………………………………………………………………..19

1-9- 3- جلبک های سبز پلانکتونی(رده کلروفیسه )……………………………………………………………………………20

1-9- 4- اوگلناهای تاژکدار(رده اوگلنوفیسه)…………………………………………………………………………………………21

1-9- 5- جلبک های قهوه ای- طلائی (رده (Chrysophyceae …………………………………………………………..21

1-9- 6- رده Prymnesiophyceae ……………………………………………………………………………………………………….21

1-9- 7- رده کریپتوفیسه………………………………………………………………………………………………………………………..22

1-9- 8- جلبك های سبز- آبی (رده سیانوفیسه یا سیانوباكترها)…………………………………………………………22

1-10- جلبک های کف زی………………………………………………………………………………………………………………………..23

1-10-1- فراوانی و پراکنش جلبک های کف زی……………………………………………………………………………….24

1-11- عوامل مؤثر بر ترکیبات جامعه وتولیدات جلبک های کف زی…………………………………………………………26

1-11-1- نور……………………………………………………………………………………………………………………………………………26

1-11-2- مواد مغذی………………………………………………………………………………………………………………………………28

1-11-3- جریان آب……………………………………………………………………………………………………………………………….32

1-11-4- بستر…………………………………………………………………………………………………………………………………………35

1- 11-5- دما………………………………………………………………………………………………………………………………………….36

1-11-6- چرا…………………………………………………………………………………………………………………………………………37

1-12- تغییرات زمانی و مکانی در جلبک های کف زی……………………………………………………………………………..37

1-13- ارزیابی کیفیت آب تالابها ها با استفاده از فیتوپلانکتون ها……………………………………………………………..39

1-14- اهداف تحقیق…………………………………………………………………………………………………………………………………..41

 

فصل دوم:مواد و روش ها

2-1- مشخصات، موقعیت جغرافیایی و وضعیت اقلیمی منطقه……………………………………………………………………43

2-2- حیات وحش……………………………………………………………………………………………………………………………………….45

2-3- خصوصیات رویشگاهها و گسترشگاههای گیاهان در منطقه……………………………………………………………….45

2-4- وسایل و مواد مورد استفاده ……………………………………………………………………………………………………………….46

2-5- تعیین ایستگاه های نمونه برداری……………………………………………………………………………………………………….47

2-6- دوره های نمونه برداری……………………………………………………………………………………………………………………..48

2-7- روشهای نمونه برداری…………………………………………………………………………………………………………………………48

2-8- تثبیت و آماده سازی نمونه ها…………………………………………………………………………………………………………….49

2-9 – متغییرهای اندازه گیری شده در آزمایشگاه……………………………………………………………………………………….50

2-9-1- روش اندازه گیری وزن زنده (Bio mass)………………………………………………………………………………..50

2-9-2- روش اندازه گیری وزن خشک (Dray mass) …………………………………………………………………………50

2-9-3- روش اندازه گیری وزن خشک بدون خاکستر (A.F.D.M ) …………………………………………………..50

2- 9- 4- تعیین میزان کلروفیل a ………………………………………………………………………………………………………..50

2-10- شناسایی جلبکها……………………………………………………………………………………………………………………………….51

2-11- نحوه شمارش جلبک ها…………………………………………………………………………………………………………………….51

فصل سوم:نتایج

3-1- متغییرهای اندازه گیری شده…………………………………………………………………………………………………………….54

3-1-1- تغییرات وزن زنده (Bio mass )……………………………………………………………………………………………….54

3-1-2- تغییرات وزن خشک (Dray mass) …………………………………………………………………………………………54

3-1-3- تغییرات وزن خشک بدون خاکستر(A.F.D.M) ……………………………………………………………………..55

3-1-4- تغییرات میزان کلروفیل a (Chlorophylle a ) ……………………………………………………………………….56

3-2- جامعه فیتوپلانکتونی …………………………………………………………………………………………………………………………..56

3-3- بررسیتاکسونومیکیفیتوپلانکتونها …………………………………………………………………………………………………..57

3-4 – مقایسه نموداری فیتوپلانکتون های مشاهده شده در دو ایستگاه …………………………………………………60

3-4-1- مقایسه شاخه های ثبت شده …………………………………………………………………………………………………..60

3-4-2- مقایسه جنس های ثبت شده…………………………………………………………………………………………………..61

3-5- شرح برخی از شاخه ها و جنس های مهم مشاهده شده در تالاب زریبار………………………………………….65

 

