1-5 مکانیسم ایجاد تنوع در طول توالی‏های تکراری……………………………. 16

1-5-1 کراسینگ اور نابرابر…………………………………………… 17

1-5-2 عدم جفت شدن ناشی از سرخوردنDNA در طول رشته (خطاهای همانند سازی)…….17

1-6 دامنه تنوع واحدهای تکرارشونده………………………………………….. 19

1-6-1 مدل جهش گام به گام…………………………………………… 19

1-6-2 مدل آللی نا‏محدود…………………………………………… 19

1-7 مارکرهای STR…………………………………………….

1-8 کاربرد مارکرهای STR…………………………………………….

1-8-1 مطالعات شجره‏ای و روابط فامیلی……………………………………………. 20

1-8-2 شناسایی هویت قربانیان حوادث……………………………………………. 21

1-8-3 تعیین هویت در موارد جنایی……………………………………………. 22

1-8-3-1 شناسایی افراد مجهول الهویه…………………………………………… 22

1-8-3-2 ردیابی مجرمین……………………………………………. 22

1-8-4 ردیابی تاریخ بشر و مطالعات جمعیتی……………………………………. 23

1-9 سایر کاربردهای مارکرهای STR…………………………………………….

1-9-1 جمع آوری سلول های جنینی از خون مادر……………………………… 25

1-9-2 نقشه‏ی ژنوم بیماری‏ها………………………………………….. 26

1-9-3 تعیین هویت افراد استفاده کننده از سرنگ مشترک………………………. 26

1-9-4 تشخیص کلون‏های موفق……………………………………………. 26

1-9-5 بررسی و نظارت روی پیوند عضو…………………………………………… 26

1-9-6 تشخیص کایمرهای ژنتیکی……………………………………………. 26

1-9-7 مشخص نمودن خطوط سلولی……………………………………………. 27

1-9-8 تشخیص تومورهای سرطانی……………………………………………. 27

1-10 روش‏های کلی شناسایی هویت افراد در سطح مولکولی……………………. 27

1-10-1 روش انگشت نگاری ژنتیکی از طریق هیبرید کردن با DNA جستجوگر………. 27

1-10-1-1 محدودیت‏های روش انگشت نگاری……………………………………………. 29

1-10-2 روش پروفایلینگ…………………………………………….. 29

1-11 تاریخچه استفاده از مارکرهایSTR…………………………………………….

1-12 CODIS چیست؟…………………………………………… 31

1-13 کیت مورد استفاده در تعیین هویت……………………………………………. 32

1-14 معرفی استان‏ها………………………………………….. 34

1-14-1 استان کرمانشاه………………………………………….. 34

1-14-1-1 موقعیت جغرافیایی……………………………………………. 34

1-14-2 استان یَزد…………………………………………… 35

1-14-2-1 موقعیت جغرافیایی……………………………………………. 36

1-15 هدف از تحقیق………………………………………….. 37

فصل دوم…………………………………………… 38

2-1 نمونه گیری……………………………………………. 39

2-2 استخراج DNA به روش نمک اشباع…………………………………………… 39

2-3 آماده سازی نمونه ها جهت انجام تست DNA Typing…………………………..

۲-3-1 رسوب گذاری با اتانول…………………………………………… 41

2-3-2 تعیین غلظت نمونه های DNA توسط دستگاه Nanodrop……………………

2-3-3 تهیه ی Working Stoke……………………………………………

2-4 تست DNA Typing……………………………………………

2-4-1 Multiplex PCR…………………………………………….

2-5 مواد و تجهیزات مورد نیاز در DNA Typing…………………………………..

2-5-1 آزمایش DNA Typing……………………………………………

2-5-2 جداسازی قطعات……………………………………………. 45

2-5-2-1 تجهیزات لازم…………………………………………… 45

2-5-2-2 آماده سازی دستگاه جهت جداسازی قطعات………………….. 46

2-5-2-3 روش جداسازی قطعات……………………………………………. 46

2-6 آنالیز داده ها………………………………………….. 47

3-1 نمونه ‏ها………………………………………….. 53

3-2 پروفایل ژنتیکی……………………………………………. 53

3-2 نتایج حاصل از آنالیز نمونه‏ ها …………………………………………..55

3-3 نتایج حاصل از آنالیز نمونه‏های کرمانشاه…………………………………. 56

3-4 نتایج حاصل از آنالیز نمونه های یزد…………………………………………… 60

فصل چهارم…………………………………………… 65

4-1 بحث……………………………………………. 66

4-2 نتیجه ‏گیری……………………………………………. 73

4-3 پیشنهادات……………………………………………. 73

منابع انگلیسی……………………………………………. 74

منابع فارسی……………………………………………75

چکیده:

بررسی تنوع ژنتیکی در جمعیت‏ها با استفاده ار تعیین فراوانی آللی و پارامترهای ژنتیکی روش نوینی است که در سال‏های گذشته در بسیاری از جمعیت‏های جهان صورت گرفته و با استفاده از آن شباهت بسیاری از جمعیت‏ها به یکدیگر مشخص گردیده. شباهت جمعیت‏ها نشان دهنده‏ی همسان بودن خزانه‏ی ژنتیکی آنها و احتمالا یکسان بودن آن جمعیت‏ها در گذشته است. پس این احتمال وجود دارد که این جمعیت‏ها در گذشته یک جمعیت بوده باشند و بعد‏ها به دلایل جغرافیایی و یا مهاجرت‏ها از یکدیگر جدا شده باشند. یکی از راه‏های بررسی تنوع ژنتیکی در جمعیت‏ها استفاده از توالی‏های کوتاه تکراری می‏باشد .هدف این مطالعه بررسی تنوع ژنتیکی در دو قوم یزد و کرد (کرمانشاه) از ایران بود. بدین منظور پروفایل ژنتیکی پنجاه فرد غیر خویشاوند از هر یک از جمعیت‏های کرمانشاه و یزد با استفاده از کیت ABIتهیه شد. این کیت حاوی پانزده جایگاه D8S1179،D21S11 ، D7S820،CSF ،D3S1358 ،TH01 ، D13S317، D16S539،D2S1338 ، D19S433، VWA، TPOX،D18S51 ، D5S818،FGA ،VWA ، TPOX و TH01 و ژن آمیلوژنین (برای تعیین جنسیت افراد) می‏باشد. نتایج نشان دادند که به جز دو جایگاه D7S820 وD19S433 در جمعیت کرمانشاه و سه جایگاه D21S11 ,D19S433 و VWA در یزد سایر جایگاه‏ها در تعادل هاردی‏واینبرگ بودند. همچنین پارامترهای پزشکی قانونی شامل PIC,PD,PE,MP در این مطالعه بررسی شدند. سپس دو جمعیت با جمعیت‏های کشورهای همسایه مقایسه شدند. این مطالعه نشان داد که این جایگاه‏ها، جایگاه‏های مناسب برای استفاده در تست‏های تعیین هویت و مطالعات جمعیتی می‏باشند. در نتیجه‏‏ی مقایسات هم دیده شد که هر دو جمعیت یزد و کرمانشاه شباهت زیادی به جمعیت کشور ترکیه داشتند ولی با سایر کشورها متفاوت بودند. از طرفی یزد نسبت به کرمانشاه دارای جمعیت همگن تری بود که این مسئله می‏تواند به علت بکر بودن این جمعیت در طول سالیان مختلف باشد.

فصل اول: مقدمه

1-1- مقدمه

درگذشته مطالعه‏ی تکامل و مهاجرت‏ها از طریق کشف و بررسی بقایای اسکلتی و فسیل‏ها انجام می‏شد. اما از حدود سه دهه‏ی پیش، باستان‏شناسان و زیست‏شناسان با به کار‏گیری آنالیز‏های DNA موفق به کشف‏های بسیار دقیقی شدند که کمک فراوانی به ردیابی تاریخ مهاجرت بشر و تکامل انسان‏ها نموده است. یکی از پر‏کاربرد‏ترین راه‏های آنالیز DNA، بررسی نشان گرهای[1] ژنتیکی افراد است، که از مهم ترین آنها می‏توان به توالی‏های کوتاه تکراری[2] موسوم به STR اشاره کرد. STR‏ها، توالی‏هایی به طول یک تا سیزده نوکلئوتید هستند که در ژنوم موجودات در نواحی غیر کد‏کننده موجود می‏باشند. هر فرد توالی‏های منحصر به فردی دارد و هیچ دو نفری در جهان نیستند که توالی‏های یکسانی داشته باشند. به همین دلیل ازSTR ‏ها می‏توان در مطالعات جمعیتی و بررسی تنوع ژنتیکی در جمعیت‏ها سود جست [1].

