1-1-3 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس توان تمایزی آنها ……………………………………………………….

4

1-1-4 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس منشا ……………………………………………………..

4

1-1-4-1 سلول­های بنیادی جنینی…………………………………………………

6

1-1-4-2 سلول بنیادی خون بند ناف………………………………………..

7

1-1-4-3 سلولهای بنیادی بزرگسالان………………………..

10

1-1-5 سلول­های مغز استخوان ……………………………….

10

1-1-5-1 سلول­های بنیادی خونساز…………………………..

11

1-1-5-2 سلول مزانشیم مغز استخوان……………………………..

12

1-2 تاریخچه سلول بنیادی مزانشیم ………………………………..

13

1-2-1 مورفولوژی سلول بنیادی مزانشیم …………………………..

14

1-2-2 کنام سلول بنیادی مزانشیم مغز استخوان ……………………………………..

15

1-2-3 ویژگی­های اساسی سلول بنیادی مزانشیم …………………….

16

1-3 کاربردهای سلول بنیادی مزانشیم در درمان ………………..

17

1-3-1 ترمیم استخوان ……………………………………………….

17

1-4 بافت استخوان ……………………………………………..

20

1-5 استئوژنز(استخوان سازی) ……………………………..

21

1-5-1 استخوان­سازی اولیه یا جنینی ………………………..

23

1-5-2 استخوان­سازی ثانویه ………………………………………………..

23

1-5-3 دوباره­سازی استخوان …………………………………………..

24

1-6 هتروژن بودن کشت سلول بنیادی مزانشیمی ……………..

25

1-6-1 شرایط آزمایشگاهی تمایز مزانشیم به استخوان ………………………………………………

25

1-6-2 تنظیم مولکولی تمایز به استخوان سلول های بنیادی مزانشیمی ……………………………………………..

27

1-6-3 نقش سیگنال دهی Wnt در تمایز سلول های بنیادی مزانشیم به استخوان …………………………

29

1-7 عنصر بور ……………………………………..

30

1-7-1 مشتقات بور ………………………………………………………..

32

1-7-2 فراوانی عنصر بور ………………………………………

32

1-7-3 تاریخچه مصرف بور ………………………………..

33

1-7-4 منابع طبیعی بور…………………………………

34

1-7-5 اثرات بور برفلزات ضروری برای متابولیزم در جانوران ………………………………………….

34

1-7-5-1 تاثیر بور بر فیزیولوژی بدن …………………………………..

36

1-7-5-2 تاثیر بور بر روی سرین پروتئازها ……………………………………………………..

37

1-7-6 کاربرد بور در دارو ………………………………………………

37

1-7-7 سرطان ……………………………………………………….

39

1-8 اثرات بور روی استخوان …………………………………….

40

1-9 بور و خون ………………………………………………………..

41

1-10 بور در گیاهان …………………………………………………………

42

1-11 سمیت بور …………………………………………….

44

1-12 محدوده استفاده بور ………………………………………………

45

مروری بر مطالعات گذشته ………………………………………

47

هدف مطالعه ……………………………………………………………..

فصل دوم: مواد و روش­ها

50

2-1 انتخاب رت ……………………………………………………………….

50

2-2 جدا سازی وتكثیر سلول های بنیادی مزانشیم مغز استخوان …………………………………..

52

2-2-1 اجرای پاساژ ………………………………

54

2-3 اثبات مزانشیم بودن سلول های استخراج شده ……………………………………….

54

2-3-1 تمایز به استخوان …………………………………………………………….

55

2-4 بررسی توان زیستی سلولها (دوز فایندینگ) ………………………………

55

2-4-1 رنگ آمیزی تریپان بلو ………………………………………………..

57

2-4-2سنجش تترازولیوم (MTT) …………………………………………………….

57

2-4-2-1 مراحل انجام سنجش MTT)غیر استئوژنیک( …………………………………………………………………..

