1-3-5) لجن صفراوی. 24

1-3-6)سنگ کلسترولی. 26

1-3-6-1) سنگ های پیگمانی. 26

تشخیص… 27

1-3-7) علائم بیماری سنگ کیسه صفرا. 28

1-3-7-1) سیر طبیعی. 29

درمان. 30

1-3-7-2) درمان جراحی. 30

1-3-7-3) درمان طبی- حل کردن سنگ کیسه صفرا 31

1-3-8) کله سیستیت حاد 32

1-3-8-1) مورفولوژی. 35

1-3-8-2) خصوصیات بالینی کوله سیستیت حاد 36

1-3-8-3) کله سیستیت بدون سنگ… 36

1-3-9) کله سیستوپاتی بدون سنگ… 37

1-3-10) کله سیستیت آمفیزماتو. 38

1-3-11-1) کله سیستیت مزمن. 38

1-3-11-2) مرفولوژی. 40

1-3-11-3) خصوصیات بالینی کوله سیستیت مزمن. 40

1-3-11-4) خصوصیات بالینی تشخیص کوله سیستیت حاد و مزمن. 40

1-4) اختلالات مجاری صفراوی خارج کبدی. 41

1-4-1) کوله دوکولیتاز و کلانژیت صعودی. 41

1-4-2) آترزی صفراوی خارج کبدی. 42

1-4-2-1) سیر بالینی. 43

1-4-3) تومورها 43

1-4-3-1-1) سرطان کیسه صفرا 43

1-4-3-1-2)مورفولوژی: 44

1-4-3-1-3) خصوصیات بالینی. 44

1-4-3-2) کارسینوم مجاری صفراوی خارج کبدی، از جمله آمپول واتر. 45

1-4-3-2-1) مورفولوژی. 45

1-4-3-2-2) خصوصیات بالینی. 46

فصل دوم: سوابق مربوط.. 49

فصل سوم: مواد و روشها 65

3-1) چکیده روش تحقیق. 66

3-1-2) جامعة مورد مطالعه 67

3-1-3) منطقه مورد پژوهش… 68

3-1-4) روش نمونه گیری. 72

3-2-1) آماده سازی سنگ صفرا برای استخراج DNA.. 74

3-2-2) آماده سازی لایه مخاطی کیسه صفرا برای استخراج DNA.. 74

3-2-3) آماده سازی مایع صفراوی برای استخراج DNA.. 74

3-3) روش استخراج DNA به روش کیت سینا ژن. 75

3-4) واکنش زنجیره ای پلیمرازی. 76

3-4-1)مواد 77

3-4-1-1) میكروتیوب ها و نوك سمپلرها 77

3-4-1-2) محلول بافری PCR با غلظت 5X.. 77

77

3-4-1-4) Kcl 78

3-4-1-5) Tris Hcl 78

3-4-1-6) مخلوط نوكلئوزیدها (dNTPs) 78

3-4-1-7) Taq DNA polymerase. 79

3-4-1-7-1) DNA polymerase Smart 79

3-4-1-8) پرایمرها 79

3-4-1-9) سایز ماركر. 80

3-4-1-10) اتیدیوم بروماید. 81

3-4-1-11) Loading Buffer 81

3-4-1-12) ژل آگاروز 81

3-4-2) مواد لازم برای تهیه TBE 1X.. 82

3-4-2-1) طرز تهیه بافر TBE 1X.. 82

3-4-3) نرم افزارهای مورد استفاده 82

3-9) ژل الكتروفورز محصولات PCR.. 90

3-10) کشت هلیکوباکتر. 91

3-11-1) بررسی میزان IgG هلیکوباکتر پیلوری در سرم خون. 92

3-11-2) شیکر الیزا 95

3-11-3) شوینده الیزا 96

3-11-4) خواننده الیزا 97

3-11-5) مراحل انجام آزمون الیزا که تقریبا در تمام انواع آن مشترک است عبارت است از 98

IgG.. 99

IgG.. 100

فصل چهارم: نتایج.. 102

4-1 ) نتایج مربوط به افراد مورد مطالعه در این پژوهش… 103

4-2) نتایج مربوط به حضور ژن hsp60 در بیماران کله سیستیت مزمن. 114

4-3) نتایج مربوط به حضور ژن hsp60 در بیماران کله سیستیت حاد 116

4-4) نتایج مربوط به حضور ژن hsp60 در مایع صفرا گروه شاهد. 118

4-5) نتایج مربوط به میزان فراوانی نسبی تست IgG هلیکوباکتر. 121

4-6) نتایج مربوط به میزان فراوانی نسبی BMI 127

4-7) نتایج مربوط به ژن 16s rRNA هلیکوباکتر بیلیس… 131

4-8) نتایج مربوط به میزان فراوانی نسبی هلیکوباکتر هپاتیکوس.. 133

4-9) نتایج مربوط به میزان فراوانی نسبی هلیکوباکتر پولوروم 133

4-10) نتایج مربوط به میزان فراوانی نسبی هلیکوباکتر پیلوری، هلیکوباکتر هپاتیکوس، هلیکوباکتر بیلیس و هلیکوباکتر پولوروم در سنگ کیسه صفرا در بیماران کله سیستیت مزمن. 133

4-11) نتایج مربوط به کشت هلیکوباکتر. 133

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری.. 134

پیشنهادات.. 148

منابع. 149

فهرست جداول

جدول 2-1) گزارش سازمان بهداشت جهانی از برآورد بروز، مرگ و میر ، و میزان شیوع انواع سرطان در مردها و زن ها در طول 5 سال[117] 62

جدول 2-2) گزارش سازمان بهداشت جهانی از برآورد بروز، مرگ و میر ، و میزان شیوع انواع سرطان در زن ها در طول 5 سال[117] 63

جدول 2-3) گزارش سازمان بهداشت جهانی از برآورد بروز، مرگ و میر ، و میزان شیوع انواع سرطان در زن ها در طول 5 سال[117] 64