علاوه بر مطالعات جمعیتی ازSTR ‏ها می‏توان در موارد تعیین هویت‏، تعیین ابویت، تست‏های پزشکی‏قانونی و سایر موارد استفاده کرد. به طور معمول STRهایی که برای تعیین هویت و مطالعات ژنتیکی جمعیت به کار می‏روند، یکسان هستند و شامل پانزده جایگاه به نام‏های D8S1179،D21S11 ، D7S820،CSF ،D3S1358 ،TH01 ، D13S317، D16S539،D2S1338 ، D19S433، VWA، TPOX،D18S51 ، D5S818،FGA ،VWA ، TPOXو TH01 می‏باشند [1].

هم چنین از روش مشترکی موسوم به تعیین الگوی DNA در این زمینه‏ها استفاده می‏شود. هر فرد دارای الگوی DNA منحصر به فرد است که تا پایان عمر تغییر نخواهد کرد. محققان دریافتند که افراد یک جمعیت در الگوهای ژنتیکی خود دارای تشابهاتی هستند که منحصر به همان جمعیت است و با الگوی افراد جمعیت‏های دیگر متفاوت است. از این تفاوت‏ها می‏توان برای ردیابی تاریخ مهاجرت و تکامل انسان‏ها استفاده نمود (1).

2-1- نشانگر چیست؟

صفاتی را که می‏توانند به عنوان نشانه‏ای برای شناسایی افراد حامل آن صفت مورد استفاده قرار گیرند، نشان گر می‏نامند. مندل نخستین کسی بود که از نشان گرهای ظاهری برای مطالعه چگونگی توارث صفات در نخود فرنگی استفاده کرد. اما گاهی صفات به سادگی و با چشم غیر مسلح قابل مشاهده نیستند، مانند گروه خونی. برای مشاهده چنین صفاتی باید آزمایش‏های خاصی صورت گیرد. به طور کلی هر صفتی که بین افراد متفاوت باشد، ناشی از تفاوت موجود میان محتوای ژنوم آنها می‏باشد. حتی بروز صفات به صورت متفاوت در میان افراد (در شرایط محیطی یکسان)، به علت تفاوت‏ در ژنوم آنها است. این تفاوت‏ها می‏توانند به عنوان نشانه یا نشان گر ژنتیک به کار گرفته شوند. به طور کلی برای آنکه صفتی به عنوان نشان گر ژنتیک مورد استفاده قرار گیرد، باید دست کم دو ویژگی داشته باشد :

1-در بین دو فرد متفاوت باشد (چند شکلی)

2-به توارث برسد (2).

3-1- انواع نشانگرهای ژنتیکی

نشان گرهای ژنتیکی عبارتند از:

1-نشان گرهای مورفولوژیک

2-نشان گرهای پروتئینی

3-نشان گرهای مولکولی در سطح DNA و RNA

1-3-1- نشان گرهای مورفولوژیک

کاربرد نشان گرهای مورفولوژیک به ده‏ها سال پیش از کشف DNA مربوط می‏شود. نشان گرهای مورفولوژیکی که پیامد جهش‏های قابل رویت در مورفولوژی هسته، از ابتدای این سده مورد استفاده قرار گرفتند. صفات مورفولوژیکی که عمدتا توسط یک ژن کنترل می‏شوند، می‏توانند به عنوان نشان گر مورد استفاده قرار گیرند. این نشان گرها شامل دامنه وسیعی از ژن‏های کنترل کننده صفات فنوتیپی هستند و جز نخستین نشان گرها به شمار می آیند و از زمان‏های بسیار دور یعنی از زمانی که محل ژن‏ها روی کروموزوم مشخص شد، مورد استفاده قرار می‏گرفتند (2).

معایب نشان گرهای مورفولوژیک

– اغلب دارای توارث غالب و مغلوب بوده و اثرات اپیستازی و پلیوتروپی دارند.

– تحت تاثیر شرایط محیطی و مرحله رشد موجود قرار می‏گیرند.

– فراوانی و تنوع کمی دارند.

– گاهی برای مشاهده و ثبت آنها باید منتظر ظهور آنها ماند.

– اساس ژنتیک بسیاری از نشان گرهای مورفولوژیک هنوز مشخص نشده است (2).

2-3-1- نشان گرهای پروتئینی

1-3-4-4) اختلالات اکتسابی…………………………. 24

1-3-4-5) ارث………………………….. 24

1-3-5) لجن صفراوی…………………………. 24

1-3-6)سنگ کلسترولی…………………………. 26

1-3-6-1) سنگ های پیگمانی…………………………. 26

تشخیص…………………………… 27

1-3-7) علائم بیماری سنگ کیسه صفرا…………………………. 28

1-3-7-1) سیر طبیعی…………………………. 29

درمان…………………………. 30

1-3-7-2) درمان جراحی…………………………. 30

1-3-7-3) درمان طبی- حل کردن سنگ کیسه صفرا …………………………31

1-3-8) کله سیستیت حاد …………………………32

1-3-8-1) مورفولوژی…………………………. 35

1-3-8-2) خصوصیات بالینی کوله سیستیت حاد …………………………36

1-3-8-3) کله سیستیت بدون سنگ…………………………… 36

1-3-9) کله سیستوپاتی بدون سنگ…………………………… 37

1-3-10) کله سیستیت آمفیزماتو…………………………. 38

1-3-11-1) کله سیستیت مزمن…………………………. 38

1-3-11-2) مرفولوژی…………………………. 40

1-3-11-3) خصوصیات بالینی کوله سیستیت مزمن………………………… 40

1-3-11-4) خصوصیات بالینی تشخیص کوله سیستیت حاد و مزمن………. 40

1-4) اختلالات مجاری صفراوی خارج کبدی………………………….41

1-4-1) کوله دوکولیتاز و کلانژیت صعودی…………………………. 41

1-4-2) آترزی صفراوی خارج کبدی…………………………. 42

1-4-2-1) سیر بالینی…………………………. 43

1-4-3) تومورها………………………… 43

1-4-3-1-1) سرطان کیسه صفرا………………………… 43

1-4-3-1-2)مورفولوژی………………………… 44

1-4-3-1-3) خصوصیات بالینی…………………………. 44

1-4-3-2) کارسینوم مجاری صفراوی خارج کبدی، از جمله آمپول واتر……45

1-4-3-2-1) مورفولوژی…………………………. 45

1-4-3-2-2) خصوصیات بالینی…………………………. 46

فصل دوم: سوابق مربوط………………………….. 49

فصل سوم: مواد و روشها………………………… 65

3-1) چکیده روش تحقیق………………………… 66

3-1-2) جامعة مورد مطالعه………………………… 67

3-1-3) منطقه مورد پژوهش…………………………… 68

3-1-4) روش نمونه گیری…………………………. 72

3-2-1) آماده سازی سنگ صفرا برای استخراج DNA………………

3-2-2) آماده سازی لایه مخاطی کیسه صفرا برای استخراج DNA……..

3-2-3) آماده سازی مایع صفراوی برای استخراج DNA………………….

3-3) روش استخراج DNA به روش کیت سینا ژن…………………….. 75

3-4) واکنش زنجیره ای پلیمرازی…………………………. 76

3-4-1)مواد………………………… 77

3-4-1-1) میكروتیوب ها و نوك سمپلرها………………………… 77

3-4-1-2) محلول بافری PCR با غلظت 5X…………………………..

3-4-1-3) Mgcl_{2…………………………}

3-4-1-4) Kcl …………………………

3-4-1-5) Tris Hcl…………………………

3-4-1-6) مخلوط نوكلئوزیدها (dNTPs) …………………………78

3-4-1-7) Taq DNA polymerase………………………….

3-4-1-7-1) DNA polymerase Smart…………………………

3-4-1-8) پرایمرها …………………………79

3-4-1-9) سایز ماركر…………………………. 80

3-4-1-10) اتیدیوم بروماید…………………………. 81

3-4-1-11) Loading Buffer…………………………

3-4-1-12) ژل آگاروز …………………………81

3-4-2) مواد لازم برای تهیه TBE 1X…………………………..

3-4-2-1) طرز تهیه بافر TBE 1X…………………………..

3-4-3) نرم افزارهای مورد استفاده………………………… 82

3-9) ژل الكتروفورز محصولات PCR…………………………..

3-10) کشت هلیکوباکتر…………………………. 91

3-11-1) بررسی میزان IgG هلیکوباکتر پیلوری در سرم خون……….. 92

3-11-2) شیکر الیزا………………………… 95

3-11-3) شوینده الیزا………………………… 96

3-11-4) خواننده الیزا………………………… 97

3-11-5) مراحل انجام آزمون الیزا که تقریبا در تمام انواع آن مشترک است عبارت است از…98

3-11-6) روش کار با کیت Monobind Anti-H. PyloriIgG…………………………..

3-11-7) مراحل انجام آزمایشH. PyloriIgG…………………………..