58

2-4-2-2 ترسیم منحنی استاندارد با استفاده از سنجش تترازولیوم …………………………………………………

59

2-4-2-3 مراحل انجام تست MTT استئوژنیک …………………….

60

2-5انتخاب دوز مورد نظر ………………………………………..

60

2-6 بررسی توان تکثیری سلول­های بنیادی مزانشیم …………….

61

2-6-1 سنجش توانایی کلونی­زایی ………………………………

63

2-6-2 محاسبه تعداد دوبرابرشدگی جمعیتی(PDN) ………………..

62

2-7 بررسی تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از رنگ آمیزی فلوروسنت ……………………………………………..

65

2-8 آزمون­های بیوشیمیایی در شرایط تمایز و غیرتمایزی ………………………………………….

65

2-8-1تیمار و استخراج عصاره سلولی ………………………………

65

2-8-2 بررسی فعالیت آنزیم­ها ………………………………………

66

2-8-2-1 تهیه ی نمودار استاندارد برای آزمایش لاوری …………………………………….

66

2-8-2-2 ترانس آمینازها …………………………………

68

2-8-2-3 لاکتات دهیدروژناز…………………………………

70

2-8-2-4 آنزیم آلکالین فسفاتاز ………………………………………………

72

2-8-3 سنجش میزان رسوب ماتریكس معدنی به كمك رنگ آلیزارین رد در سلول های استئوژنیک

72

2-8-3-1 رسم منحنی استاندارد برای رنگ آمیزی آلیزارین رد ………………………..

73

2-8-3-2بررسی رسوب ماتریکس استخوانی در نمونه های تیمار شده …………………………………

73

2-8-4بررسی الکترولیت ها )کلسیم، سدیم و پتاسیم( …………………….

73

2-8-4-1 بررسی میزان کلسیم داخل سلولی با استفاده از کیت کلسیم به روش رنگ سنجی …………

74

2-8-4-1-1 مراحلانجام تست کلسیم در سلول های تمایز یافته )استئوبلاست( …………………………..

75

2-8-4-1-2 مراحل انجام اندازه­گیری میزان کلسیم …..

76

2-8-4-2 اندازه­گیری غلظت سدیم و پتاسیم سلول استئوژنیک و غیر استئوژنیک …………………………..

81

2-9 تجزیه و تحلیل آماری داده ها …………..

فصل سوم: نتایج

82

3-1 الف: نتایج مرحله اول …………………………………

82

3-1-1 رشد و تکثیر سلولهای بنیادی مزانشیم ……………………

82

3-1-2 اثر اسید بوریک بر توانایی زیستی سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت ……………………

85

3-1-3 بررسی مورفولوژی سلولهای تیمار شده ………………

87

3-1-4 نتایج توانایی کلونی زایی، تعداد دوبرابر شدگی جمعیت سلول ……………………………………………..

89

3-1-5 اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی ……

91

3-1-6 میزان الکترولیتها…………………………………………..

92

3-2 نتایج اثر دوزهای انتخابی اسید بوریک بر شاخص های تمایز به استئوبلاست …………………………..

92

3-2-1 توانایی زیستی سلولها در روند تمایز ………………………..

93

3-2-2 بررسی تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از رنگ­آمیزی فلورسنت در نمونه­هایاستئوژنیک

96

3-2-3 بررسی اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی سلولهای تمایز یافته ………………………………..

97

3-2-3-1میزان معدنی شدن ماتریکس با سنجش رنگ آلیزارین رد ………………………………………………..

100

3-2-3-2میزان رسوب کلسیم ……………………………………..

101

3-2-3-3بررسی فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز ………….

101

3-2-3-2 بررسی فعالیت آنزیم آسپارتات و آلانین ترانس آمیناز ………………………………………………………..

103

3-2-3-5 بررسی فعالیت لاکتات دهیدروژناز ………………..

