2-10-1-تفاوت توالی انتهای 5 mRNA های آلفا آمیلاز کبدی و غدد بزاقی موش از لحاظ اندازه 19

2-10-2- مطالعات مربوط به آنالیز توالی mRAN آلفا آمیلاز کبدی. 20

2-10-3- خصوصیات mRAN آلفا آمیلاز کبدی. 20

21

. 22

. 22

23

24

24

24

25

25

25

26

فصل سوم مواد و روشها 27

3-1- روش های اجرایی کار : 28

3-1-1- حیوان آزمایشگاهی مورد مطالعه : 28

3-1-1-1-دلایل انتخاب این حیوان به طور خلاصه عبارتند از : 28

3-1-1-2-شرایط نگه داری حیوانات : 28

3-1-2- نوع مطالعه 29

3-2- روش اجرای طرح (چاق کردن موش ها با استفاده از رژیم غذایی با چربی بالا) 29

. 30

3-2-2- جدا سازی کبد و خونگیری از قلب موش.. 30

3-3- استخراج RNA 34

3-3-1- وسایل کار استخراج RNA. 34

3-3-2- مراحل استخراج RNA.. 34

3-3-2-1- رسوب دادن RNA : 35

3-3-2-2- شستشوی RNA : 35

3-3-2-3- خشك كردن رسوب RNA : 35

3-3-3- ارزیابی كمی و كیفی RNA استخراج شده: 36

3-3-3-1- اندازه گیری مقدار RNA : 36

3-3-3-3- حفظ و نگهداری RNA: 37

3-4- بررسی بیان ژن 37

3-4-1- RT-PCR. 37

3-4-2- تکثیر cDNA. 39

39

43

3-4-2-3- روش انجام آزمایش ساخت cDNA.. 44

3-4-2-4- نحوه انجام واكنش RT-PCR برای اطمینان از صحت سنتز cDNA.. 45

3-4-2-5- آشکار سازی محصولات PCR با الکتروفورز. 47

3-4-2-6- دستگاههای مورد نیاز برای الکتروفورز. 47

347

3-4-2-8- نحوه انجام الکتروفورز. 48

3-4-2-9- آشکار سازی ژل. 48

3Real time PCR. 49

Real-time PCR. 49

Real time PCR. 50

Real-time PCR. 51

3-5-3-1- روش غیر اختصاصی سنجش با Real-time PCR.. 51

. 52

53

Real time PCR. 55

Real time PCR. 55

3-5-6-2-روش انجام آزمایش Real time PCR. 55

3-5-6-3- آنالیز آماری 57

3-6-اندازه گیری α-Amylase در سرم موش: 57

3-6-2- اندازه گیری α-Amylase در سرم روش فتومتریک.. 57

فصل چهارم نتایج.. 60

4-2- تعیین کیفیت و غلظت RNA استخراج شده 66

4-3- بررسی کیفیت cDNA سنتز شده به وسیله PCR 67

68

4-4-1- مقایسه بیان ژن liver alpha amylase در موش های چاق و نرمال. 70

4-4-2-اثر چای سبز بر بیان ژن liver alpha amylase بر روی موش های چاق. 71

4-5- اندازه گیری آلفا آمیلازدر سرم به روش فتومتریک 72

فصل پنجم : بحث و نتیجه گیری 73

5-1- بحث و نتیجه گیری 74

5-2-پیشنهادات 8

منابع 83

خلاصه انگلیسی 92

عنوان فهرست جداول صفحه

29

cDNA 44

cDNA 44

cDNA 45

45

46

Real time PCR. 55

Real time PCR. 56

59

61

67

عنوان فهرست نمودارها صفحه

نمودار 3-1-فازهای مختلف واکنش تکثیر 51

نمودار 3-2-Cycle threshold&Threshold. 53

نمودار 3-3-منحنی ذوب 54

نمودار 3-4-مراحل مختلف انجام واکنش Real time PCR. 56

نمودار 4-1-تغییرات وزن موش ها کنترل تیمار و کنترل عادی 64

نمودار 4-2-تغییرات وزن موش ها کنترل تیمار و کنترل عادی 64

نمودار 4-3-تغییرات وزن موش ها چاق تیمار و چاق عادی 65

نمودار 4-4-تغییرات وزن موش ها چاق تیمار و چاق عادی 65

نمودار 4-5-منحنی تکثیرژن آلفا آمیلاز کبدی 69

نمودار 4-6-منحنی ذوب ژن آلفا آمیلاز کبدی 69

نمودار 4-7-متوسط میزان تغییرات بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در موش های چاق عادی و کنترل عادی 70

نمودار 4-8-متوسط میزان تغییرات بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در موش های چاق عادی و چاق کنترل 71

نمودار 4-9-تغییرات آمیلاز در سرم موش های چاق و نرمال بر حسب IU/ml به روش فتومتریك 72

عنوان فهرست اشکال صفحه

شکل2-1-نمایی شماتیک از آلفا آمیلاز یون کلسیم به رنگ خاکی و یون کلرید به رنگ سبز است 11

شکل2-2-ساختار کریستالی آلفا آمیلاز جو ایزوآنزیم 1 16

شکل2-3-جایگاه ژن آمیلاز روی ژن 1p21 17

شکل2-4-این شکل تکامل ژن آمیلاز انسانی را نشان می دهد 19

شکل2-5-توالی ای که بعنوان عامل تفاوت در سایز بین mRAN آلفا آمیلاز کبدی و غدد بزاقی 20

شکل2-6-مقایسه شماتیکی از mRAN آلفا آمیلاز کبدی و بزاقی 21

شکل3-1-پلت آزمایشگاهی 30

شکل3-2-مراحل خونگیری از قلب موش 32

شکل3-3-مراحل جداسازی کبد موش 33

شکل3-4- غلظت مواد استفاده شده در Master mix استفاده شده در PCR 46

شکل3-5-اتصال SYBR به DNA 52

شکل4-1-تصویر باند حاصل از RNA استخراج شده 67

شکل4-2-صویر محصولات PCR چند نمونه که به صورت تصادفی انتخاب شده بودند 68

چکیده:

مقدمه و اهداف