فصل چهارم: نتایج………………………….. 102

4-1 ) نتایج مربوط به افراد مورد مطالعه در این پژوهش………………. 103

4-2) نتایج مربوط به حضور ژن hsp60 در بیماران کله سیستیت مزمن……. 114

4-3) نتایج مربوط به حضور ژن hsp60 در بیماران کله سیستیت حاد………. 116

4-4) نتایج مربوط به حضور ژن hsp60 در مایع صفرا گروه شاهد………………. 118

4-5) نتایج مربوط به میزان فراوانی نسبی تست IgG هلیکوباکتر……………. 121

4-6) نتایج مربوط به میزان فراوانی نسبی BMI…………………………

4-7) نتایج مربوط به ژن 16s rRNA هلیکوباکتر بیلیس………………………… 131

4-8) نتایج مربوط به میزان فراوانی نسبی هلیکوباکتر هپاتیکوس…………… 133

4-9) نتایج مربوط به میزان فراوانی نسبی هلیکوباکتر پولوروم…………… 133

4-10) نتایج مربوط به میزان فراوانی نسبی هلیکوباکتر پیلوری، هلیکوباکتر هپاتیکوس، هلیکوباکتر بیلیس و هلیکوباکتر پولوروم در سنگ کیسه صفرا در بیماران کله سیستیت مزمن………………………… 133

4-11) نتایج مربوط به کشت هلیکوباکتر…………………………. 133

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری………………………….. 134

پیشنهادات………………………….. 148

منابع…………………………. 149

چکیده:

زمینه و هدف: سنگ کیسه صفرا یکی از علت های عمده جراحی دستگاه گوارش بوده، علاوه بر این، میزان بیماری های صفراوی و سنگ کیسه صفرا به تدریج رو به افزایش است. اخیرا، نویسندگان متعددی، گزارشاتی مبنی بر حضورDNA هلیکوباکتر پیلوری و هلیکوباکتر های مقاوم به صفرا در درخت صفراوی انسان و کلونیزاسیون در دستگاه صفراوی حیوانات داشته اند. در حال حاضر هدف از این بررسی، طراحی مطالعه مورد-شاهدی برای برسسی حضور گونه های هلیکوباکتر، به خصوص هلیکوباکتر پیلوری، هلیکوباکتر هپاتیکوس، هلیکوباکتر بیلیس و هلیکوباکتر پولوروم، در سنگ، مایع و بافت بیماران مبتلا به بیماری های صفراوی و مایع صفرای بیماران غیر مبتلا به بیماری های صفراوی در بیمارستان الزهرا(س) بوده است.

مواد و روش ها: سرم خون و مایع صفرای 25 بیمار غیر مبتلا به بیماری های صفراوی تحت کلانژیوپانکرانوگراف برگشتی، به عنوان گروه شاهد جمع آوری گردید. سرم خون، مایع، سنگ و بافت کیسه صفرای 52 بیمار تحت کله سیستکتومی لاپراسکوپی، به عنوان گروه مورد جمع آوری گردید؛ از این بین 24 مورد کله سیتیت حاد و 28 مورد کله سیستیت مزمن تشخیص داده شد. هر سه گروه از لحاض ترکیب سن و جنس قابل مقایسه می باشند. در این نمونه ها، حضور هلیکوباکتر پیلوری بوسیله پرایمر اختصاصی ژن hsp60 ، و پرایمر اختصاصی 16s rRNA برای DNA هلیکوباکتر هپاتیکوس، هلیکوباکتر بیلیس و هلیکو باکتر پولوروم بوسیله واکنش های زنجیره ای پلیمرازی مورد ارزیابی قرار گرفت. مایع صفرا در محیط کشت مایع وجامد R (توصیف شده توسط ریچارد و همکاران) کشت داده شد. سرم های خون برای بررسی کمی ایمونوگلوبولین G هلیکوباکتر پیلوری بوسیله تست الیزا مورد ارزیابی گرفت.

نتایج:

21 از 24 (87.5 ٪) بیماران مبتلا به بیماری های کوله سیستیت حاد و 25 از28 مورد (89.2 ٪) در بیماران مبتلا به بیماری های کوله سیستیت مزمن ، و 20 از 25 (80 ٪) نفر در گروه شاهد، نشان دهنده افزایش سطح ایمونوگلوبولین G خاص هلیکوباکتر پیلوری بوده اند.

به ترتیب DNA هلیکوباکتر پیلوری در 6 از 24 (25 ٪) مایع صفرا کوله سیستیت حاد و 2 از 28(7%) مایع صفرا کوله سیستیت و 1 از 24 (4.2 ٪) مخاط کیسه صفرا کوله سیستیت حاد و 1 از 28 (3.5٪) مخاط کیسه صفرا کوله سیستیت مزمن مزمن تشخیص داده شد. DNA هلیکوباکتر bilis در 1از 24(4.2%)مایع صفرا کوله سیستیت حاد، و 1 از 28 (3.5 ٪) مایع صفرا کوله سیستیت مزمن تشخیص داده شد. هیچ گونه هلیکوباکتر از کشت صفرا بدست نیامد. تمامی نمونه های استخراج شده DNA از لحاظ هلیکوباکتر هپاتیکوس و هلیکوباکتر پولوروم منفی می باشد. تمامی DNA های استخراج شده از مایع صفرای گروه کنترل از لحاظ هلیکوباکتر پیلوری، هلیکوباکتر هپاتیکوس، هلیکوباکتر بیلیس و هلیکوباکتر پولوروم منفی بوده اند. تمامی DNA استخراج شده از سنگ صفرا از لحاظ حضور ِDNA هلیکوباکتر منفی بوده ند.

نتیجه گیری:

نتایج این مطالعه نشان دهنده حضور DNA هلیکوباکتر پیلوری و هلیکوباکتر بیلیس در کیسه صفرا بیماران مبتلا به کله سیستیت حاد و مزمن بوده، و ارتباط احتمالی بین DNA هلیکوباکتر یافت شده با بیماری های صفراوی وجود دارد.

فصل اول: کلیات تحقیق

1-1-1- جنس هلیکوباکتر

جنس هلیکوباکتر جزء باکتری های گرم منفی با سرعت رشد بالا در بین میکروارگانیزم های گرم منفی است که توانایی مهاجرت مداوم در بین میزبانان متنوع در پستانداران را دارا می باشد و در برخی موارد ممکن است باعث بیماری سخت بالینی همچون سرطان شود، در این بین بیشترین مطالعه تا کنون بر روی هلیکوباکتر پیلوری[1] صورت گرفته است که عامل ایجاد زخم معده و سرطان معده در انسان می باشد[1]، اهمیت بالینی جنس هلیکوباکتر با توجه به در معرض آلودگی قرار داشتن بیش از نیمی از جمعیت بشری جهان در برابر گونه هلیکوباکتر پیلوری امروزه بسیار روشن بوده،امروزه این جنس به طور رسمی حداقل شامل32 نام گونه می باشد[2]، این جنس را تقریبا می توان به دو گروه هلیکوباکتر های معده ای و هلیکوباکترهای انتروهپاتیک[2] تقسیم کرد[3, 4]. برخی از گونه های هلیکوباکتر معده ای بیشتر از هر میکرو ارگانیسم شناخته شده دیگری دارای فعالیت قوی اوره آزی بوده و از آن برای زنده ماندن و مدیریت فشار وارد شده توسط اسید معده استفاده می کنند[1, 5, 6]. هلیکوباکتر های انتروهپاتیک به طور معمول در مخاط معده کلونیزه نمی شوند ،اما دارای ویژگی های مشابه فراساختاری و فیزیولوژی مشابه ی با گونه های معده ای می باشند، تا به امروز این عوامل باکتریایی در دستگاه گوارشی و کبد انسان ،پستانداران و پرندگان جدا و شناسایی شده اند[4, 7, 8]. در مجموع اطلاعات بدست آمده از مطالعات انجام شده در بیماری های صفراوی ، نشان می دهد که صفرا حاوی گونه هلیکوباکتر، ممکن است عفونت مزمن با دگرگونی بدخیم القاء کنند. این که آیا آنها واقعا در پیدایش بیماری صفراوی شرکت دارند نیاز به مطالعات بیشتر را می طلبد ، با این حال در برخی بررسی ها شواهدی مبنی بر حضور هر دو گروه هلیکوباکتر های معده ای و روده ای در صفرای بیماران صفراوی می باشد[9, 10].