فصل چهارم:بحث و نتیجه گیری

4-1- متغییر های اندازه گیری شده ……………………………………………………………………………………………………………73

4-2- بحث نتایج تاکسونومیک فیتوپلانکتون ها …………………………………………………………………………………………73

4-3- پیشنهادات …………………………………………………………………………………………………………………………………………..75

منابع……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..77

فهرست شکل ها و نمودارها

عنوان صفحه شکل2-1- موقعیت دریاچه زریبار وایستگاههای مورد بررسی …………………………………………………………………………….43

شکل 2-2- ایستگاه ده ره تفه ……………………………………………………………………………………………………………………………….47

شکل 2-3- ایستگاه سد خاکی ……………………………………………………………………………………………………………………………..48

شکل2-4- نمونه بستر آماده شده قبل از استقرا ر در ایستگاه ها ………………………………………………………………………..49

شکل 2-5- نمونه بستر آماده شده بعد از استقرار در ایستگاه ها و نشست پریفیتون ………………………………………..49

شکل 2-6- اجزای مختلف لام هماسیتومتر (لام شمارش جلبک ها ) ………………………………………………………………52

نمودار 3-1- تغییرات وزن زنده در ایستگاهها ی مورد بررسی در دوره نمونه برداری ………………………………………..54

نمودار 3-2- تغییرات وزن خشک در ایستگاهها ی مورد بررسی در دوره نمونه برداری …………………………………….55

نمودار 3-3- تغییرات وزن خشک بدون ایستگاهها ی مورد بررسی در دوره نمونه خاکستر در برداری………………55

نمودار 3-4- تغییرات میزان کلروفیلa ایستگاهها ی مورد بررسی در دوره نمونه خاکستر در برداری……………….56

نمودار 3-5- درصد شاخه های مختلف فیتوپلانکتون های دریاچه زریبار در دوره مطالعه ………………………………..60

نمودار3-6- درصد جنس های مشاهده شده شاخه Chlorophyceae در دوره مطالعه …………………………………….61

نمودار3-7- درصد جنس های مشاهده شده شاخهBacillariophyceae در دوره مطالعه…………………………………..61

نمودار3-8- درصد جنس های مشاهده شده شاخهConjugatophyceae در دوره مطالعه………………………………….62

نمودار3-9- درصد جنس های مشاهده شده شاخهCryptophyceae در دوره مطالعه ………………………………………62

نمودار3-10- درصد جنس های مشاهده شده شاخهCyanobacteria در دوره مطالعه………………………………………63

…………………………………………………………………………………………………………………………………….. 1

مقدمه ………………………………………………………………………………………………………………………………………..3

فصل اول کلیات …………………………………………………………………………………………………….. 5

1-1-پیشینه تاریخی ………………………………………………………………………………………………………………….. 6

1-2-آماده سازی ال-آسپاراژیناز قابل استفاده برای درمان ……………………………………………………………… 8

1-3- آزمایش های بالینی با ال-آسپاراژیناز ……………………………………………………………………………….. 10

1-4-خصوصیات شیمیایی و داروشناسی این دارو ………………………………………………………………………. 12

1-4-1 اثر ضد سرطانی ………………………………………………………………………………………………………….. 12

1-4-2- ترکیبات شیمیایی داروی در دسترس برای درمان …………………………………………………………… 14

1-4-2-1 آنزیم طبیعی ……………………………………………………………………………………………………………. 14

1-4-2-2-آنزیم تغییریافته ………………………………………………………………………………………………………. 16

1-5- فارماکوکنتیک ……………………………………………………………………………………………………………….. 19

1-5-1- مقاومت دارویی ………………………………………………………………………………………………………… 23

1-5-2- تأثیر دارویی ………………………………………………………………………………………………………….. 25

1-6-سمیّت ………………………………………………………………………………………………………………………… 28

فصل دوم روش کار …………………………………………………………………………………………… 34

2-1- مواد و میکروارگانیسم ها ……………………………………………………………………………………………….35

2-2- کشت باکتری ……………………………………………………………………………………………………………… 35

2-3- اعمالUV در زمان های مختلف …………………………………………………………………………………… 35

2-4- انجام تستNesslerizationبه منظور بررسی مقدار آمونیاک آزاد شده ..……………………….. 36

2-4-1- کشت کلنی ها ……………………………………………………………………………………………………….. 36

2-4-2- تعیین غلظت آمونیاک آزاد شده در محلول واکنش توسط ال-آسپاراژیناز کلنی ها …………… 37

2-4-3- محلول های لازم برای سنجش میزان فعالیت آنزیم ال-آسپاراژیناز کلنی ها ……………………. 38

2-5-استخراجDNA…………………………………………………………………………………………………………. 40

2-5-1- کشت باکتری به منظور استخراج DNA…………………………………………………………………….. 40

2-5-2- استخراج DNA ژنومی ……………………………………………………………………………………………. 41

2-6- واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR) ………………………………………………………………………………. 42