103

3-2-3-6بررسی سطح الکترولیت های سلولهای استئوژنیک ……………………………………………

فصل چهارم: بحث و نتیجه­گیری

105

4-3 اثر اسیدبوریک بر سلولهای مزانشیم ………………………..

105

4-1-1اثر اسید بوریک بر توانایی زیستی و توان تکثیر سلولها ……………………………………………………

108

4-1-2 بررسی تاثیر اسید بوریک بر تغییرات مورفولوژیکی …………………………………………………………………

109

4-1-3 اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی ….

113

4-1-4 اثر اسید بوریک بر فعالیت آنزیمهای متابولیکی ………………………………………

116

4-2 اثر اسیدبوریک بر تمایز سلولی ………………………………

116

4-2-1 توانایی زیستی …………………………………….

119

4-2-2 بررسی سطح الکترولیت ها …………………………………………….

120

4-2-3 بررسی فاکتورهای استئوژنیک …………………….

124

4-2-4 بررسی اثر اسید بوریک بر آنزیم های متابولیکی …………..

127

4-2-5 تاثیر اسید بوریک بر مورفولوژی سلولهای تمایزی ……………………………………………..

128

4-3 نتیجه گیری ………………………………………………………

129

4-4 پیشنهادات …………………………………………………………….

فصل پنجم:ضمیمه

131

5-1 روش تهیه محیط کشت ………………………………………………….

131

5-2 تهیه ی فسفات بافر سالین PBS^–…………………………….

132

5-3 تهیه ی فسفات بافر سالین مثبت PBS⁺………………………

132

5-4 روش تهیه محیط تمایزی استئوژنیک …………………………..

133

5-5 آماده سازی آلیزارین رد ……………………………………………

133

5-6 روش تهیه محلول تریپان­بلو 4/0 درصد …………………………….

133

5-7 تهیه کریستال ویولت ………………………………………

133

5-8 روش تهیه محلول MTT………………………………….

133

5-9روش تهیه بافر شست و شو( ( Tris-Hcl-NaCl…………………..

133

5-10 مواد لازم و روش تهیه بافر استخراج ( Tris-Hcl) …………

134

5-11 روش تهیه بافر ARS ……………….

134

5-12 روش تهیه محلول BSA ……………………………

134

5-13 روش تهیه محلول کمپلکس لاوری …………

135

5-14 روش تهیه بافر استخراج کلسیم ………………………….

135

5-15 روش تهیه رنگ های فلورسنس هوخست و آکریدین اورنژ ….

تعریف سلول­های بنیادی

به طور نرمال سلول­های تخصص یافته بدن مثل سلول پوست یا سلول عصبی در تمام دوره زندگی به همان صورت باقی می­مانند، اما در بدن سلول­های دیگری به نام سلول­های بنیادی وجود دارند که توانایی تبدیل به سلول­های دیگری چون سلول قلب، عصبی، ماهیچه و ……. را دارا می­باشند (1).

سلول­های بنیادی[1] سلول­هایی غیر تخصصی[2] در بدن هستند که قابلیت تمایز به سلول­های تخصص­یافته را با کسب کلیه اعمال سلولی تخصصی دارند. این سلول­ها دارای دو ویژگی اساسی یعنی توانایی تقسیم و تولید سلول­هایی با خواص یکسان (خودنوزایی)[3]و ایجاد انواع سلول­های تمایزیافته می باشند (شکل 1-1)(1).