هلیکوباکتر پیلوری، باکتری باسیل گرم منفی مارپیچی[3]، دارای فرم خمیده و میکروائروفیلیک بوده که به عنوان مهمترین پاتوژن معده انسان شناخته شده، وارن و مارشال[4] برای اولین بار این باکتری را در سال 1983 جداسازی و خالص سازی نمودند،[11]، دو فرم مرفولوژیک باسیل مارپیچی و کوکوئید[5] برای این باکتری شناخته شده است، فرم باسیل مارپیچی این باکتری، فرم فعال و قابل کلونیزاسیون این باکتری بوده، فرم کوکوئید در واقع فرم موجود اما غیر قابل کشت این باکتری بوده، و بیشتر به فرم در حال استراحت هلیکوباکتر پیلوری مشهور است[12, 13]، علی رغم اثبات حضور فرم کوکوئید هلیکو باکتر پیلوری، تلاش های بسیار برای کشت آن تا کنون نتیجه مطلوب نداشته است، از این رو این موضوع خود به تنهایی بسیار مورد بحث پژوهشگران بوده ، اعتقاد برخی محققان بر این استوار می باشد که فرم کوکوئید این باکتری فرم مرده بوده،[14, 15]؛ و در مقابل برخی از محققان دیگر اعتقاد داشته که این فرم از باکتری زنده بوده و در حال حاضر امکان کشت آن با تکنیک ها و روش های موجود وجود ندارد[13, 16, 17]. تغییر فرممورفولوژیکاز باسیل مارپیچی به کوکوئید را می توان بوسیله کشت مجدد در محیط کشت با شرایط غذایی ضعیف، کشت همراه با استرس همچون آنتی بیوتیک و اکسیژن، و یا استرس کاهش pH و یا افزایش دما مشاهده کرد[18] . فرم باسیل مارپیچی باکتری هلیکوباکتر پیلوری به نسبت فرم کوکوئید آن مقدار بسیار زیادی از پروتیین های مختلف را بیان می کند، که به عنوان مثال می توان به پروتیین های موثر در تکثیر سلولی و ساختمان سلولی، پروتیین های موثر در اتصال یا چسبنده ها[6] و پروتیین های موثر در کلونیزاسیون باکتری اشاره کرد، اما در فرم کوکوئید، بیان پروتیین ها به طور معنا داری کاهش پیدا کرده و بیشتر به حفاظت از فعالیت های متابولیک باکتری همچون تنفس سلولی، حفظ ساختار کلی سلول و سنتز DNA محدود میگردد[14, 19, 20]. بنابراین به طور گسترده این اعتقاد وجود داشته که فرم کوکوئید این باکتری نقش به سزایی در انتقال و گسترش عفونت با هلیکو باکتر پیلوری یا پاسخ های متفاوت و ناکارامد سلول در برابر عفونت با این باکتری بوده[16, 21-23] و از آن سو نقش عمده فرم باسیل مارپیچی این باکتری در بیماری زایی و بیان عوامل حدت[7] می باشد .

Chunhong Shao و همکارانش برای اولین بار پاسخ هلیکوباکتر پیلوری را به شرایط اسیدی متفاوت مایع صفرای انسان را بررسی نمودند، توانایی تحمل این شرایط برای کلونیزاسیون این باکتری در دستگاه گوارش انسان بسیار با اهمیت است؛ نتایج حاصل از این تحقیق نشان دهنده مسیر های پیچیده پیام دهی برای تحمل این شرایط بوده، نتایج این تحقیق نشان دهنده تغییر در بیان و فرم برخی از پروتیین ها از قبیل چاپرون ها، پروتیین های موثر در جابجایی آهن، آنزیم های موثر در چرخه تولید انرژی، متابولیسم و پروتیین های فلاژلا بوده است.[24]

2-1-1- عوامل حدت هلیکوباکتر پیلوری

اوره آز خودش به تنهایی کموتاکسی فاگوسیت ها را باعث می شود و سلول های ایمنی را فعال می کند و محصولات سیتوتوکسین را افزایش می دهد. اتصال هلیكوباكتر پیلوری به اپتیلیوم معده و ترشح اینترلوكینها یك مرحله مهم در القاء التهاب فعال لایه مخاطی می باشد كه می تواند به تولید زخم منجر شود. سیتوتوكسین واكوئله كنندهA[1] (vac A) به کلنیزه شدن هلیکوباکتر پیلوری در مخاط كمك می كند كه به نظر می رسد نتیجه آن تعدیل سیستم ایمنی میزبان باشد [25]. پلی مرفیسمهای موجود در ژن سایتوكاینها ی میزبان نیز ممكن است كه عامل مهمی در مقدار سایتوكاینها ی تولیدی و در نتیجه تفاوت در الگو و شدت پاسخهای التهابی باشند[26].براساس تنوع ژنتیكی ممكن است كه این پلی مرفیسمها از یك نا حیه جغرافیایی به ناحیه دیگر متفاوت باشند كه می تواند احتمال حضور ژنوتیپهای خاص در جمعیت های مناطق خاص جغرافیایی كه آنها را نسبت به عفونت با سوش هلیكوباكترپیلوری دارای ژن vacA مستعد می سازد را توضیح دهد. در میان عوامل بیماریزای هلیکو باکتر پیلوری،عامل اتصال به سلول های پوششی برای شروع پاسخ التهاب ضروری است.[27, 28] برخی از سویه های هلیکوباکتر پیلوری ،دارای یک ناحیه پاتوژنیسیته 40k bp به نام جزیره بیماریزایی[2] cag هستند که حاوی 31 ژن بوده و تولید و تجمع سیستم ترشحی تیپ IV را هدایت می کند.در مدل های حیوانی سویه هایی که جزیره پاتوژنیسیتی cag را دارند، از سویه های فاقد این جزیره بیماریزا تر می باشند.[29] برخی بررسی ها نشان داده است که سویه های دارای ژن cagA از قدرت بیماریزایی بیشتری برخوردار می باشند[30] ، سویه های cagA مثبت باعث القای سیتوتوکسیتی بیشتری نسبت به سویه های فاقد این ژن می باشند[31] ، سویه های cagA مثبت می توانند باعث تولید IL-8[3] شوند[32] ،همچنین پروتیین CagA یک مولکول ایمونولوژیک می باشد که به عنوان یکی از کاندید های ساخت واکسن علیه باکتری هلیکوباکتر پیلوری مطرح است[33] ، همچنین پروتیین CagA پس از ورود به سلول میزبان باعث تغیرات ساختار اکتین و اختلال در سیکل سلولی ،القای بیان انکوژن های c-fos و c-jun و در نهایت آسیب سلولی می شود و خطر ایجاد سرطان را افزایش می دهد[34]. یكی از مهمترین ملكولهای چسبان در هلیكوباكتر پیلوری پروتئین است كه توسط ژن babA2 کد می شود و Blood group bindin antigen نام دارد، تحقیقات متعددی نشان داده است که این مولکول چسبان، عامل اتصال هلیکوباکتر پیلوری به آنتی ژنهای گروه خونی لوئیس b می باشد.این آنتی ژن های فوکوزیله شده روی سطح سلول های پوششی معده قرار دارند، پروتیین Bab A یکی از پروتیین های غشا خارجی هلیکوباکتر پیلوری است، توانائی اتصال این پروتئین به آنتی ژنهای گروه خونی لوئیس b استقرار باكتری را در معده تسهیل ، و ممكن است مستقیمًا در بیماریزائی نقش داشته باشد[35, 36] ؛ پروتیین Bab A 75 کیلو دالتون وزن دارد،دو آلل ژن bab A شناسایی شده اند که عبارتند از: bab A1 و bab A2 ، از این بین تنها آلل bab A2 فعال بوده و پروتیین Bab A را رمز دهی می نماید. [37] طبق تحقیقات صورت گرفته، مشخص شده است كه بین وجود این ژن و بعضی بیماریهای دستگاه گوارش از جمله زخم اثنی عشر ارتباط وجود دارد. [38-41]

1-6-2-1 مراحل آپوپتوز ………………………………………………………………..19

1-6-2-2 مسیر های آپوپتوز………………………………………………………..21

1-6-2-3- عناصر کلیدی مسیرهای آپوپتوز…………………………………21

1-6-2-4- روش های بررسی آپوپتوز …………………………………………..23

1-6-2-4-1- بررسی تغییرات غشاء پلاسمایی در مرگ سول ……………………23

1-6-2-4-1-1- تعیین فسفاتیدیل سرین سطح بیرونی غشاء سلول………………24

1-6-2-4-2- بررسی سیتوتوکسیسیتی …………………………………………24

1-6-2-4-3- بررسی تغییرات مورفولوژی ………………………………………..25

1-6-2-4-3-1- استفاده از میکروسکوپ الکترونی………………………………25

1-6-2-4-3-2- استفاده از میکروسکوپ نوری وفلورسانس……………………25

1-7- منشاء آسیب DNA اسپرم………………………………………………..26

1-7-1- بسته بندی غیرطبیعی كروماتین…………………………………..27

1-8- ساختار کروماتین اسپرم و تأثیر آن بر ناباروری ………………………..28

1-8-1- بررسی ساختار کروماتین اسپرم………………………………………28

1-9- نقش آپوپتوز در آسیب DNA اسپرم…………………………………..29

1-10- استرس اكسیداتیو به واسطه ROS……………………………………..

1-11- تاثیر عوامل محیطی برسلامت DNA و میزان موفقیت روشهای کمک باروری……..31

1-11-1- مصرف سیگار…………………………………………………………….31

1-11-2- مواجهات شغلی…………………………………………………………..32

1-11-3- داروهای شیمی درمانی و رادیوتراپی……………………………….33

1-11-4- سن……………………………………………………………………..33

1-12- تكنیك­های بررسی ساختار كروماتین……………………………………….33

1-12-1- روش­های تعیین آسیب DNA اسپرم انسان………………………….34

1-12-1-1- تست TUNEL…………………………………………………………..

