1-7-1- قندی شدن غیر آنزیمی پروتئین آلفا-کریستالین.. 17

1-7-2- اکسایش پروتئین آلفا-کریستالین.. 18

1-7-3- دآمیناسیون، کوتاه شدگی و قطعه قطعه شدن پروتئین آلفا-کریستالین.. 19

1-7-4- هموسیستئینه شدن پروتئین آلفا-کریستالین.. 20

1-8- آنتی اکسیدان ها و پاک کننده های رادیکال آزاد لنز. 20

1-9- جریان یونی لنز و نقش آن در همئوستاز یونی.. 22

1-9-1- سدیم و پتاسیم.. 23

1-9-2- کلر. 24

1-9-3- روی.. 24

1-9-4- آهن.. 24

1-9-5- منیزیم.. 25

1-9-6- کلسیم.. 25

1-9-7- مس…. 27

1-9-8- سلنیم، سرب و کادمیم.. 28

1-10- 1- بیوشیمی پراکسی نیتریت به عنوان مولکول اکسایشگر طبیعی.. 29

1-10-2- پراکسی نیتریته شدن پروتئین ها و آثار آن بر بدن.. 34

1-10-3- پراکسی نیتریت و بیماری های چشمی.. 40

1-11- پراکسی نیتریت و کلسیم.. 42

1-12-مس، اسید آسکوربیک و آب مروارید. 44

: مروری بر پژوهش های پیشین

مروری بر پژوهش های پیشین………………………………………………………………..45

اهداف پژوهشی…………………………………………………………………………………51

:مواد و روش ها

3-1-مواد مصرفی……………………………………………………………………………53

3-1-1- دستگاه ها……….…………………………………………………………………53

3-2- تهیه ی محلول ها …………….…………………………………………………….53

3-2-1-محلول برادفورد …….…………………………………….……………………….53

3-2-2-تهیه ی محلول های مورد نیاز روش الکتروفورز ژلی عمودی………………….55

3-2-2-1-تهیه ی محلول آکریل آمید و بیس آکریل آمید…………………………….55

3-2-2-2-تهیه ی محلول20 درصد SDS ……………………………………….…….55

3-2-2-3-تهیه ی محلول 10 درصد آمونیوم پرسولفات………………………………..55

3-2-2-5-تهیه ی بافر تریس 5/0 مولار………………………………………………….56

3-2-2-4-تهیه ی محلول بافر تریس 5/1 مولار…………………………………………56

3-2-2-6-تهیه ی بافر تانک……………………………………………………………….56

3-2-2-7-تهیه ی بافر نمونه X2………………………………………………………….57

3-2-2-8-تهیه ی محلول رنگ آمیزی کوماسی بلو………………………………………57

3-2-2-9-تهیه ی محلول رنگ بر کوماسی بلو…….…………………………………….58

3-2-3-تهیه ی محلول های مورد نیاز سنجش گروه کربونیل………………………….58

3-2-3-1-تهیه ی محلول 4،2- دی نیترو فنیل هیدرازین…………………………….58

3-2-3-2-تهیه ی محلول اسید تری کلرو استیک (TCA) 20 درصد…………………59

3-2-3-3-تهیه ی محلول اتانول-اسید اتیل استیک (نسبت 1:1 ، حجمی)………….59

3-2-3-4-تهیه ی محلول گوانیدین هیدروکلراید 6 مولار………………………………59

3-2-4-تهیه ی محلول استوک ANS ………………………………………………………………………….60

3-2-5-تهیه ی محلول استوک تیوفلاوین-…………………………………………….T60

3-2-6-تهیه ی محلول استوک اسید آسکوربیک………………………………………..61

3-2-7-تهیه ی محلول های پروتئینی و تعیین غلظت آن ها……..…………………….62

3-2-7-1-تهیه ی محلول انسولین…….………………………………………………….63

3-3- تهیه ی محیط های کشت باکتری………………………………………………. 64

3-3-1- تهیه ی محیط کشت جامد………………………………………………………64

3-3-2- تهیه ی محیط کشت مایع……………………………………………………….65

3-4- روش ها……………………………………………………………………………….65

3-4-1- آماده سازی پروتئین های لنز چشم گاو………………………………………..65

3-4-2- بیان زیر واحد هایαA و αB-کریستالین انسانی در سلول های BL21 ……. 66

3-4-3- تخلیص زیر واحدهایαA و αB-کریستالین انسانی……………………………67

3-4-4- تعیین میزان خلوص پروتئین به روش SDS-PAGE …………….…..……… 69

3-4-5-فرآیند سنتز پراکسی نیتریت………………………………………………………69

3-4-6- فرآیند پراکسی نیتریته شدن پروتئین های محلول لنز چشم وαA و αB-کریستالین انسانی….………………………………………………………………………..72

3-4-7-مطالعه ی هضم آنزیمی پروتئین های محلول لنز چشم طبیعی و تغییریافته با آنزیم آلفا-کیموتریپسین….…………………………………………………………………72