به دلیل این­که این سلول­ها منشا تولید بقیه انواع سلول­ها هستند واژه بنیادی در مورد آنها به کار می­رود به عبارت دیگر یک سلول بنیادی، سلولی است که به دلیل توانایی کسب کلیه اعمال تخصصی قابلیت تبدیل به سلول­های تخصص یافته را دارد. این سلول­ها جهت تمایز نیازمند دریافت سیگنال هستند. قاعدتاً یک سلول بنیادی تا قبل از دریافت یک سیگنال جهت تکامل به سلول تخصصی به صورت غیرتخصصی باقی می­ماند. سلول­های بنیادی در بدن انسان ویژگی تمایز به بسیاری از سلول­ها را دارند. همچنین به عنوان سیستم ترمیم به خدمت گرفته می­شوند زیرا که توانایی تقسیم بدون محدودیت برای جایگزینی دیگر سلول­ها را دارا می­باشند. وقتی یک سلول بنیادی تقسیم می­شود هر سلول جدید بدست آمده این پتانسیل را دارد که سلول بنیادی باقی بماند یا به سلول تخصصی جدید مثل سلول­های خونی و … تمایز یابد (1).

شکل1-1: توانائی خودنوزائی و پتانسیل تمایز در سلولهای بنیادی (www.cellingbiosciences.com)

1-1-2 ویژگی خودنوزایی سلول بنیادی

تکثیر یا خودتجدیدی، توانایی سلول­ها در تولید نسخه­های یکسان از خود، توسط تقسیم میتوز در یک دوره زمانی مشخص است به صورتی که خصوصیات ژنتیکی و کاریوتایپی در سلول­های دختری عینا شبیه سلول­های مادری باقی می­ماند.

خودتجدیدی سلول­ها بنیادی تحت تاثیر سیگنال­های درونی سلول بنیادی که به صورت تقسیم متقارن و نامتقارن است، قرار دارد. علاوه بر این سیگنال­های درونی، خودتجدیدی سلول­های بنیادی تحت تاثیر عوامل محیطی چون آسیب یا صدمه نیز می­باشد و تحت تاثیر این شرایط یک سلول بنیادی ممکن است دو سلول دختری ایجاد کند که یا به صورت سلول­های بنیادی باقی می­مانند یا متمایز می­شوند (2).

1-1-3 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس توان تمایزی آن­ها:

سلول های بنیادی بر اساس توان تمایزی به صورت زیر دسته بندی می شوند:

الف) همه توان[4]:واژه Totipotent از دو قسمت Toti= همه، potent= توانایی تشکیل شده است. از جمله این سلول­ها می­توان بلاستومرهای یک جنین دو سلولی را نام برد که قادر است همه سلول­های بدن یک فرد کامل را بسازد. این سلول ها می توانند به انواع سلول های جنینی و برون جنینی تمایز پیدا کنند و اندام های قابل زیستی را ایجاد نمایند.

ب) پر توان[5]:این نوع سلول­ها قادر به ساخت غالب یا همه سلول­های فرد هستند. به عنوان مثال سلول­های بنیادی جنینی تحت شرایط خاص می­توانند یک فرد را بسازند ولی قادر به ایجاد سلول­های جفت نیستند. سلول های بنیادی جنینی و سلول های پر توان القایی جز این دسته از سلول های بنیادی می باشند.

پ)چند توان[6]:سلولهای بنیادی هستند كه به تعداد محدودتری از انواع سلول تمایز پیدا می­ کنند (در بافت­های بزرگسال نظیر مغز، مغز استخوان، كبد و… وجود دارند).

ت) یک توان[7]:توانایی ایجاد یک نوع سلول را دارند ولی توانایی خود نوزایی خود را حفظ کرده­اند. مانند سلول­های بنیادی اسپرماتوگونی که توانایی تولید اسپرم را دارند (شکل 1-2)(3).

شکل 1-2: دسته­بندی سلول­های بنیادی براساس پتانسیل تمایزی آنها (www. njavan.com).

1-1-4 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس منشا

سلول­های بنیادی بر اساس منشا به سه دسته اصلی تقسیم­بندی می­شوند

1-1-4-1 سلول­های بنیادی جنینی

کشت موفقیت آمیز آزمایشگاهی سلول­های بنیادی جنینی انسانی (ESCs) [8] در سال 1998 توسط تامپسون و همکارانش انجام گرفت.