حجم………………………………………………………………………………………………………………………………………….15

1-5-6- غلظت………………………………………………………………………………………………………………………………………..16

1-6- انواع مرگ سلولی و تعریف آن………………………………………………………………………………………………………18

1-6-1- نکروز…………………………………………………………………………………………………………………………………………18

1-6-2- آپوپتوز سلولی…………………………………………………………………………………………………………………………..18

1-6-2-1 مراحل آپوپتوز ……………………………………………………………………………………………………………………….19

1-6-2-2 مسیر های آپوپتوز………………………………………………………………………………………………………………….21

1-6-2-3- عناصر کلیدی مسیرهای آپوپتوز………………………………………………………………………………………….21

1-6-2-4- روش های بررسی آپوپتوز …………………………………………………………………………………………………..23

1-6-2-4-1- بررسی تغییرات غشاء پلاسمایی در مرگ سول ……………………………………………………………23

1-6-2-4-1-1- تعیین فسفاتیدیل سرین سطح بیرونی غشاء سلول……………………………………………………24

1-6-2-4-2- بررسی سیتوتوکسیسیتی ………………………………………………………………………………………………24

1-6-2-4-3- بررسی تغییرات مورفولوژی …………………………………………………………………………………………..25

1-6-2-4-3-1- استفاده از میکروسکوپ الکترونی………………………………………………………………………………25

1-6-2-4-3-2- استفاده از میکروسکوپ نوری وفلورسانس………………………………………………………………..25

1-7- منشاء آسیب DNA اسپرم…………………………………………………………………………………………………………26

1-7-1- بسته بندی غیرطبیعی كروماتین……………………………………………………………………………………………27

1-8- ساختار کروماتین اسپرم و تأثیر آن بر ناباروری …………………………………………………………………………28

1-8-1- بررسی ساختار کروماتین اسپرم……………………………………………………………………………………………..28

1-9- نقش آپوپتوز در آسیب DNA اسپرم………………………………………………………………………………………..29

1-10- استرس اكسیداتیو به واسطه ROS…………………………………………………………………………………………30

1-11- تاثیر عوامل محیطی برسلامت DNA و میزان موفقیت روشهای کمک باروری…………………..31

1-11-1- مصرف سیگار………………………………………………………………………………………………………………………..31

1-11-2- مواجهات شغلی…………………………………………………………………………………………………………………….32

1-11-3- داروهای شیمی درمانی و رادیوتراپی……………………………………………………………………………………33

1-11-4- سن………………………………………………………………………………………………………………………………………..33

1-12- تكنیك­های بررسی ساختار كروماتین……………………………………………………………………………………….33

1-12-1- روش­های تعیین آسیب DNA اسپرم انسان………………………………………………………………………34

1-12-1-1- تست TUNEL……………………………………………………………………………………………………………….35

1-12-1-2- روش DBD-FISH………………………………………………………………………………………………………..35

1-12-1-3- روش Comet…………………………………………………………………………………………………………………..36

1-12-1-4- رنگ­آمیزی CMA3…………………………………………………………………………………………………………36

1-12-1-5- تكنیك SCSA………………………………………………………………………………………………………………..37

1-12-1-6- تست SCD……………………………………………………………………………………………………………………..37

1-12-1-7- رنگ­آمیزی آكریدین اورانژ………………………………………………………………………………………………..39

1-12-1-8- رنگ­­آمیزی تولوئیدین بلو………………………………………………………………………………………………….39

1-13- روش مهاجرت اسپرم………………………………………………………………………………………………………………….39

1-14- روش سانتریفیوژ شیب غلظت…………………………………………………………………………………………………….40

فصل دوم- مواد و روش ها………………………………………………………………………………………………………………………41

2-1- مواد و وسایل مورد نیاز…………………………………………………………………………………………………………………42

2-1-1- وسایل مورد نیاز………………………………………………………………………………………………………………………….42

2-1-2- مواد مورد نیاز……………………………………………………………………………………………………………………………..42

2-2- ساخت محلول های مورد نیاز…………………………………………………………………………………………………………45

2-2-1- ساخت محلول Ham’s F10…………………………………………………………………………………………………….45

2-2-2- محلول های لازم برای تست پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)…………………………………………..46