جدول 3-1) نمونه ای از پرسشنامه مورد استفاده در این پژوهش… 70

جدول 3-2) فرم رضایت اخلاق پزشکی مورد تایید کمیته منطقه ای اخلاق پزشکی دانشگاه علوم پزشکی اصفهان برای این تحقیق 71

جدول 3-3) مقادیر مواد لازم برای PCR ژن Hsp60 هلیکوباکتر پیلوری. 83

جدول3-4) برنامه دمایی دستگاه ترموسایکلر برای تکثیر ژن Hsp 60 هلیکوباکتر پیلوری. 83

جدول 3-5) مقادیر مواد لازم برای PCR ژن s rRNA16 هلیکوباکتر پولوروم 85

جدول 3-6) برنامه دمایی دستگاه ترموسایکلر برای تکثیر ژن 16s rRNAهلیکوباکتر پولوروم 85

جدول 3-7) مقادیر مواد لازم برای PCR ژن s rRNA 16هلیکوباکتر بیلیس… 87

جدول 3-8) برنامه دمایی دستگاه ترموسایکلر برای تکثیر ژن 16s rRNA هلیکوباکتر بیلیس… 87

جدول 3-9) مقادیر مواد لازم برای PCR ژن s rRNA16 هلیکوباکتر هپاتیکوس.. 89

جدول 3-10) برنامه دمایی دستگاه ترموسایکلر برای تکثیر ژن s rRNA16هلیکوباکتر هپاتیکوس.. 89

جدول 3-11) مواد مورد نیاز برای ساخت محیط کشت بهینه سازی شده برای رشد فرم کوکوئید هلیکوباکتر پیلوری 92

جدول4-1-1) مقایسه فراوانی نسبی هر دوجنس بیماران کله سیستیت حاد در گروه های سنی مختلف.. 105

جدول4-1-2) مقایسه فراوانی نسبی جنس زن بیماران کله سیستیت حاد در رده های سنی مختلف.. 106

جدول4-1-3) مقایسه فراوانی نسبی جنس مرد بیماران کله سیستیت حاد در رده های سنی مختلف.. 107

جدول 4-1-4) مقایسه فراوانی نسبی هر دوجنس بیماران کله سیستیت مزمن در رده های سنی مختلف.. 108

جدول 4-1-5) مقایسه فراوانی نسبی جنس زن بیماران کله سیستیت مزمن در رده های سنی مختلف.. 109

جدول4-1-6) مقایسه فراوانی نسبی جنس مرد بیماران کله سیستیت مزمن در رده های سنی مختلف.. 110

جدول 4-1-7) مقایسه فراوانی نسبی هر دوجنس گروه شاهد در رده های سنی مختلف.. 111

جدول 4-1-8) مقایسه فراوانی نسبی جنس زن گروه شاهد در ر ده های سنی مختلف.. 112

جدول 4-1-9) مقایسه فراوانی نسبی جنس مرد گروه شاهد در رده های سنی مختلف.. 113

 

فهرست تصاویر

تصویر3-1) –A موقعیت جغرافیایی استان اصفهان در ایران. B- نقشه جخرافیایی استان اصفهان. 69

تصویر3-2) ست جراحی کله سیستکتومی لاپراسکوپیک… 72

تصویر 3-3) دو روش کله سیستکتومی باز و لاپراسکوپیک… 73

تصویر3-4)کلانژیوپانکراتوگرافی برگشتی آندوسکوپیک… 73

فهرست نمودار

نمودار 4-1-1) مقایسه فراوانی نسبی هر دوجنس بیماران کله سیستیت حاد در گروه های سنی مختلف.. 105

نمودار 4-1-2) مقایسه فراوانی نسبی جنس زن بیماران کله سیستیت حاد در رده های سنی مختلف.. 106

نمودار 4-1-3) مقایسه فراوانی نسبی جنس مرد بیماران کله سیستیت حاد در رده های سنی مختلف.. 107

نمودار 4-1-4) مقایسه فراوانی نسبی هر دوجنس بیماران کله سیستیت مزمن در رده های سنی مختلف.. 108

نمودار 4-1-5) مقایسه فراوانی نسبی جنس زن بیماران کله سیستیت مزمن در رده های سنی مختلف.. 109

نمودار 4-1-6) مقایسه فراوانی نسبی جنس مرد بیماران کله سیستیت مزمن در رده های سنی مختلف.. 110

نمودار 4-1-7) مقایسه فراوانی نسبی هر دوجنس گروه شاهد در رده های سنی مختلف.. 111

نمودار 4-1-8) مقایسه فراوانی نسبی جنس زن گروه شاهد در ر ده های سنی مختلف.. 112

نمودار 4-1-9) مقایسه فراوانی نسبی جنس مرد گروه شاهد در رده های سنی مختلف.. 113

نمودار 4-2-1) مقایسه فراوانی نسبی ژن hsp60 هلیکوباکتر پیلوری در مایع صفرا بیماران زن و مرد کله سیستیت مزمن در رده های سنی مختلف.. 114

نمودار 4-2-2) مقایسه فراوانی نسبی ژن hsp60 هلیکوباکتر پیلوری در مایع صفرا بیماران زن کله سیستیت مزمن در رده های سنی مختلف.. 115

نمودار 4-2-3) مقایسه فراوانی نسبی ژن hsp60 هلیکوباکتر پیلوری در مایع صفرا بیماران مرد کله سیستیت مزمن در رده های سنی مختلف.. 115

نمودار 4-3-1) مقایسه فراوانی نسبی ژن hsp60 هلیکوباکتر پیلوری در مایع صفرا بیماران زن و مرد کله سیستیت حاد در رده های سنی مختلف.. 116

نمودار 4-3-2) مقایسه فراوانی نسبی ژن hsp60 هلیکوباکتر پیلوری در مایع صفرا بیماران زن کله سیستیت حاد در رده های سنی مختلف.. 117