1-12-1-2- روش DBD-FISH………………………………………………………….

1-12-1-3- روش Comet………………………………………………………

1-12-1-4- رنگ­آمیزی CMA3………………………………………………………..

1-12-1-5- تكنیك SCSA…………………………………………………………..

1-12-1-6- تست SCD……………………………………………………………….

1-12-1-7- رنگ­آمیزی آكریدین اورانژ…………………………………………….39

1-12-1-8- رنگ­­آمیزی تولوئیدین بلو…………………………………………….39

1-13- روش مهاجرت اسپرم…………………………………………………………39

1-14- روش سانتریفیوژ شیب غلظت…………………………………………..40

فصل دوم- مواد و روش ها…………………………………………………………41

2-1- مواد و وسایل مورد نیاز……………………………………………………….42

2-1-1- وسایل مورد نیاز………………………………………………………….42

2-1-2- مواد مورد نیاز…………………………………………………………..42

2-2- ساخت محلول های مورد نیاز…………………………………………….45

2-2-1- ساخت محلول Ham’s F10……………………………………………….

2-2-2- محلول های لازم برای تست پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)………….46

2-2-3- ساخت محلول تانل…………………………………………………………46

2-2-4- ساخت محلول (PBS)…………………………………………………….46

2-2-5- ساخت رنگ ائوزین-نیگروزین………………………………………………….47

2-2-6- ساخت رنگ رایت………………………………………………………………..47

2-3- روشها…………………………………………………………………………….48

2-3-1- روش جمع آوری اسپرم……………………………………………. 48

2-3-2- آنالیز مایع انزالی…………………………………………………………….. 48

2-3-2-1- آزمایشات ماکروسکوپی……………………………………………….48

2-3-2-1-1- ظاهر……………………………………………………………………….48

2-3-2-1-2- آبکی کردن………………………………………………………………..48

2-3-2-1-3- حجم…………………………………………………………………..48

2-3-2-1-4- چسبندگی………………………………………………………….48

2-3-2-2- آزمایشات میکروسکوپی……………………………………………………49

2-3-2-2-1- آگلوتیناسیون………………………………………………………….50

2-3-2-2-2- بررسی تعداد اسپرم………………………………………………………50

2-3-2-2-2-1- روش استفاده از MAKLER CHAMBER برای شمارش …………50

2-3-2-2-3- ارزیابی تحرک……………………………………………………….51

2-3-2-2-3-1- روش کار……………………………………………………………52

2-3-2-2-4- ارزیابی قابلیت حیات………………………………………………….53

2-3-2-2-4-1- روش کار رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین………………………….53

2-3-2-2-5- ارزیابی مورفولوژی…………………………………………………54

2-3-2-2-5-1- رنگ آمیزی پاپانیکولا………………………………………….54

2-3-2-2-5-2- روش فیکس کردن………………………………………………54

2-3-2-2-5-3-روش رنگ آمیزی پاپانیکولا…………………………………….55

2-3-3- Direct swim-up……………………………………………………….

2-3-3-1- روش کار………………………………………………………………….57

2-3-4- تست بررسی میزان پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)…………….58

2-3-4-1- روش کار………………………………………………………………..58

2-3-5- روش رنگ آمیزی تانل……………………………………………………60

2-3-6- آنالیز آماری……………………………………………………………….62

فصل سوم- نتایج……………………………………………………………….63

3-1 نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی تحرک اسپرم…………..64

3-2- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قابلیت حیات اسپرم….67

3-3- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی مورفولوژی اسپرم..68

3-4- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم…70

3-5- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم………..72

3-6- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی آپوپتوز اسپرم….75

3-7- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم………..78

3-8- رابطه میزان آپوپتوز اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم………………………..79

3-9- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با میزان آپوپتوز اسپرم……………80

3-10- نتایج کلی……………………………………………………………………………80

فصل چهارم- بحث………………………………………………………………………….81

4-1- تا ثیر روش آماده سازی Dricct Swim up بر روی پارامترهای اسپرم……………83

4-2- تاثیر زمان های مختلف انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد بر روی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم……84

4-3- پیشنهادات…………………………………………………………………………..90

فصل اول: مقدمه

1-1- روش های کمک باروری

امروزه استفاده از روش های كمك باروری ([1]ART) بهترین گزینه برای رفع مشكلات زوج های نابارور است. میزان موفقیت این روش ها به عوامل متعددی از جمله سلامت كامل تخمك و اسپرم بستگی دارد. در این میان سلامت ژنوم پدری اهمیت زیادی در میزان پتانسیل باروری زوج ها دارد. بنابراین آسیب DNA اسپرم یك اختلال ژنومی است كه به میزان متفاوت در مردان نابارور وجود دارد. از زمانی كه اولین گزارش در مورد آسیب DNA اسپرم منتشر شد مطالعات وسیعی در این زمینه انجام گرفته و مشخص شده كه در افراد دارای میزان بالای آسیب DNA، پارامترهای اسپرمی پایین می آید و قدرت باروری نیزكاهش می یابد.

از سالها پیش، استفاده از جراحی برای رفع نقایص ساختمان دستگاه تولید مثل، استفاده از داروهای باروری برای تحریك تخمك­گذاری و روش IUI[2] (انتقال اسپرم متحرك و شسته شده به رحم) از جمله روش­های رایج درمانی بوده و هستند. لیكن این اقدامات تنها برای گروهی از زوج­های نابارور مؤثر است. این در حالی است كه روش­های جدیدی از جمله IVF [3] و ICSI [4] امروزه به عنوان گزینه­هایی مناسب در درمان سایر زوجین نابارور مطرح است.

میزان موفقیتART به سلامت و بلوغ گامت های زوجین وابسته است . طی لقاح طبیعی و روش لقاح آزمایشگاهیIVF احتمال نفوذ اسپرماتوزوای غیربالغ و ناسالم به داخل تخمك توسط سد زوناپلوسیدا به حداقل می رسد در صورتی كه در روش میكرواینجكشن یا تزریق مستقیم اسپرم به داخل سیتوپلاسم تخمك ICSI این سد وجود نداشته و ایمن بودن روش ICSI همیشه مورد نگرانی بوده است . در ضمن تحقیقات نشان داده است كه انتخاب اسپرم با پارامترهای معمولی (غلظت، مورفولوژی، تحرك ) نمی تواند گویای سلامت DNA اسپرم باشد(EI, MI, López-Fernández, Fernández, & Gosálvez, 2007). به تازگی لوئیس و سیمون (2010) اظهار داشتند که هیچ همبستگی بین پارامتر های معمولی اسپرم و آسیب DNA وجود ندارد(S. E. M. Lewis & Simon, 2010).

یکی از روش های کمک باروری روش تلقیح داخل رحمی (IUI) می باشد. که در این روش مایع انزالی از شوهر گرفته می شود و پس از عمل شستشو و جداسازی ، اسپرم های مرده و بدون تحرک از اسپرم های زنده و دارای تحرک جدا می شوند، سپس اسپرم های زنده و متحرک به وسیله کاتتر توسط متخصص، وارد حفره رحم می گردد.

در آزمایشگاه های ART، بعد از عمل شستشو و جداسازی معمولاَ به بررسی پارامترهای اسپرم که شامل تعداد، میزان تحرک و وضیعت مورفولوژیکی اسپرم و درصد زنده بودن می باشد، می پردازند اما به بررسی پارامترهای درون سلولی که شامل آپوپتوز و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم است پرداخته نمی شود. همچنین در آزمایشگاه های ART معمولاَ انجام روش IUI از 5/0 تا حداکثر 3 ساعت بعد از عمل جداسازی و شستشو اسپرم انجام می دهند و در بعضی از مراکز درمان ناباروری بدون توجه به زمان، عمل تلقیح را انجام می دهند. با توجه به نقش اسپرم در پروسه لقاح در روش IUI، لازم است که علاوه بر توجه به ساختار سلولی اسپرم به بهترین زمان ممکن جهت انجام تزریق اسپرم آماده شده به داخل حفره رحمی توجه شود. لذا با مطالعه ساختار سلولی اسپرم و نیز تعیین زمان دقیق عمل تزریق اسپرم به داخل حفره رحمی می توان میزان لقاح و در نتیجه میزان حاملگی را افزایش داد.

یکی از عواملی که می تواند بر میزان موفقیت درمان زوج های نابارور و همچنین کیفیت گامت ها مهم باشد، کیفیت اسپرم است. در روش IUI بعد از جداسازی اسپرم از مایع منی و آماده سازی اسپرم برای انتقال، می تواند به خاطر انکوباسیون طولانی مدت، قطعه قطعه شدن DNA اسپرم افزایش پیدا کند(Muratori, et al., 2003).