2-7- الکتروفورز بر روی ژل آگارز ……………………………………………………………………………………. 43

2-8- خالص سازی محصول PCR …………………………………………………………………………………….. 44

2-9- استخراج پلاسمید ……………………………………………………………………………………………………. 46

2-10- هضم آنزیمی و کلون کردن قطعه در داخل وکتور ……………………………………………………… 47

2-10-1- الگوی برش آنزیمی ژن ال-آسپاراژیناز ll …………………………………………………………….. 47

2-10-2- برش و آماده سازی وکتور pET23a(+) ……………………………………………………………… 48

2-10-3- واکنش الحاق وکتور pET23a(+) با قطعه ژنی ال-آسپاراژینازll ……………………………. 48

2-11-ایجاد سلول های Competant و انتقال پلاسمید …………………………………………………….. 49

2-12-انتخاب کلون های مثبت …………………………………………………………………………………………. 50

2-13- تأیید کلنی های نوترکیب باPCRو هضم آنزیمی …………………………………………………….. 51

2-13-1-PCR ……………………………………………………………………………………………………………….. 51

2-13-2- هضم آنزیمی ……………………………………………………………………………………………………. 52

2-14- بیان و استخراج پروتئین بیان شونده توسط ژن آنزیم ال-آسپاراژینازll …………………………. 53

2-14-1- القاء بیان پروتئین آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll…………………………………………………………… 53

2-14-2- استخراج پروتئین های آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll و ال-آسپاراژیناز l ………………………… 54

2-15- بررسی اولیه بیان پروتئین نوترکیب ال-آسپاراژیناز ll و پروتئین ال-آسپاراژیناز l با SDS-

PAGE …………………………………………………………………………………………………………………………… 55

2-16- تعیین فعالیت آنزیمی یا فعالیت کلّی( IU ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز …………………………. 58

2-17- تعیین پروتئین کلّی ( mg ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز ……………………………………………….. 59

2-18- تعیین فعالیت ویژه( IU/mg ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز ………………………………………….. 62

2-19- کشت سلول انسانی ………………………………………………………………………………………………. 62

2-19-1- تهیه محیط كشت RPMI1640…………………………………………………………………………. 63

2-20- تاثیر آنزیم ال-آسپاراژینازll(نوترکیب)،ال-آسپاراژینازlو آنزیم استاندارد بر سلول های

سرطانی انسانی ………………………………………………………………………………………………………………. 63

2-20-1- MTT Assay …………………………………………………………………………………………………. 63

2-21- تست تغییرات سیتوپلاسمی سلول های سرطانی بعد از انجام تست MTT …………………… 65

فصل سوم نتایج …………………………………………………………………………………………….. 67

3-1- بررسی و شماره گذاری کلنی ها ………………………………………………………………………………. 68

3-2- نتایج اعداد جذب محلول های استاندارد سولفات آمونیوم در طول موج nm490 …………… 69

3-3- بررسی اعداد جذب آمونیاک آزاد شده در محلول های به دست آمده از کلنی های جهش

یافته ……………………………………………………………………………………………………………………………… 70

3-4- جداسازی و تکثیر ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز ll ……………………………………………………………. 72

3-5- تعیین توالی قطعه ژنیl-aspsraginase ll…………………………………………………………….. 74

3-6- وارد کردن قطعه ژنیl-asparaginase ll در وکتور pET23a و تأیید آن …………………. 76

3-7- نتیجه SDS-PAGE نمونه های آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll , l و استاندارد ………………………… 79

3-8- محاسبۀ فعالیت آنزیمی(IU) ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و ال-آسپاراژیناز

استاندارد ……………………………………………………………………………………………………………………….. 80

3-9- تعیین پروتئین کلّی (mg) آنزیم های ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و ال-

آسپاراژیناز استاندارد ………………………………………………………………………………………………………… 82

3-10- تعیین فعالیت ویژه( IU/mg ) آنزیم های ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و

ال-آسپاراژیناز استاندارد ………………………………………………………………………………………………….. 84

3-11- بررسی تأثیر آنزیم ال-آسپاراژینازll (نوترکیب)، ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول

های سرطانی HeLa ………………………………………………………………………………………………………. 85

3-12- بررسی تأثیر آنزیم ال-آسپاراژینازll (نوترکیب)، ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول

های سرطانی LCL ……………………………………………………………………………………………………….. 89

3-13- بررسی تغییرات سیتوپلاسمی سلول های سرطانی بعد از انجام تست MTT ………………… 97

فصل چهارم بحث و پیشنهادات ………………………………………………………………………. 98

منابع …………………………………………………………………………………………………………………………….. 108