نمودار4-3-3) مقایسه فراوانی نسبی ژن hsp60 هلیکوباکتر پیلوری در مایع صفرا بیماران مرد کله سیستیت حاد در رده های سنی مختلف.. 117

نمودار 4-4-1) مقایسه میزان فراوانی نسبی ژن hsp60 هلیکوباکتر پیلوری در هر دو جنس گروه شاهد در رده های سنی مختلف 118

نمودار 4-4-2) مقایسه موارد مثبت hsp60 در مایع صفرا بیماران کله سیتیت مزمن با گروه شاهد در رده های سنی مختلف 119

نمودار 4-4-3) مقایسه موارد مثبت hsp60 در مایع صفرا بیماران کله سیتیت حاد با گروه شاهد در رده های سنی مختلف 119

نمودار 4-4-4) میزان فراوانی نسبی ژن hsp60 هلیکوباکتر پیلوری در بافت کیسه صفرا زنان کله سیستیت حاد در رده های سنی مختلف.. 120

نمودار 4-5-1) میزان فراوانی نسبی نتایج مثبت و منفی تست IgG هلیکوباکتر پیلوری در هر دو جنس بیماران کله سیستیت حاد 121

نمودار 4-5-2) میزان فراوانی نسبی نتایج مثبت و منفی تست IgG هلیکوباکتر پیلوری در زنان بیمار کله سیستیت حاد 122

نمودار 4-5-3) میزان فراوانی نسبی نتایج مثبت و منفی تست IgG هلیکوباکتر پیلوری درمردان بیمار کله سیستیت حاد 122

نمودار 4-5-4) میزان فراوانی نسبی نتایج مثبت و منفی تست IgG هلیکوباکتر پیلوری در هر دو جنس بیماران کله سیستیت مزمن 123

نمودار 4-5-5) میزان فراوانی نسبی نتایج مثبت و منفی تست IgG هلیکوباکتر پیلوری در زنان بیمار کله سیستیت مزمن 123

نمودار 4-5-6) میزان فراوانی نسبی نتایج مثبت و منفی تست IgG هلیکوباکتر پیلوری در مردان بیمار کله سیستیت مزمن 124

نمودار 4-5-7) میزان فراوانی نسبی نتایج مثبت و منفی تست IgG هلیکوباکتر پیلوری در هر دو جنس گروه شاهد 125

نمودار 4-5-8) میزان فراوانی نسبی نتایج مثبت و منفی تست IgG هلیکوباکتر پیلوری در زنان گروه شاهد. 125

نمودار 4-5-9) میزان فراوانی نسبی نتایج مثبت و منفی تست IgG هلیکوباکتر پیلوری در مردان گروه شاهد. 126

نمودار4-6-1) مقایسه میزان فراوانی نسبی دسته های مختلف BMI در هر دو جنس بیمار کله سیستیت مزمن ، در رده های سنی مختلف.. 127

نمودار4-6-2) مقایسه میزان فراوانی نسبی دسته های مختلف BMI زنان بیمار کله سیستیت مزمن ، در رده های سنی مختلف 128

نمودار 4-6-3) مقایسه میزان فراوانی نسبی دسته های مختلف BMI مردان بیمار کله سیستیت مزمن ، در رده های سنی مختلف 128

نمودار 4-6-4) مقایسه میزان فراوانی نسبی دسته های مختلف BMI در هر دو جنس بیمار کله سیستیت حاد ، در رده های سنی مختلف.. 129

نمودار 4-6-5) مقایسه میزان فراوانی نسبی دسته های مختلف BMI زنان بیمار کله سیستیت حاد ، در رده های سنی مختلف 129

نمودار 4-6-6) مقایسه میزان فراوانی نسبی دسته های مختلف BMI مردان بیمار کله سیستیت حاد، در رده های سنی مختلف 130

نمودار 4-7-1) فراوانی نسبی ژن s rRNA16 هلیکوباکتر بیلیس در مایع صفرا بیماران مرد کله سیستیت حاد 131

نمودار 4-7-2) بررسی فراوانی نسبی ژن 16 s rRNA هلیکوباکتر بیلیس در مایع صفرا بیماران زن کله سیستیت مزمن در رده های سنی مختلف.. 132