مطالعات بیانگر این مطلب است كه در تخمك های لقاح یافته با اسپرم های دارای آسیب بالای DNA، میزان لانه گزینی و بارداری به طور معنی داری كاهش می یابد . اگرچه ژنوم آسیب دیده پدری، طی رشد جنینی می تواند دستخوش پردازش قرار گیرد، ولی در صورت وجود آسیب های زیاد، احتمال كاهش رشد جنین وجود داشته و اگر میزان نقص ها كمتر باشد، می تواند نقایص بعد از تولد را به همراه داشته باشد. به همین دلیل، در دسته ای از بیماران، نوزادان متولد شده توسط روش ICSI دارای نقص ژنتیكی بیشتری نسبت به نوزادان طبیعی هستند .لازم به ذكر است كه تحقیقات متعدد در این زمینه، نتایج ضد و نقیصی را گزارش كرده اند(Morris, Ilott, Dixon, & Brison, 2002).

تجربیات به دست آمده از روش های كمك باروری نشان می دهد، چنانچه اسپرم با میزان بالایی از آسیب DNA، در روند IVF و ICSI وارد تخمك شود سیستم ترمیمی تخمك ممكن است توانایی ترمیم این آسیب ها را نداشته و در بسیاری از موارد با وجود موفقیت در لقاح، سلول های جنسی توانایی تشكیل جنین یا ادامه تكامل را تا مرحله بعد از 4 تا 8 سلولی كه مصادف با فعال شدن ژنوم است، ندارند . براساس تحقیقات مشخص شده كه توانایی ترمیم تخمك وابسته به سن مادر بوده و تخمك های افراد جوان، از قدرت ترمیم DNA بالایی برخوردارند . به علاوه تحقیقات متعدد در زمینه آسیب DNA بیانگر این هستند كه ارتباط معنی داری بین آسیب DNA و میزان لقاح وجود ندارد ولی بین آسیب DNA اسپرم و تشكیل جنین، بلاستوسیت، رشد جنین و بارداری ارتباط معكوس و معنی داری وجود دارد(Morris, et al., 2002).

پس از آماده سازی اسپرم به طور معمول در 37 درجه سانتی گراد انکوبه می شود تا در ART از آن استفاده شود (Van der Westerlaken, Naaktgeboren, Verburg, Dieben, & Helmerhorst, 2006) ، ولی هنوز زمان بهینه برای انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد قبل از استفاده در ART وجود ندارد. بعضی از محققین سعی برای پیدا کردن اثر گذشت زمان بر پارامترهای اسپرم بعد از انکوبه کردن در دمای 37 درجه سانتی گراد را دارند. اثر انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد نشان داد که بعد از گذشت 24 ساعت می تواند بر روی تحرک و قابلیت حیات اسپرم تاثیر گذار باشد(Calamera, Fernandez, Buffone, Acosta, & Doncel, 2001).

بعد از آماده سازی اسپرم برای استفاده در تکنیک های ART انکوباسیون کوتاه مدت در دمای 37 درجه سانتی گراد می تواند باعث ظرفیت یابی اسپرم شود اما انکوباسیون طولانی مدت می تواند بر روی DNA اسپرم تاثیر داشته باشد(Marı́n-Briggiler, Tezón, Miranda, & Vazquez-Levin, 2002).

مساحت آن­ها شاهد انقراض گونه­های گیاهی و جانوری و در نتیجه کاهش تنوع زیستی در دنیا هستیم. هریک از گونه­ها آن­چنان در اکوسیستم­های جنگلی نقش حیاتی و اساسی را در زنجیره­های غذایی بازی می­کنند که نابودی یک گونه، تعادل حیات را در طبیعت برهم می­زند. برنامه­های زیست محیطی برای هر منطقه بدون شناخت وضعیت پوشش گیاهی آن منطقه و تنوع گونه­ای آن ممکن نیست [3].

شناسایی پوشش گیاهی و بررسی فرم زیستی و جغرافیای گیاهی منطقه، ضمن اینکه اساس بررسی­ها و تحقیقات بوم­شناختی در منطقه بوده و راهکاری مناسب برای تعیین ظرفیت بوم­شناختی منطقه از جنبه­های مختلف است، در عین حال، عامل مؤثری در سنجش و ارزیابی وضعیت کنونی و پیش­بینی وضعیت آینده­ی منطقه به شمار می­رود که برای اعمال مدیریت صحیح، نقش بسزایی دارد [13].

تنوع زیستی جنگل منبع بسیار مهم و با ارزشی است، زیرا گونه­های موجود در جنگل و ذخایر ژنتیکی تشکیل­دهنده­ی آن برای سلامتی و تأمین نیازهای بشر و سایر موجودات، حائز اهمیت بوده و قطعاً فقدان تنوع زیستی تهدید خطرناکی برای بقای انسان و سایر موجودات محسوب می­شود [14].

تنوع زیستی در جنگل­های شمال ایران بالا است. در بین کشورهای هم­عرض ایران، جنگل­های شمال ایران و شمال ترکیه که از عصر یخبندان به سلامت گذشته­اند، دارای بهترین تنوع می­باشند. پس از پایان عصر یخبندان، پیشروی جنگل به سمت اروپا از جنگل­های شمال ایران و ترکیه آغاز شد و همین قدمت بیشتر سبب شده است که تنوع ژنتیکی گونه ­های چوبی شمال ایران بیشتر از اروپا باشد [15].

فصل اول: مروری بر منابع علمی

1-1- تعریف جامعه­ شناسی گیاهی و مروری بر تحقیقات جامعه­ شناسی در جهان

جامعه­شناسی گیاهی معروف به فیتوسوسیولوژی[1] شاخه­ای از علم اکولوژی است که اجتماعات گیاهی را از نظر ترکیب گونه­ای[2]، اکولوژی، پراکنش جغرافیایی[3] و دینامیک مورد مطالعه قرار می­دهد [16]. جامعه­ی گیاهی[4] که برای اولین بار در ابتدای قرن نوزدهم توسط همبولت[5] تشریح شد [17]، اشاره به گونه­های معینی می­نماید که باهم در محل­های معین رشد کرده و وقوع آنها باهم چیزی بیش از شانس و تصادف است [18]. کلمنتز[6] در سال 1916 با توسعه­ی نظریه­ی ارگانیسمی[7]، هر جامعه­ی گیاهی را به مثابه یک واحد زیستی (موجود زنده) معرفی کرده است که هر قسمتی از آن عضو یک پیکر بوده و با سایر قسمت­ها در ارتباط می­باشد. هر جامعه­ی گیاهی به عنوان واحدی منسجم با سیمای ظاهری[8] یکنواخت و ترکیب گونه­ای نسبتاً ثابت هر رویشگاه بوده [19]، مطالعه­ی آن می­تواند مبنای مناسبی برای مدیریت، احیاء[9] و توسعه­ی آن رویشگاه باشد. به دلیل تغییرات شدید در نوع پوشش­گیاهی، شرایط اقلیمی و چگونگی تأثیر انسان در پوشش گیاهی مناطق مختلف، مکاتب و روش­های مختلفی در دانش جامعه­شناسی گیاهی مرسوم گردید [20]. از میان مکاتب موجود، مکتب زوریخ-مونپلیه که توسط براون-بلانکه در سال 1928 پیشنهاد شده است [21]، از اهمیت خاصی برخوردار می­باشد [17]. ویژگی بارز این مکتب، انعطاف کافی آن جهت بررسی پوشش گیاهی از دیدگاه­های مختلف بوده و علاوه بر این با قرار دادن جامعه[10] به­عنوان واحد پایه، یک سلسله­ی رده­بندی را ارائه می­کند که دیگر واحدهای آن، اتحادیه[11]، رده[12] و طبقه[13] می­باشد [22].

مطالعه­ی فیتوسوسیولوژی به روش براون-بلانکه توسط محققینی چون پور[14] [23]، پاولوسکی[15] [24]، بکینگ[16] [25]، شیمول[17] [26]، مولر-دومبویس[18] و النبرگ[19] [27]، واندرمارل[20] [28] تشریح شده و روش­های اجرایی آن مورد بررسی قرار گرفت [17].

2-1- مروری بر بررسی­های فلوریستیکی و جامعه­ شناسی پوشش ­گیاهی در جنگل­های هیرکانی

بررسی­های جامعه شناسی گیاهی در ایران به صورت كلی با مطالعات زوهری [29] آغاز شده است. جزیره ای [30] عناصر فیتوژئوگرافیكی جنگل­های خزری را تشریح نموده است. تره گوبو [31]، مصدق [32] و درستكار [33] جامعه های گیاهی جنگل­های شمال ایران را بررسی نموده اند. ثابتی [34]، جامعه های گیاهی متعددی برای مناطق مختلف ایران ذكر كرده است. راستین [35] جامعه های جنگلی پست حوزه­ی هیركانی و اسداللهی [36] جامعه های گیاهی راشستان­های اسالم را مورد مطالعه قرار داده اند و البرز مركزی توسط کلن [37] مطالعه شده است.

