1 .4 ارزیابی قبل از درمان.. 6

1 .5 درمان.. 6

1 .6 مکانیسم مولکولی سرطان.. 9

1 .6 .1 مسیر پیام رسانی TGFβ 9

1 .6 .1 .1 خانواده لیگاند های TGFβ.. 11

1 .6 .1 .2 رسپتور نوع 1و2 ( TGFβRI,II) 11

1 .6 .1 .3 فسفریلاسیون SMAD… 12

1 .6 .2 تنظیم پیام رسانی TGFβ. 12

1 .6 .3 دخالت پیام رسانیTGFβ در سرطان.. 13

1 .6 .4 ژنهای همئوباکس(Homeobox) 14

1 .6 .4 .1 ساختار ژن های همئوباکس….. 14

1 .7 نقش ژن های همئوباکس (Homeobox) در ایجاد سرطان.. 17

1 .8 miRNA 18

1 .8 .1 بیوژنز miRNA ها و نحوه مهار ترجمه. 19

1 .9 miRNA و سرطان.. 20

1 .10 miRNA ابزاری برای شناسایی و تشخیص سرطان.. 21

1 .11 miRNA ودرمان سرطان.. 22

1 .12 بیان مسئله و اهمیت پژوهش…. 23

1 .13 اهداف پژوهش…. 24

1 .13 .1 هدف اصلی.. 24

1 .13 .2 اهداف ویژه 24

1 .13 .3 هدف کاربردی.. 25

فصل 2: بررسی متون.. 26

2 .1 بررسی متون مرتبط با موضوع. 27

فصل 3:مواد و روش ها 32

3 .1 مواد شیمیایی و آنزیم ها 33

3 .1 .1 پلاسمیدوسویه باکتری.. 35

3 .1 .1 .1 خصوصیات پلاسمید.. 36

3 .1 .1 .2 خصوصیات میزبان.. 37

3 .2 روش ها 37

3 .2 .1 کشت باکتری.. 37

3 .2 .1 .1 مواد و وسایل مورد نیاز برای کشت باکتری… 37

3 .2 .1 .2 طرز تهیه محیط کشت LB مایع.. 38

3 .2 .1 .3 گلیسرول استاک…. 38

3 .2 .2 روش انجام miniprepاستخراج DNA پلاسمیدی از باکتری.. 39

3 .2 .2 .1 بررسی کمی وکیفی DNA پلاسمیدی… 41

3 .2 .3 هضم آنزیمی پلاسمید های استخراج شده 45

3 .2 .4 کشت سلولی.. 46

3 .2 .4 .1 محیط کشت…. 46

3 .2 .4 .2 سرم جنینی گاوFBS.. 47

3 .2 .4 .3 تهیه محیط انجاد از سلولها 47

3 .2 .4 .4 خصوصیات سلولهای مورد استفاده شده در این پایان نامه. 48

3 .2 .5 تعیین منحنی کشندگی انتی بیوتیک G418. 48

3 .2 .6 منطبق سازی سلولها 48

3 .2 .7 ترانسفکشن سلولهای Y79 با وکتور پلاسمیدی نوترکیب pEGFP-TGIF2LX.. 49

3 .2 .8 انتخاب سلولهای مثبت… 50

3 .2 .9 بررسی بیان ژن TGIF2LX در سلول های ترانسفکت شده در سطح mRNA بوسیله Realtime RT-PCR 51

3 .2 .9 .1 محافظت از RNA… 52

3 .2 .9 .2 استخراج RNA… 55

3 .2 .9 .3 تیمار نمونه RNA باآنزیم دئوکسی ریبونوکلئاز I. 59

3 .2 .9 .4 سنتز DNA مکمل(cDNA) 60

3 .2 .9 .5 PCR(Polymerase chain reaction) واکنش زنجیره ای پلیمراز. 64

3 .2 .9 .6 واکنش Realtime PCR… 68

3 .2 .9 .7 تجزیه و تحلیل داده های حاصل از واکنش Realtime RT-PCR… 77

3 .2 .10 بررسی بیان eGFP-TGIF2LX در سطح پروتئین بوسیله Western blot 78

3 .2 .10 .1 الکتروفورز عمودی SDS-PAGE.. 78

3 .2 .10 .2 رنگ آمیزی SDS-PAGE.. 84

3 .2 .10 .3 وسترن بلاتینگ….. 86

3 .2 .11 بررسی میزان تکثیر سلولی بوسیله تجزیه نمک تترازولیوم. 90

3 .2 .11 .1 بررسی اثر بیان افزایشی TGIF2LX سلولهای Y79 در مقایسه با کنترل.. 90

3 .2 .11 .2 بررسی اثر متقابل SD-208 و بیان افزایشی TGIF2LX سلولهای Y79 در مقایسه با کنترل.. 91