حجم………………………………………………………………………………………………………………………………………….15

1-5-6- غلظت………………………………………………………………………………………………………………………………………..16

1-6- انواع مرگ سلولی و تعریف آن………………………………………………………………………………………………………18

1-6-1- نکروز…………………………………………………………………………………………………………………………………………18

1-6-2- آپوپتوز سلولی…………………………………………………………………………………………………………………………..18

1-6-2-1 مراحل آپوپتوز ……………………………………………………………………………………………………………………….19

1-6-2-2 مسیر های آپوپتوز………………………………………………………………………………………………………………….21

1-6-2-3- عناصر کلیدی مسیرهای آپوپتوز………………………………………………………………………………………….21

1-6-2-4- روش های بررسی آپوپتوز …………………………………………………………………………………………………..23

1-6-2-4-1- بررسی تغییرات غشاء پلاسمایی در مرگ سول ……………………………………………………………23

1-6-2-4-1-1- تعیین فسفاتیدیل سرین سطح بیرونی غشاء سلول……………………………………………………24

1-6-2-4-2- بررسی سیتوتوکسیسیتی ………………………………………………………………………………………………24

1-6-2-4-3- بررسی تغییرات مورفولوژی …………………………………………………………………………………………..25

1-6-2-4-3-1- استفاده از میکروسکوپ الکترونی………………………………………………………………………………25

1-6-2-4-3-2- استفاده از میکروسکوپ نوری وفلورسانس………………………………………………………………..25

1-7- منشاء آسیب DNA اسپرم…………………………………………………………………………………………………………26

1-7-1- بسته بندی غیرطبیعی كروماتین……………………………………………………………………………………………27

1-8- ساختار کروماتین اسپرم و تأثیر آن بر ناباروری …………………………………………………………………………28

1-8-1- بررسی ساختار کروماتین اسپرم……………………………………………………………………………………………..28

1-9- نقش آپوپتوز در آسیب DNA اسپرم………………………………………………………………………………………..29

1-10- استرس اكسیداتیو به واسطه ROS…………………………………………………………………………………………30

1-11- تاثیر عوامل محیطی برسلامت DNA و میزان موفقیت روشهای کمک باروری…………………..31

1-11-1- مصرف سیگار………………………………………………………………………………………………………………………..31

1-11-2- مواجهات شغلی…………………………………………………………………………………………………………………….32

1-11-3- داروهای شیمی درمانی و رادیوتراپی……………………………………………………………………………………33

1-11-4- سن………………………………………………………………………………………………………………………………………..33

1-12- تكنیك­های بررسی ساختار كروماتین……………………………………………………………………………………….33

1-12-1- روش­های تعیین آسیب DNA اسپرم انسان………………………………………………………………………34

1-12-1-1- تست TUNEL……………………………………………………………………………………………………………….35

1-12-1-2- روش DBD-FISH………………………………………………………………………………………………………..35

1-12-1-3- روش Comet…………………………………………………………………………………………………………………..36

1-12-1-4- رنگ­آمیزی CMA3…………………………………………………………………………………………………………36

1-12-1-5- تكنیك SCSA………………………………………………………………………………………………………………..37

1-12-1-6- تست SCD……………………………………………………………………………………………………………………..37

1-12-1-7- رنگ­آمیزی آكریدین اورانژ………………………………………………………………………………………………..39

1-12-1-8- رنگ­­آمیزی تولوئیدین بلو………………………………………………………………………………………………….39

1-13- روش مهاجرت اسپرم………………………………………………………………………………………………………………….39

1-14- روش سانتریفیوژ شیب غلظت…………………………………………………………………………………………………….40

فصل دوم- مواد و روش ها………………………………………………………………………………………………………………………41

2-1- مواد و وسایل مورد نیاز…………………………………………………………………………………………………………………42

2-1-1- وسایل مورد نیاز………………………………………………………………………………………………………………………….42

2-1-2- مواد مورد نیاز……………………………………………………………………………………………………………………………..42

2-2- ساخت محلول های مورد نیاز…………………………………………………………………………………………………………45

2-2-1- ساخت محلول Ham’s F10…………………………………………………………………………………………………….45

2-2-2- محلول های لازم برای تست پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)…………………………………………..46

2-2-3- ساخت محلول تانل……………………………………………………………………………………………………………………..46

2-2-4- ساخت محلول (PBS)……………………………………………………………………………………………………………….46

2-2-5- ساخت رنگ ائوزین-نیگروزین…………………………………………………………………………………………………….47

2-2-6- ساخت رنگ رایت………………………………………………………………………………………………………………………..47

2-3- روشها………………………………………………………………………………………………………………………………………………..48

2-3-1- روش جمع آوری اسپرم…………………………………………………………………………………………………………….. 48

2-3-2- آنالیز مایع انزالی………………………………………………………………………………………………………………………… 48

2-3-2-1- آزمایشات ماکروسکوپی…………………………………………………………………………………………………………..48

2-3-2-1-1- ظاهر………………………………………………………………………………………………………………………………….48

2-3-2-1-2- آبکی کردن…………………………………………………………………………………………………………………………48

2-3-2-1-3- حجم………………………………………………………………………………………………………………………………….48

2-3-2-1-4- چسبندگی…………………………………………………………………………………………………………………………48

2-3-2-2- آزمایشات میکروسکوپی………………………………………………………………………………………………………….49

2-3-2-2-1- آگلوتیناسیون……………………………………………………………………………………………………………………..50

2-3-2-2-2- بررسی تعداد اسپرم…………………………………………………………………………………………………………..50

2-3-2-2-2-1- روش استفاده از MAKLER CHAMBER برای شمارش ………………………………………..50

2-3-2-2-3- ارزیابی تحرک……………………………………………………………………………………………………………………51

2-3-2-2-3-1- روش کار……………………………………………………………………………………………………………………….52

2-3-2-2-4- ارزیابی قابلیت حیات…………………………………………………………………………………………………………53

2-3-2-2-4-1- روش کار رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین………………………………………………………………………53

2-3-2-2-5- ارزیابی مورفولوژی………………………………………………………………………………………………………………54

2-3-2-2-5-1- رنگ آمیزی پاپانیکولا……………………………………………………………………………………………………54

2-3-2-2-5-2- روش فیکس کردن………………………………………………………………………………………………………..54

2-3-2-2-5-3-روش رنگ آمیزی پاپانیکولا……………………………………………………………………………………………55

2-3-3- Direct swim-up………………………………………………………………………………………………………………………57

2-3-3-1- روش کار………………………………………………………………………………………………………………………………….57

2-3-4- تست بررسی میزان پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)……………………………………………………………58

2-3-4-1- روش کار…………………………………………………………………………………………………………………………………58

2-3-5- روش رنگ آمیزی تانل…………………………………………………………………………………………………………………60

2-3-6- آنالیز آماری………………………………………………………………………………………………………………………………….62

فصل سوم- نتایج………………………………………………………………………………………………………………………………………..63

3-1 نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی تحرک اسپرم………………………………64

3-2- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قابلیت حیات اسپرم………………….67

3-3- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی مورفولوژی اسپرم……………………..68

3-4- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….70

3-5- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم………………………………………………………………………………….72

3-6- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی آپوپتوز اسپرم………………………………………………………………………………………………………………75

3-7- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم……………………………………78

3-8- رابطه میزان آپوپتوز اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم…………………………………………………………………..79

3-9- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با میزان آپوپتوز اسپرم…………………………………………..80