2-2-3- ساخت محلول تانل……………………………………………………………………………………………………………………..46

2-2-4- ساخت محلول (PBS)……………………………………………………………………………………………………………….46

2-2-5- ساخت رنگ ائوزین-نیگروزین…………………………………………………………………………………………………….47

2-2-6- ساخت رنگ رایت………………………………………………………………………………………………………………………..47

2-3- روشها………………………………………………………………………………………………………………………………………………..48

2-3-1- روش جمع آوری اسپرم…………………………………………………………………………………………………………….. 48

2-3-2- آنالیز مایع انزالی………………………………………………………………………………………………………………………… 48

2-3-2-1- آزمایشات ماکروسکوپی…………………………………………………………………………………………………………..48

2-3-2-1-1- ظاهر………………………………………………………………………………………………………………………………….48

2-3-2-1-2- آبکی کردن…………………………………………………………………………………………………………………………48

2-3-2-1-3- حجم………………………………………………………………………………………………………………………………….48

2-3-2-1-4- چسبندگی…………………………………………………………………………………………………………………………48

2-3-2-2- آزمایشات میکروسکوپی………………………………………………………………………………………………………….49

2-3-2-2-1- آگلوتیناسیون……………………………………………………………………………………………………………………..50

2-3-2-2-2- بررسی تعداد اسپرم…………………………………………………………………………………………………………..50

2-3-2-2-2-1- روش استفاده از MAKLER CHAMBER برای شمارش ………………………………………..50

2-3-2-2-3- ارزیابی تحرک……………………………………………………………………………………………………………………51

2-3-2-2-3-1- روش کار……………………………………………………………………………………………………………………….52

2-3-2-2-4- ارزیابی قابلیت حیات…………………………………………………………………………………………………………53

2-3-2-2-4-1- روش کار رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین………………………………………………………………………53

2-3-2-2-5- ارزیابی مورفولوژی………………………………………………………………………………………………………………54

2-3-2-2-5-1- رنگ آمیزی پاپانیکولا……………………………………………………………………………………………………54

2-3-2-2-5-2- روش فیکس کردن………………………………………………………………………………………………………..54

2-3-2-2-5-3-روش رنگ آمیزی پاپانیکولا……………………………………………………………………………………………55

2-3-3- Direct swim-up………………………………………………………………………………………………………………………57

2-3-3-1- روش کار………………………………………………………………………………………………………………………………….57

2-3-4- تست بررسی میزان پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)……………………………………………………………58

2-3-4-1- روش کار…………………………………………………………………………………………………………………………………58

2-3-5- روش رنگ آمیزی تانل…………………………………………………………………………………………………………………60

2-3-6- آنالیز آماری………………………………………………………………………………………………………………………………….62

فصل سوم- نتایج………………………………………………………………………………………………………………………………………..63

3-1 نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی تحرک اسپرم………………………………64

3-2- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قابلیت حیات اسپرم………………….67

3-3- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی مورفولوژی اسپرم……………………..68

3-4- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….70

3-5- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم………………………………………………………………………………….72

3-6- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی آپوپتوز اسپرم………………………………………………………………………………………………………………75

3-7- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم……………………………………78

3-8- رابطه میزان آپوپتوز اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم…………………………………………………………………..79

3-9- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با میزان آپوپتوز اسپرم…………………………………………..80

3-10- نتایج کلی……………………………………………………………………………………………………………………………………80

فصل چهارم- بحث………………………………………………………………………………………………………………………………….81

4-1- تا ثیر روش آماده سازی Dricct Swim up بر روی پارامترهای اسپرم………………………………………83

4-2- تاثیر زمان های مختلف انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد بر روی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم…………………………………………………………………………………………………………………..84

4-3- پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………….90

منابع

چکیده انگلیسی

فهرست شکل ها

عنوان صحنه

1-1- ساختار اسپرم انسانی……………………………………………………………………………………………………………………..9

1-2- ارزیابی آسیب DNA توسط: …………..…………….…A.TUNEL, B.COMET, C.CMA337

1-3- تست SCD………………………………………………………………………………………………………………………………….38

2-1- انواع مختلف آگلوتیناسیون…………………………………………………………………………………………………………..50

2-2- MAKLER CHAMBERبرای شمارش اسپرم استفاده می شود………………………………………………51

2 -3- شکل لامل MAKLER CHAMBER …………………………………………………………………………………….52

2-4- چگونگی قرارگیری لوله فالکون بازاویه 45 درجه در انکوباتور…………………………………………………….57

3-1- رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین برای سنجش میزان زنده یا مرده بودن اسپرم…………………………….67

3-2- رنگ آمیزی پاپانیکولا ………………………………………………………………………………………………………………….69

3-3- تست SCD برای بررسی میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم میباشد……………………………………74

3-4- رنگ آمیزی TUNEL………………………………………………………………………………………………………………….76

فهرست جدول ها

عنوان صفحه

1-1 : خصوصیات میکرسکوپی نمونه انزال طبیعی مطابق با استاندارد های سازمان بهداشت جهانی (2010/WHO)…………………………………………………………………………………………………………………………………….17

2-1- ساخت Ham’sf10……………………………………………………………………………………………………………………..45

2-2- محلول های لازم برای رنگ آمیزی پاپانیکولا………………………………………………………………………………55

3-1-مقایسه پارامترهای اسپرمی قبل و بعد از آماده سازی اسپرم ……………………………………………………..71

3-2-مقایسه میانگین اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قطعه قطعه شدن DNA آپوپتوز اسپرم……………………………………..77

3-3-مقایسه مقدار P اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم…………………………………..77