3 .2 .11 .3 پروتکل شمارش سلول.. 92

3 .2 .12 مطالعه بیان اثر داروی SD-208 بر روی بیانTGIF2LX, miRNA Let7g,18a,34a,22,20 در سلولهای ترانسفکت شده Y79 در مقایسه با نمونه های کنترل به وسیله Real time RT-PCR.. 92

فصل 4: نتایج و یافته ها 96

4 .1 Mini prep و هضم DNA پلاسمیدی جهت تایید وکتور نوترکیب… 97

4 .2 بررسی بیانTGIF2LX در سطح mRNA… 98

4 .2 .1 نتیجه بررسی کیفی و کمی RNA.. 98

4 .2 .2 بررسی کیفی cDNA.. 99

4 .3 بررسی بیان TGIF2LX در سلولهای ترانسفکت شده 101

4 .3 .1 مطالعه بیان TGIF2LX در سلولهای ترانسفکت شده Y79 در مقایسه با نمونه های کنترل بوسیله میکروسکوپ 101

4 .3 .2 تایید بیان واضح ژن GFP-TGIF2LX توسط Realtime RT- PCR.. 102

4 .3 .3 مطالعه بیان ژن TGIF2LX در سلول های ترانسفکت شده با وکتور حاوی GFP-TGIF2LX در سطح پروتئین بوسیله Western Blot 104

4 .3 .4 مطالعه بیان اثر داروی SD-208 بر روی بیانTGIF2LX در سلولهای ترانسفکت شده Y79 در مقایسه با نمونه های کنترل 105

4 .4 بررسی اثر بیان افزایشی TGIF2LX بر روی سلولهای Y79. 105

4 .4 .1 نتایج ازمایش (MTT)Microculturetetrazolium Test 105

4 .4 .2 بررسی اثر متقابل SD-208 و بیان افزایشی TGIF2LX بر روی سلولهای Y79 در مقایسه با کنترل.. 106

4 .5 بررسی بیان miRNA Let7g,18a,34a.22,20a در سلولهای ترانسفکت شده و کنترل.. 108

4 .6 مطالعه بیان اثر داروی SD-208 بر روی بیان miRNA Let7g,18a,34a.22,20 در سلولهای ترانسفکت شده Y79 در مقایسه با نمونه های کنترل.. 109

4 .7 Ct در واکنش Realtime PCR.. 110

فصل 5: بحث، نتیجه گیری و پیشنهادها 113

5 .1 بحث 114

5 .2 تاثیر بیان افزایشی TGIF2lX بر روی Cellular Viability در رده سلولی Y79. 116

5 .3 تاثیر دارویSD-208 بر روی Cellular Viability در رده سلولی Y79 بیان کننده افزایشی TGIF2LX و کنترل 117

5 .4 اثر SD-208 بر روی بیان TGIF2LX در رده سلولی Y79 ترانسفکت شده در مقایسه با کنترل 118

5 .5 اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیانmiRNA های مورد مطالعه. 118

5 .5 .1 اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNAlet7g در رده سلولی Y79. 118

5 .5 .2 اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNA18a در رده سلولی Y79. 119

5 .5 .3 اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNA34a در رده سلولی Y79. 119

5 .5 .4 اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNA22 در رده سلولی.. 119

5 .5 .5 اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNA20a در رده سلولی Y79. 120

5 .6 نتیجه گیری.. 120

7.5 پیشنهاد ها ……………………….121

منابع و مراجع.. 122

پیوست ها 131

1 .1 رتینوبلاستوما

رتینوبلاستوما یکی از سرطان های بدخیم چشمی شایع کودکی می­باشد که به دو فرم پراکنده (تک گیر) و ارثی(خانوادگی) وجود دارد [1]. تقریبا 4 درصد تومورهای کودکان را رتینو بلاستوما تشکیل می­دهد .این تومور شایعترین بدخیمی اولیه چشمی است که در غرب 99درصد کودکان از این سرطان نجات پیدا می­کنند ولی بیش از 90 درصدآنها بینایی خود را از دست می­دهند و متاسفانه در کشورهای در حال توسعه بقا کودک تقریبا 50 درصد می­باشد[2] و [3].

اغلب کودکان مبتلا به رتینوبلاستوما با علامت لوکوکوریا[1] (شکل ‏1‑1) که والدین آنها متوجه م­شوند مراجعه می­کنند[4].