3-10- نتایج کلی……………………………………………………………………………………………………………………………………80

فصل چهارم- بحث………………………………………………………………………………………………………………………………….81

4-1- تا ثیر روش آماده سازی Dricct Swim up بر روی پارامترهای اسپرم………………………………………83

4-2- تاثیر زمان های مختلف انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد بر روی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم…………………………………………………………………………………………………………………..84

4-3- پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………….90

منابع

چکیده انگلیسی

فهرست شکل ها

عنوان صحنه

1-1- ساختار اسپرم انسانی……………………………………………………………………………………………………………………..9

1-2- ارزیابی آسیب DNA توسط: …………..…………….…A.TUNEL, B.COMET, C.CMA337

1-3- تست SCD………………………………………………………………………………………………………………………………….38

2-1- انواع مختلف آگلوتیناسیون…………………………………………………………………………………………………………..50

2-2- MAKLER CHAMBERبرای شمارش اسپرم استفاده می شود………………………………………………51

2 -3- شکل لامل MAKLER CHAMBER …………………………………………………………………………………….52

2-4- چگونگی قرارگیری لوله فالکون بازاویه 45 درجه در انکوباتور…………………………………………………….57

3-1- رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین برای سنجش میزان زنده یا مرده بودن اسپرم…………………………….67

3-2- رنگ آمیزی پاپانیکولا ………………………………………………………………………………………………………………….69

3-3- تست SCD برای بررسی میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم میباشد……………………………………74

3-4- رنگ آمیزی TUNEL………………………………………………………………………………………………………………….76

فهرست جدول ها

عنوان صفحه

1-1 : خصوصیات میکرسکوپی نمونه انزال طبیعی مطابق با استاندارد های سازمان بهداشت جهانی (2010/WHO)…………………………………………………………………………………………………………………………………….17

2-1- ساخت Ham’sf10……………………………………………………………………………………………………………………..45

2-2- محلول های لازم برای رنگ آمیزی پاپانیکولا………………………………………………………………………………55

3-1-مقایسه پارامترهای اسپرمی قبل و بعد از آماده سازی اسپرم ……………………………………………………..71

3-2-مقایسه میانگین اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قطعه قطعه شدن DNA آپوپتوز اسپرم……………………………………..77

3-3-مقایسه مقدار P اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم…………………………………..77

پایان…………………………………………………………………………………………………………………………………….. 7

1-3-3 رنگ در ناجور پایان ………………………………………………………………………………………………………………………………… 7

1-3-4 تولید مثل ناجورپایان ……………………………………………………………………………………………………………………………….. 8

1-3-5 حرکت ناجور پایان ……………………………………………………………………………………………………………………………….. 10

1-3-6 تغذیه ناجور پایان ………………………………………………………………………………………………………………………………….. 10

1-4 کلید شناسایی ……………………………………………………………………………………………………………………………………………. 11

1-4-1 کلید شناسایی جنس……………………………………………………………………………………………………………………………….. 11

1-4-2 کلید شناسایی زیر جنس ………………………………………………………………………………………………………………………… 11

1-4-3 کلید شناسایی گونه…………………………………………………………………………………………………………………………………. 12

1-5 بر پژوهش های انجام شده……………………………………………………………………………………………………………….. 12

1-5-1 پژوهش های صورت گرفته در ایران………………………………………………………………………………………………………… 12

1-5-2 پژوهش های صورت گرفته در دیگر کشور ها…………………………………………………………………………………………… 13

1-9 فرضیه های پژوهش…………………………………………………………………………………………………………………………………….. 15

1-10 اهداف پژوهش………………………………………………………………………………………………………………………………………… 15

فصل دوم: مواد و روش ها…………………………………………………………………………………………………………………………………. 16

2-1 نمونه برداری …………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 17

2-2 روش نمونه برداری ……………………………………………………………………………………………………………………………………. 18

2-3 مطالعات صورت گرفته ………………………………………………………………………………………………………………………………. 19

2-3-1 روش شناسایی گونه ………………………………………………………………………………………………………………………………. 19

2-3-2 روش اندازه گیری طول گاماروس ها ………………………………………………………………………………………………………. 20

2-3-3 روش اندازه گیری وزن …………………………………………………………………………………………………………………………. 20

2-3-4 روش تشخیص جنسیت گونه ها …………………………………………………………………………………………………………….. 21

2-3-5 روش شمارش تعداد تخم ها و نوزادان گاماروس …………………………………………………………………………………….. 26

فصل سوم نتایج…………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 28

نتایج حاصل از ایستگاه های مختلف ……………………………………………………………………………………………………………………. 30

3-1 ایستگاه شماره 1 ( ساحل دانشگاه) …………………………………………………………………………………………………………….. 30

3-2 ایستگاه شماره 2 ( ساحل سنگی) ………………………………………………………………………………………………………………. 32

3-3 ایستگاه شماره 3 ( پارکینگ 1) ………………………………………………………………………………………………………………….. 34

3-4 ایستگاه شماره 4 ( پارکینگ 3) ………………………………………………………………………………………………………………….. 36

3-5 ایستگاه شماره 5( پارکینگ 5) …………………………………………………………………………………………………………………… 38

3-6 ایستگاه شماره 6( پارکینگ 6) …………………………………………………………………………………………………………………… 40

3-7 ایستگاه شماره 7 ( شازده رودخانه) ……………………………………………………………………………………………………………. 42

3-8 ایستگاه شماره 8 (دریاکنار) ……………………………………………………………………………………………………………………….. 44

3-9 ایستگاه شماره 9 ( خزرشهر) …………………………………………………………………………………………………………………….. 46

3-10 ایستگاه شماره 10( پارک لاله) ………………………………………………………………………………………………………………… 48

3-11 فراوانی گاماروس در ماه ها و ایستگاه های مختلف …………………………………………………………………………………….. 48