3-4-8-سنجش مقدار گروه های کربونیل پروتئین های محلول لنز چشم وαA و αB-کریستالین انسانی طبیعی و تغییر یافته……………………………………………………73

3-4-9- مطالعه فرآیند توده ای شدن پروتئین های کریستالین طبیعی و تغییر یافته در حضور یون کلسیم……………………………………………………………………………74

3-4-10- مطالعه ی فلورسانس پروتئین های محلول لنز چشم و αA-کریستالین انسانی طبیعی و تغییر یافته…………………………………………………………………………74

3-4-10-1- مطالعه ی فلورسانس ذاتی………………………………………………….75

3-4-10-2- مطالعه ی فلورسانس عارضی ANS))……………………………………..76

3-4-10-3- مطالعه ی فلورسانس تیوفلاوین-………………………………………..T77

3-4-11- الکتروفورز ژلی پروتئین های محلول لنز چشم طبیعی و تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت در حضور یون کلسیم…………………………………………………77

3-4-12- مطالعه ی اثر محافظتیαA -کریستالین انسانی طبیعی و تغییر یافته بر اکسایش اسید آسکوربیک در حضور یون مس……………………………………………79

3-4-13- مطالعه ی فعالیت چاپرونی αA-کریستالین انسانی طبیعی و تغییر یافته در حضور یون مس…………….………….………………………………………………………80

: نتایج و بحث

بخش اول……………………………………………………………………………………………………………………82

4-1- مطالعه ی اثر پراکسی نیتریته شدن بر ساختار، ایجاد حالت الیگومری و توده ای شدن پروتئین های لنز چشم در حضور یون کلسیم…………………………………………………82

4-1-1-نقش پراکسی نیتریت و کلسیم در بیماری زایی عارضه ی آب مروارید……..83

4-1-2-مطالعه ی فرآیند پراکسی نیتریته شدن پروتئین های محلول لنز……………..85

4-1-2-1-سنجش تغییر حرکت ژل الکتروفورز پروتئین های لنز تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت……………………………………………………………………………………………………..85

4-1-2-2-سنجش مقدار کربونیل پروتئین های لنز تغییریافته به وسیله ی پراکسی نیتریت………………………………………………………………………………………………………………………..87

4-1-2-3- مطالعه ی فلورسانس ANS پروتئین های لنز تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت…………………………………………………………………………………………………………..89

4-1-2-4-مطالعه ی فلورسانس دی تیروزین پروتئین های لنز تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت…………………………………………………………………………………………………………..89

4-1-2-5-مطالعه ی اسپکتروسکوپی مرئی-فرابنفش پروتئین های کریستالین تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت…………………………………………………………………………….90

4-1-3-مطالعه ی ناپایداری پروتئولیزی پروتئین های لنز تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت…………………………………………………………………………………………………………..90

4-1-4-مطالعه ی توده ای شدن پروتئین های طبیعی و تغییر یافته ی لنز به وسیله ی پراکسی نیتریت در حضور یون کلسیم………………………………………………………………….92

4-1-5-ارزیابی الیگومری شدن پروتئین های لنز طبیعی و تغییریافته در حضور یون کلسیم به وسیله ی الکتروفورز ژلی……………………………………………………………………………94

4-1-6-مطالعه ی فلورسانس عارضی پروتئین های طبیعی و تغییر یافته لنز در حضور یون کلسیم………………………………………………………………………………………………………………….99

4-1-7-مطالعه ی تشکیل فیبر آمیلوئیدی کریستالین های طبیعی و تغییر یافته در حضور یون کلسیم……………………………………………………………………………………………………101

بخش دوم…………………………………………………………………………………………………………………104

4-2- مطالعه ی ساختار و فعالیت چاپرونیαA -کریستالین های انسانی طبیعی و پراکسی نیتریته شده و بررسی نقش محافظتی آن ها در برابر اکسایش اسید آسکوربیک به وسیله ی یون های مس………………………………………………………………………………………104

4-2-1- بیان زیر واحد هایαA و αB-کریستالین انسانی در سلول های BL21………………………………………………………………………………………………………………………105

4-2-2-تخلیص پروتئین هایαA و αB-کریستالین انسانی…………………………………106

4-2-3- مطالعه ی فرآیند پراکسی نیتریته شدن پروتئینαA -کریستالین انسانی……………………………………………………………………………………………………………………….108

4-2-3-1- مطالعه ی الکتروفورز ژلی پروتئینαA -کریستالین تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت………………………………………………………………………………………………………..108

4-2-3-2-سنجش مقدار کربونیل پروتئین های αA و αB-کریستالین تغییریافته به وسیله ی پراکسی نیتریت………………………………………………………………………………………..109

4-2-3-3- مطالعه ی فلورسانس تریپتوفان و عارضی پروتئین αA-کریستالین تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت………………………………………………………………………….110

4-2-3-4-مطالعه ی فلورسانس دی تیروزین پروتئین αA-کریستالین تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت………………………………………………………………………………………..111