1 .1 .1 اپیدمیولوژی

رتینوبلاستوما تقریبا با شیوع 1 در 15000و 1 در 16600تولد زنده در امریکا و اروپای شمالی رخ میدهد [5] و [6] ودر بین سالهای 2005-2009شیوع سالیانه رتینوبلاستوما در امریکا 4.1 در هرمیلیون کودک زیر 15 سال می­باشد[5] ودر کل دنیا سالیانه 5000تا 8000 کودک مبتلا به رتینوبلاستوما می­شوند [7] به طور متوسط سنتشخیص بیماریزیر 2 سال است و تقریبا 95درصد قبل از 5 سالگی می­باشد.شیوع بیماری در بین دختر وپسر و سیاه و سفید شبیه به هم می­باشد[5].

تقریبا 1/4 موارد رتینوبلاستوما دو طرفه می­باشد بیماریهای دوطرفه همیشه الگوی ارثی دارند. تومور های دو طرفه زودتر در کودکان رخ می­دهد که نشان دهنده وجود موتاسیون در سلولهای زایا می­باشد. فرم ارثی رتینوبلاستوما نیازمند یک جهش ژرم لاین است که می­تواند از هر یک از والدین یا از محیط( که منجر به یک موتاسیون ژرم لاین شود) می­باشد. بر عکس فقط 15 درصد از موارد یکطرفه ارثی هستند که اغلب چند کانونی هستند و باید از نظر جهش ژرم لاین بررسی شوند که معمولا در 2سال اول زندگی رخ می­دهد کم تر از 10 درصد بیماران رتینوبلاستومایی تاریخچه مثبت خانوادگی دارند.

تقریبا 60 درصد کودکان با رتینوبلاستوما الگوی یک طرفه غیر ارثی دارند.کودکان با رتینوبلاستوما غیرارثی یک موتاسیون جدید در یک سلول شبکیه دارند که منجر به تومور می­شوند [8] . ناهنجاری ژنتیک در فرم ارثی رتینوبلاستوما موجب ایجاد و پیشرفت تومور مثل استئوژنیک سارکوما وسارکومای بافت نرم(بخصوص لیومیوسارکوما)و ملانومای بدخیم میشود شیوع سرطان ثانویه بعد از تشخیص رتینوبلاستوما در فرم ارثی و غیرارثی به ترتیب 51 و 5 درصد میباشد که بیش از 60 درصد سرطان ها سارکوما می­باشد [9].

1 .1 .2 پاتوژنز

رتینوبلاستوما معمولا بوسیله غیر فعال شدن هر دو الل ژن رتینوبلاستوما رخ می­دهد.با الگوی اتوزومی غالب این ژن در ناحیه کروموزم 13 بازوی بلند در ناحیه 14قرار دارد که کد کننده یک پروتئین هسته ای با نقش تومورساپرسوری می­باشد [10].

مدل 2 ضربه ای که پیشنهاد شده است دلیل متفاوت بودن ویژگی های کلینیکی موارد ارثی و غیر ارثی رتینوبلاستوما را مطرح میکند[11]. (شکل ‏1‑2)

شکل ‏1‑2: مدل 2 ضربه ای رتینوبلاستوما

در مدل ارثی در ژن RB1 یک موتاسیون در کل سلول ها وجود دارد و ضربه دوم در مراحل بعدی تکامل رخ می­دهد که این افراد مستعد رتینوبلاستومای دوطرفه و چندکانونی می­باشند.ضربه دوم می­تواند رخ دهد ویا توسط تغییرات اپی­ژنتیک خاموش شود.

در مدل رتینوبلاستومای غیر ارثی دو جهش در یک الل به صورت خودبه خودی در یک سلول سوماتیک شبکیه رخ میدهد که معمولا منجر به مدل کلینیکی تومور یه کانونی ویه طرفه رتینوبلاستوما می­شود [12].

رتینوبلاستوما اگر درمان نشود رشد میکند و جای چشم را اشغال می­کند وکره چشم را از بین میبرد و ممکن است طی 4 ماه بعد از تشخیص به مغز متاستاز بدهد و مرگ طی یک سال رخ بدهد.اغلب راههای متاستاز تومور به وسیله اپتیک نرو[3] به سیستم عصب مرکزی و یا گسترش از طریق مشیمیه به اربیت میباشد [13].

1 .1 .3 ویژگی های کلینیکی وتشخیصی

لوکوکوریا شایعترین علامت در کودکان رتینوبلاستومایی میباشد اگر چه علایم دیگر نیز وجود دارد و لوکوکوریا برای تشخیص ضروری نیست. شایعترین علایم لوکوکوریا (54درصد) و استرابیسم (19درصد) کاهش دید (4درصد) عفونت چشمی (5درصد) و تاریخچه خانوادگی مثبت (5درصد) میباشد و موارد دیگر عنبیه هتروکروم وخونریزی ویتره و هایفما بدون ضربه و گلوکوم و سلولیت اربیت و پروپتوزیس و درد چشم و تب می­باشد [14].