3-12 طول و وزن گاماروس ………………………………………………………………………………………………………………………………. 52

3-13 رابطه بین طول و وزن گاماروس ………………………………………………………………………………………………………………… 54

3-14 توزیع فراوانی گاماروس های جفت شده در ایستگاها و ماه های مختلف سال………………………………………………. 55

3-15 هم آوری (تعداد تخم) گاماروس در ایستگاه ها و ماه های مختلف………………………………………………………………. 57

3-16 توزیع فراوانی نسبت جنسی گاماروس در ایستگاه ها و ماه های مختلف ……………………………………………………. 59

3-17 توزیع فراوانی نسبی گاماروس های بالغ و نابالغ در ایستگاه ها و ماه های مختلف………………………………………….. 60

3-18 پارامترهای محیطی و همسبتگی آنها با فراوانی گاماروس ……………………………………………………………………………. 61

فصل چهارم بحث و نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………………………………. 64

4-1 بحث ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 65

4-2 نتیجه گیری نهایی ……………………………………………………………………………………………………………………………………… 69

4-3 پیشنهادات ………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 69

منابع و مآخذ …………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 71

منابع فارسی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 71

منابع انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 73

ضمائم………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..77

Abstract…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………78

فهرست شکل ها

عنوان صفحه

شکل1-3-1Maera danaea…………………………………………………………………………………………………………………………….. 5

شکل1-3-2Echinogammarus apfelbecki…………………………………………………………………………………………………… 5

شکل1-3-3 نمای جا نبی یک ناجور پا قسمت بالا،به همراه قطعات پاهای سینه ای قسمت پایین …………………………….. 6

شکل1-3-4 نمای جانبی یک ناجور پا …………………………………………………………………………………………………………………… 6

شکل1-3-4-1 نمای جانبی از یک جفتHyalella azteca..…………………………………………………………………………….. 9

شکل1-3-4-2 نمای جانبی از نزدیکی یک جفتMelita nitida………………………………………………………………………….. 9

شکل1-3-4-3 نمای جانبی از نزدیکی یک جفت ازGammarus sp.………………………………………………………………….. 9

شکل2-1-1 نمایی از ده ایستگاه نمونه برداری گاماروسها در سواحل (از بابلسرتا فریدون کنار)…………………………….. 17

شکل2-2-1 کوادرات ، بیلچه، الک با چشمه یک میلیمتر ……………………………………………………………………………………. 18

شکل2-2-2 اندازه گیری دمای ماسه با دماسنج جیوه ای……………………………………………………………………………………… 18

شکل2-2-3 اندازه گیری دمای آب …………………………………………………………………………………………………………………… 18

شکل2-2-4 اندازه گیری دمای هوا ……………………………………………………………………………………………………………………. 18

شکل2-2-5 نمونه های گرفته شده از ساحل ………………………………………………………………………………………………………. 19

شکل2-2-6 وسایل برای نگه داشتن نمونه ها و خارج کردن تخم ها …………………………………………………………………… 19

شکل2-2-7 نمایی از استریو میکروسکوپ …………………………………………………………………………………………………….. 19

شکل2-3-1 اندازه گیری نمونه ها توسط خط کش………………………………………………………………………………………………. 20

شکل2-3-2 وزن کردن نمونه ها با ترازوی دیجیتال 001/0………………………………………………………………………………… 21

شکل 2-3-4-1 وجود فرو رفتگی بین بندهای 5 و 6 از نمای کناری …………………………………………………………………. 21

شکل 2-3-4-2 وجود فرو رفتگی بین بندهای 5 و 6 از نمای بالا ………………………………………………………………………. 21

شکل 2-3-4-3 ماده پونتو گاماروس مائوتیکوس به همرا پنج تخم آن …………………………………………………………………. 22

شکل 2-3-4-4 لارو پونتو گاماروس مائوتیکوس ……………………………………………………………………………………………….. 22

شکل 2-3-4-5 ویژگیهای تاکسونومیک گاماروس ماده………………………………………………………………………………………… 23 ……………………………………………………………………………………………………………………………………

شکل 2-3-4-6 ویژگیهای تاکسونومیک گاماروس نر…………………………………………………………………………………………. 25

شکل 2-3-4-7 پونتو گاماروس مائو تیکوس و تورم قسمت سینه ای آن………………………………………………………………. 25

شکل 2-3-5-1 تصویری از کیسه تخمی به همراه تخم های آن ………………………………………………………………………….. 26

شکل 2-3-5-2 وسایل برای نگه داشتن نمونه ها و خارج کردن تخم ها………………………………………………………………. 26

شکل 3-11-1 توزیع مکانی (ایستگاهی) و زمانی تعداد گاماروس های شمارش شده……………………………………………… 50

شکل 3-11-2 توزیع فراوانی نسبی (درصد) گاماروس های شمارش شده در ایستگاه های مختلف …………………………….. 51

شکل 3-11-3 توزیع فراوانی نسبی (درصد) گاماروس های شمارش شده در ماه های مختلف …………………………………… 51

شکل 3-13-1 رابطه بین طول و وزن گاماروس در سواحل استان مازندران……………………………………………………………. 54

شکل 3-13-2 رابطه بین طول و وزن گاماروس در جنس نر در سواحل استان مازندران………………………………………….. 54

شکل 3-13-3 رابطه بین طول و وزن گاماروس در جنس ماده در سواحل استان مازندران………………………………………. 55

شکل 3-14-1 توزیع فراوانی نسبت گاماروس های جفت شده …………………………………………………………………………….. 56

شکل 3-14-2 توزیع فراوانی نسبت گاماروس های جفت شده به تعداد کل……………………………………………………………. 56

شکل 3-15-1 میانگین هم آوری (تعداد تخم) گاماروس در ایستگاه های مختلف از بابلسر تا فریدون کنار………………. 57

شکل 3-15-2 میانگین همآوری (تعداد تخم) گاماروس در ماه های مختلف از بابلسر تا فریدون کنار……………………….. 58