حجازی و ثابتی[1] در سال 1961 چندین جامعه­ی جنگلی از شمال ایران معرفی نمودند [38]. جزیره­ای[2] در سال­های 1964 و 1965 عناصر فیتوژئوگرافی جنگل­های هیرکانی را تشریح و جوامعی از این جنگل­ها را مورد مطالعه قرار داد [30، 39]. ثابتی در سال 1344 جوامع مختلف گیاهی جنگل­های شمال ایران را مطالعه کرده ­است[40]. خاوری­نژاد در سال 1345 در پایان­نامه­ی کارشناسی­ارشد خود جوامع­گیاهی جنگل­های جنوب شرق چالوس را مورد مطالعه قرار داد[41]. ترگوبو[3] در سال 1967 جوامع گیاهی منطقه­ی هیرکانی را معرفی کرد [31]. ترگوبو و مبین[4] در سال 1970 نقشه­ی پوشش گیاهی ایران را با مقیاس 1:2500000 تهیه کردند [42]. زوهری[5] در سال­های 1963 و 1973 پوشش گیاهی ایران، به ویژه جنگل­های هیرکانی را از جنبه­های جغرافیایی و جامعه­شناسی گیاهی بررسی کرده است [6، 29]. درستکار[6] در سال 1974 در تز دکترای خود [43] و درستکار و نویرفالیس[7] در سال 1976 [33] جنگل­های شرق دریای خزر را مورد مطالعه قرار داده­اند. ثابتی در سال 1355 درختان و درختچه­های ایران را بررسی کرده است [34]. اسداللهی[8] در سال 1980 در رساله­ی دکترای خود، جوامع­گیاهی راشستان­های حوزه­ی اسالم [44] و در سال 1366 جغرافیای گیاهی و جوامع­گیاهی جنگل­های شمال غربی هیرکانی را در سمینار جنگل و جنگل­داری گرگان ارائه نموده است [36]. در سال 1982 اسداللهی و همکاران، اکوسیستم­های جنگلی ایران را از دیدگاه جامعه­شناسی مورد مطالعه قرار داده­اند [45]. مصدق[9] در سال 1981 جوامع­گیاهی جنگل­های شمال ایران را بررسی کرده است [46]. راستین[10] در سال­های 1980 و 1983 جوامع جنگلی پست منطقه­ی هیرکانی را مورد مطالعه قرار داده است [35، 47]. فرای[11] و همکاران در سال 1985 نقشه­ی پوشش گیاهی بخش مرکزی کوه­های البرز را با مقیاس 1:500000 تهیه کردند [48]. فرای و پرابست[12] در سال 1986 طرح طبقه­بندی پوشش گیاهی ایران بر اساس معیارهای فیزیونومی-اکولوژی را ارائه کردند [4]. اسدی در سال 1364 در پایان­نامه­ی کارشناسی­ارشد خود، جوامع گیاهی سری پاتم خیرود­کنار را بررسی نموده است [49]. طبری در سال 1371 در پایان­نامه­ی کارشناسی­ارشد خود، شرایط زیست و مختصات جنگل­شناسی و جوامع­گیاهی درخت زبان­گنجشک را در جنگل­های شمال تشریح نموده است [50]. حمزۀ در سال 1373، جوامع گیاهی و عناصر تشکیل­دهنده­ی جنگل­های لساکوتی در جنوب شرقی تنکابن را مورد بررسی قرار داده است [51]. سعیدی­مهرورز در سال 1373 در پایان­نامه­ی کارشناسی­ارشد خود، فلور و پوشش­گیاهی مناطق ایسپیلی-دیلمان و نواحی اطراف آن را بررسی نموده است [52]. یزدیان در سال 1374 در پایان­نامه­ی کارشناسی­ارشد خود، مهم­ترین شرایط اکولوژیکی و تیپ­های رویشی درخت آزاد را در جنگل­های شمال بررسی کرده است [53]. حسینی در سال 1375 در پایان­نامه­ی کارشناسی­ارشد خود، با عنوان تهیه­ی نقشه­ی فیزیونومیك – فلورستیك پوشش­گیاهی بخش نم خانه­ی جنگل خیرودكنار، جوامع جنگلی این بخش را با معرفی گونه­های معرف هر جامعه، مشخص نموده است [54]. آخانی[13] در سال 1998، تنوع زیستی پارک ملی گلستان [55] و آخانی و زیگلر[14] در سال 2002 پوشش گیاهی صخره­ای و جوامع علفی پارک ملی گلستان را بررسی کردند [56]. کلن[15] در سال 1982 [57] و 1984 [58] و در سال 1991 [37] در تز دکترای خود جوامع گیاهی البرز مرکزی را مورد مطالعه قرار داده است. نظریان[16] و همکاران در سال 2004 به معرفی جوامع جنگلی بخشی از شمال ایران پرداختند [59]. قهرمان[17] و همکاران در سال 2006 به بررسی فلوریستیک جنگل­های توسکای قشلاقی در مناطق پست خزری پرداخته­اند[60]. دانشور[18] و همکاران در سال 2007 تنوع ساختاری در راشستان آمیخته (مطالعه موردی جنگل شصت­کلاته، گرگان) را مورد بررسی قرار دادند [61]. حمزۀ[19] و همکاران در سال 2008 به بررسی جوامع توسکای قشلاقی در شمال ایران پرداخته­اند [8]. جعفری و آخانی[20] در سال 2008 گیاهان منطقه حفاظت شده جهان­نما در استان گلستان را مورد مطالعه قرار دادند [62]. نقی­نژاد[21] و همکاران در سال 2008 ارتباط محیط و پوشش­گیاهی را در اجتماعات توسکای قشلاقی مناطق پست جنگل­های شمال بررسی نمودند [7]. رمضانی[22] و همکاران در سال 2008، تاریخچه­ی پوشش گیاهی جنگل­های هیرکانی مرکزی را مورد بررسی قرار داده­اند [63]. سیادتی و مرادی در سال 1389 [64، 3] در پایان­نامه­ی کارشناسی ارشد خود و همچنین سیادتی[23] و همکاران در سال 2010 [9]، تغییرات فلوریستیکی را در طول شیب ارتفاعی در منطقه جنگلی خیرود بررسی کردند.