شکل 3-15-3 رابطه بین طول گاماروس و میانگین تعداد در کلاسه های طولی مختلف…………………………………………… 58

شکل 3-16-1 توزیع فراوانی نر ، ماده ، در ایستگاه های مختلف از بابلسر تا فریدون کنار……………………………………… 59

شکل 3-16-2 توزیع فراوانی نر ، ماده ، در ماه های مختلف از بابلسر تا فریدون کنار……………………………………………. 59

شکل 3-17-1 توزیع فراوانی نسبی گاماروسهای بالغ و نابالغ در ایستگاه های مختلف از بابلسر تا فریدون کنار………….. 60

شکل 3-17-2 توزیع فراوانی بالغ ونابالغ در ماه های مختلف از بابلسر تا فریدون کنار…………………………………………… 61

شکل 3-18-1 میانگین (± انحراف معیار) دمای آب و هوا و ماسه در ماه های مختلف……………………………………………. 62

شکل 3-18-2 میانگین (± انحراف معیار) تغییرات pH ودانسیته در ماه های مختلف…………………………………………….. 63

فهرست جدول ها

عنوان صفحه

جدول 2-1-1 مختصات جغرافیایی ایستگاه های نمونه برداری شده……………………………………………………………………… 17

جدول3-1 ایستگاه شماره 1 ( ساحل دانشگاه)…………………………………………………………………………………………………….. 31

جدول3-2 ایستگاه شماره 2 ( ساحل سنگی)………………………………………………………………………………………………………. 33

4-1- فسفوفروکتوکیناز 1(PFK-1):—————- 9

5-1- ضرورت و اهداف تحقیق :- 13

فصل دوم: بر منابع

1-2- اثرات ضد دیابتی گیاهان– 16

1-1-2- انار-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 17

2-1-2-مكانیسم اثر انار در دیابت:————— 17

2-1-2- سیر—————- 19

2-2- اثر گیاه برفعالیت وبیان ژن—————- 21

فصل سوم: مواد و روشها

1-3- موادو روشها———— 25

2-3- تهیه عصارههیدروالکلیبرگ گیاه جغجغه—- 27

3-3- حیوانات آزمایشگاهی—– 28

1-3-3- نحوه گروهبندی:—— 28

2-3-3- روش القای دیابت تجربی:————— 29

3-3-3- اندازه گیری قند و وزن موشها:———– 29

4-3-3- مراحل انجام تشریح:— 29

4-3- بررسی بیان ژن———- 31

1-4-3- مشخصات توالی ژنPFK-1————- 31

2-4-3- طراحی پرایمرها—— 35

3-4-3- آماده سازی پرایمر—– 35

5-3- استخراج RNA:——— 36

1-5-3- استخراج RNA از نمونه های تازه کبد توسط کیت Geneall Hybrid Rtm—— 36

1-5-3- بررسی کمیت و کیفیت RNA استخراج شدهبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————- 38

6-3- سنتز cDNA———– 39

1-6-3- سنتز cDNA توسط کیتThermo SCIENTIFICبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——— 39

7-3- واکنش های PCR——- 41

1-7-3 – PCR شیب دمایی—- 41

2-7-3- PCR معمولی——– 43

8-3- الکترفورز————— 45

1-8-3 – مواد مورد نیازجهت تهیه ژل الکتروفورز—- 45

1-1-8-3- آگارز————- 45

2-1-8-3- اتیدیوم بروماید—– 46

3-1-8-3- لودینگ بافر——– 46

4-1-8-3-طرز تهیه محلول Tris-Hcl———— 46

4-1-8-3- شناساگرهای اندازهDNA————- 47

9-3- روش کار با ژل الکترفورز– 47

10-3- رسم منحنی استاندارد:– 48

10-3- واکنش Real-Time PCR—————- 48

11-3- Threshold و مقدار CT:- 50

12-3- تعیین توالی محصولات (Direct Sequencing) PCRبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——– 51

10-2-3- آنالیز بیان ژن——- 52

13-3- تجزیه وتحلیل داده ها— 52

فصل چهارم: نتایج و بحث

1-4- جمع آوری نمونه :——- 54

2-4- بررسی نتایج وزن موشهای مورد مطالعه—— 54

3-4- بررسی نتایج گلوکز ناشتای سرم موشهای مورد مطالعهبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——— 56

5-4- نتایج استخراج RNA:—- 57

6-4- نتایج حاصل ازساخت cDNA بر روی ژل آگاروزبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————– 59

7-4- نتایج تعیین غلظت و کیفیت RNA توسط اسپکتروفتومتریبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد— 61

1-7-4- نتایج مربوط به PCR شیب دمایی——- 61

8-4- نتایج منحنی استاندارد—- 62

1-8-4- منحنی استاندارد ژنTBP————– 63

2-8-4-منحنی استاندارد ژنPFK-1————- 63

9-4- نتایج واكنش Real Time PCR———— 64

1-9-4- تکثیر ژنPFK——– 65

2-9-4-تکثیر ژن TBP——– 66

10-4- ارزیابی کارایی تکثیر ژنهای مور مطالعه از طریق آنالیز منحنی ذوب:———— 66

1-10-4- منحنی تغییرات ذوب بر حسب دمای ژنPFKبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———- 67

2-10-4-منحنی تغییرات ذوب بر حسب دمای ژن TBPبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———— 67

11-4- آنالیز منحنی ذوب ژنPFK————- 68

12-4-آنالیز منحنی ذوب ژن TBP————— 68

13-4- نتایج حاصل از Real timePCR ژنPFK 1بر روی ژل آگارزبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد– 70