[1] Sabeti & Hejazi

[2] Djazirei

[3] Tregubov

[4] Tregubov & Mobayen

[5] Zohary

[6] Dorostkar

[7] Dorostkar & Noirfalise

[8] Assadollahi

[9] Mossadegh

[10] Rastin

[11] Frey

[12] Frey & Probst

[13] Akhani

[14] Akhani & Ziegler

[15] Klein

[16] Nazarian

[17] Ghahreman

[18] Daneshvar

[19] Hamzehꞌee

[20] Jafari & Akhani

[21] Naqinezhad

[22] Ramezani

[23] Siadati

Phytosociology

Floristic

Chorology

Plant association

Homboldt

Clements

Organismic Concept

………………………………………………….. 11

1-14 اندامگان بی هوازی ……………………………………………………………………………………… 11

1-15 متابولیسم بی هوازی …………………………………………………………………………………….. 12

1-16 بیوسورفکتانت …………………………………………………………………………………………….. 13

1-17 تعریف بیوسورفکتانت ها …………………………………………………………………………….. 13

1-18 بیوسورفکتانت ها از نظر وزن مولکولی …………………………………………………………. 13

1-18-1 بیوسورفکتانت های با وزن مولکولی پایین …………………………………………………. 13

1-18-2 بیوسورفکتانت های با وزن مولکولی بالا ……………………………………………………. 14

1-19 تولید بیوسورفکتانت ها ………………………………………………………………………………… 14

1-20 اثر فاکتورهای مختلف بر تولید بیوسورفکتانت ………………………………………………..14

1-20-1 اثر منبع کربن بر تولید بیوسورفکتانت …………………………………………………………15

1-20-2 اثر منبع نیتروژن بر تولید بیوسورفکتانت …………………………………………………….. 15

1-20-3 اثر فاکتورهای محیطی بر تولید بیوسورفکتانت ……………………………………………. 15

1-21 تقسیم بندی بیوسورفکتانت ها ……………………………………………………………………… 16

1-22 انواع بیوسورفکتانت ……………………………………………………………………………………… 16

1-23 مزیت های استفاده از بیوسورفکتانت ………………………………………………………………. 17

1-24 مزیت بیوسورفکتانت ها به سورفکتانت های شیمیایی ………………………………………. 18

1-25 کاربردهای بیوسورفکتانت ها …………………………………………………………………………. 19

1-25-1 کاربردهای بیوسورفکتانت ها در صنعت نفت ………………………………………………. 19

1-25-2 کاربردهای بیوسورفکتانت ها در صنایع غذایی ……………………………………………. 20

1-26 نقش های طبیعی و فیزیولوژیکی بیوسورفکتانت ها ………………………………………….. 20

1-27 افزایش سطح تماس ناحیه هیدروفوبی سوبستراها …………………………………………….. 20

1-28 هالوفیل ها …………………………………………………………………………………………………….. 20

1-29 اهداف تحقیق ………………………………………………………………………………………………. 21

1-30 سوالات تحقیق …………………………………………………………………………………………….. 22

1-31 فرضیه های تحقیق ………………………………………………………………………………………… 22

فصل دوم: پیشینه پژوهش

2-1 بیوتکنولوژی و اهمیت بیوتکنولوژی نفت ………………………………………………………… 24

2-2 بیوتکنولوژی در خدمت صنعت و نفت …………………………………………………………….. 24

2-3 استخراج نفت ………………………………………………………………………………………………… 26

2-4 حفر چاه ………………………………………………………………………………………………………… 27

2-5 روش های استخراج نفت ……………………………………………………………………………….. 27

2-6 مزایای بیوسورفکتانت ها در استخراج نفت ثالثیه ……………………………………………… 31

2-7 پیشینه تحقیق …………………………………………………………………………………………………. 32

فصل سوم

روش کار

3-1 دستگاههای مورد استفاده ……………………………………………………………………………….. 39

3-2 وسایل مورد نیاز …………………………………………………………………………………………….. 39

3-3 مواد مورد استفاده ………………………………………………………………………………………….. 40

3-4 مراحل انجام آزمایش …………………………………………………………………………………….. 40

3-4-1 نمونه برداری …………………………………………………………………………………………….. 41

3-4-2 غربالگری و غنی سازی بی هوازی باکتری های نفتی …………………………………… 41

3-4-3روش تهیه لام …………………………………………………………………………………………….. 43

3-4-4 رنگ آمیزی گرم ………………………………………………………………………………………. 43

3-4-5 رنگ آمیزی منفی ……………………………………………………………………………………… 44

3-4-6 شناسایی و تخلیص ……………………………………………………………………………………. 44

3-4-7 تست احیای نیترات ………………………………………………………………………………….. 46

3-4-8 تست CHNS……………………………………………………………………………………………

3-4-9 آزمایش های وجود بیوسورفکتانت در نمونه های آزمایش شده ……………………. 48

فصل چهارم: نتایج

4-1 مشاهده میکروسکوپی ………………………………………………………………………………………. 54

4-2 نتایج مرحله شناسایی و تخلیص ……………………………………………………………………….. 54

4-3 نتایج تست احیای نیترات …………………………………………………………………………………. 54

4-4 نتایج تست CHNS ……………………………………………………………………………………….. 55

4-5 نتایج آزمایش های وجود بیوسورفکتانت در نمونه های آزمایش شده …………………….57

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1 مقدمه ……………………………………………………………………………………………………………. 59

5-2 بحث ……………………………………………………………………………………………………………. 61

5-3 نتیجه گیری …………………………………………………………………………………………………… 63

5-4 پیشنهادات ……………………………………………………………………………………………………… 64

پیوست الف ………………………………………………………………………………………………………….. 65

منابع فارسی …………………………………………………………………………………………………………… 66

منابع لاتین …………………………………………………………………………………………………………….. 66

چکیده:

 

مبحث حضور باكتریها در اعماق زمین در اوایل قرن 21 مطرح شد. یكی از اولین تحقیقاتی كه در مورد میكروبیولوژی اعماق زمین انجام شد منتج به جداسازی باكتریهای احیا كنندة سولفات از چاه نفت شد. باکتری های احیا کننده سولفات، اصلی ترین باکتریهایی هستند که باعث ترش و اسیدی شدن نفت شده و در نتیجه افت کیفیت نفت خام را به بار خواهند آورد. رقابت بین SRB ها و باکتریهای بیهوازی احیا کننده نیترات برای کسب سوبسترای هیدروکربنی امروزه به عنوان یکی از راه­حلهای بالقوه بیوتکنولوژیک در جهت ارتقا کیفیت API نفت خام مطرح می­شود. لذا تحقیق در مورد یافتن NRBهای بومی نفت خام هر منطقه جغرافیایی تبدیل به یکی از موضوعات مورد توجه دانشمندان صنعت نفت در دهه اخیر شده است. از مهمترین ویژگیهای یک باکتری مفید در بیوتکنولوژی نفت توانایی تحمل شرایط فیزیکو شیمیایی دشوار مخزنی و تولید بیو سورفکتانت جهت افزایش دسترسی میکروبی می­باشد. لذا در این تحقیق باکتریهای بی­هوازی هالوفیل، احیاکننده نیترات و مولد بیوسورفکتانت بومی نفت خام ایران بررسی شدند. نمونه نفتهایی از برخی مخازن ایران با هدف بررسی حضور باکتریهای احیاکننده نیترات بومی مورد مطالعه قرار گرفت. تمامی کشتها به روش Hungate در ویالهای crimped seal شده و تنظیم اتمسفر بی هوازی، تحت شرایط کاملا بی هوازی در دمای 40درجه سانتیگرادصورت گرفت. در تمامی مراحل هالوفیل بودن باکتریهای جدا شده با افزودن NaCl به محیطهای کشت لحاظ شد. از محیط نوترینت براث و BSM فاقد منبع گوگرد که حاوی نفت خام استریل به عنوان تنها منبع کربن و انرژی بود، به منظور حذف SRB رقیب و غنی سازی اولیه استفاده شد. در مرحله بعد، نیترات براث برای جداسازی و خالص سازی باکتریهای هدف مورد استفاده قرار گرفت، سپس در محیط MSM تجدید کشت شد. جهت بررسی توانایی NRB های بومی جداشده در تولید بیوسورفکتانت از محیط کشت Blood Agar ، BHI و تکنیک پخش شدن نفت بکار برده شد. در نهایت برای حصول اطمینان از اینکه باکتریهای بی هوازی جدا شده از نفت خام قطعا از ازت نفت خام برای تامین نیاز خود استفاده میکنند، تست احیای نیترات و تست NCH که جهت بررسی کاهش ازت بود، انجام گرفت.نتایج حاصل نشان داد که نفت خام ایران دارای NRB های به شدت بی هوازی هستند که علاوه بر احیا نیترات و رقابت با SRBها، می­توانند از آن به عنوان تنها منبع کربن استفاده نمایند. این باکتریها با توانایی تحمل شوری، دما و نیز تولید بیو سورفکتانت میتوانند از کاربردی ترین باکتریها در صنعت نفت در فرایندهایی مثل ارتقائ کیفیت نفت به روش بیولوژیک، کاهش آلودگیهای محیطی و یا ازدیاد برداشت میکروبی نفت (MEOR) در شرایط بیهوازی باشند، که پیشنهاد می شود کاربرد آنها در کاهش ترشی و اسیدیته نفت خام نیز بررسی شود.

فصل اول: کلیات

1-1- مقدمه

نفت که در زبان انگلیسی Petroleum نامیده میشود، از دو کلمهPetra و Oleumکه در زبان یونانی به معنی سنگ روغن و یک نوع روغن میباشد، تشکیل شده است که در زبان فارسی معادل مناسبی ندارد. نفت و سایر مواد سوختنی هیدروکربنی به صورتی که ما امروزه آن را میشناسیم، در مخازنی در اعماق زمین وجود دارند. نفت به عنوان یک منبع انرژی در جهان محسوب می شود و با وجود منابع انرژی دیگر هنوز هم منبع انرژی غالب و در دسترس و قابل اطمینان جایگزین آن نشده است(9).

پترولیوم می تواند به صورت فازهای مختلف، از جمله فاز گازی نظیر گاز طبیعی (Natural Gas )، فاز مایع نظیر نفت خام ( Crude Oil ) و فاز جامد مثل قیر ( Asphaltene ) در خلل و فرج و شکستگی های سنگ تجمع می یابد. مهمترین منبعهیدروکربنها، نفت خام است. نفت خام شامل مقدار کمی ترکیبات آلی اکسیژن دار، نیتروژن دار و گوگردی و نیز فلزاتی است که به طور شیمیایی به مولکول های آلی متصلند. انباشته شدن مواد هیدروکربنی در زیر سطح زمین در سنگ هایی صورت می گیرد که توانایی نگه داری و انتقال سیالات را داشته باشند. معمولا نفت خام زیر پوششی از سنگ های غیر قابل نفوذ در محفظه های سنگ های متخلخل به نام مخازن یا (rReservoi) که منحصرا در حوضچه های رسوبی قرار دارند، محبوس است (10).

تجمع مواد هیدروکربنی به صورت اقتصادی در سنگ مخزن منوط به وجود عوامل متعددی است. به طور کلی وجود پنج عامل برای تجمع اقتصادی نفت و گاز لازم و ضروری است، این پنج عامل عبارتند از :

1-سنگ منشأ بالغ (Mature Source Rock) که تولید هیدروکربن کرده باشد.

2-سنگ مخزن ( Resevoir Rock) که بتواند هیدروکربن را در داخل خود جای دهد.

3-مهاجرت هیدروکربن بین سنگ منشأ و سنگ مخزن ( Migration Pathway) عملی باشد.