14-4- نتایج بررسی بیان ژنPK—————- 70

15-4- بحث:—————- 71

16-4- پیشنهادات———— 73

منابع:-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—— 75

جدول1-3- تجهیزات و دستگاهها……………………………………………………………………………………………….. 26

جدول 2-3 پرایمرهای طراحی شده…………………………………………………………………………………………… 35

جدول3-3- لیست اجزای کیت استخراج RNA……………………………………………………………………….. 36

جدول 4-3 موادلازم برای PCR………………………………………………………………………………………………….. 42

جدول 5-3 برنامه PCR شیب دمایی برای تکثیر قطعه حاصل ازTBP…………………………………. 42

جدول 6-3 برنامه PCR شیب دمایی برای تکثیر قطعه حاصل ازPFK-1…………………………… 43

جدول7-3 مواد مورد نیاز برای تهیه بافر Tris-Hcl……………………………………………………………………. 47

جدول8-3 مواد و میزان مورد نیاز برای یک واکنش در Real-Time PCR…………………………….. 49

جدول9-3 مراحل، دما و زمان مربوطه در یک واکنش Real- time PCR برای ژنTBP……… 50

جدول10-3- شرایط دمایی و زمانی واکنش Real time PCR برای ژنPFK-1………………….. 50

شکل 1-1- محل قرارگرفتن فسفوفروکتوکیناز 1 در کروموزوم شماره 21 انسان…………………. 10

شکل2-1- فروکتوز 2-6 بی فسفات مهمترین فعال کننده آنزیم فسفوفروکتوکیناز 1…………. 11

شکل3-1- مراحل گلیکولیز…………………………………………………………………………………………………………. 12

شکل 1-3- نحوه گاواژ دادن عصاره…………………………………………………………………………………………….. 28

شکل 2-3- تشریح موشها…………………………………………………………………………………………………………… 30

شکل 3-3- توالی ژنpfk-1…………………………………………………………………………………………………………. 34

شکل 4-3- دستگاه اسپکتوفتومتری…………………………………………………………………………………………… 39

شکل 5-3 دستگاه PCR (Eppendorf –mastercyc gradient)…………………………………………….. 44

شکل 6-3 دستگاه الکتروفورز وعکس ژل…………………………………………………………………………………… 48

شکل 7-3 دستگاه Real-Time PCR…………………………………………………………………………………………. 49

شکل 1-4- فراوانی موشهای مورد مطالعه………………………………………………………………………………….. 54

شکل 2-4- اثر مصرف عصاره هیدروالکلی برگ گیاه جغجغه بر وزن موشهای صحرایی……….. 55

شکل 3-4- اثر مصرف عصاره هیدروالکلی برگ گیاه جغجغه بر گلوکز ناشتای موشهای صحرایی 57

شکل 5-4- نتایج استخراج Total RNA……………………………………………………………………………………. 59

شکل 6-4- تکثیر قطعه (bp190)مربوط به ژنPFK…………………………………………………………… 60

1-14) اریترومایسین، ساختمان و ویژگی ها…………………………………………………………………………………………………30

1-15) تاریخچه تولید اریترومایسین……………………………………………………………………………………………………………..31

1-16) نام ها و فرمول شیمیایی اریترومایسین……………………………………………………………………………………………..32

1-17) مکانیسم عمل اریترومایسین………………………………………………………………………………………………………………32

1-18) فعالیت ضد میکروبی اریترومایسین……………………………………………………………………………………………………33

1-19) فارماکوکینتیک…………………………………………………………………………………………………………………………………..34

1-20) مصارف بالینی اریترومایسین………………………………………………………………………………………………………………34

1-21) عوارض جانبی اریترومایسین………………………………………………………………………………………………………………35

1-22) اشکال دارویی اریترومایسین………………………………………………………………………………………………………………36

1-23) آنتی بیوتیک های مشتق شده از اریترومایسین………………………………………………………………………………..36

1-24) مراحل کلیدی فرآیند تولید آنتی بیوتیک ها از جمله اریترومایسین……………………………………………….38

1-24-1) حفظ و نگهداری کشت فعال…………………………………………………………………………………………………………39

1-24-2) تهیه مایه تلقیح به فرم سوسپانسیون اسپوری و توسعه آن………………………………………………………….44

1-24-3) مرحله پیش کشت یا بذردهی یا seeding ………………………………………………………………………………..45

1-24-4) مرحله تخمیر یا Fermentation ………………………………………………………………………………………………47

1-24-4-1) تکنولوژی تخمیر آنتی بیوتیک………………………………………………………………………………………………….48

1-24-4-1-1) تخمیر شیک فلاسک…………………………………………………………………………………………………………….48

1-24-4-1-2) فرمانتورهای همزن دار………………………………………………………………………………………………………….49

1-24-4-2) بررسی تأثیر عوامل مختلف برروی تخمیر و تولید آنتی بیوتیک ها از جمله اریترومایسین……50

1-24-4-2-1) تأثیر محیط کشت تخمیر و ترکیبات مورد استفاده در آن………………………………………………….50

1-24-4-2-1-1) منابع کربنی……………………………………………………………………………………………………………………..51

1-24-4-2-1-2) منابع نیتروژنی………………………………………………………………………………………………………………….55

1-24-4-2-1-3) آب…………………………………………………………………………………………………………………………………….57

1-24-4-2-1-4) مواد معدنی……………………………………………………………………………………………………………………….57

1-24-4-2-1-5) مواد مغذی پیچیده…………………………………………………………………………………………………………..59

1-24-4-2-1-6) ویتامین ها و فاکتورهای رشد………………………………………………………………………………………….61

1-24-4-2-1-7) پیش ماده ها…………………………………………………………………………………………………………………….61

1-24-4-2-1-8) القا کننده ها و تحریک کننده ها…………………………………………………………………………………….61

1-24-4-2-2) تأثیر pH………………………………………………………………………………………………………………………………62

1-24-4-2-3) تأثیر دما………………………………………………………………………………………………………………………………..64

1-24-4-2-4) تأثیر هوادهی…………………………………………………………………………………………………………………………67

1-24-4-2-5) تأثیر هم زدن………………………………………………………………………………………………………………………..68

1-24-4-2-6) تأثیر دی اکسید کربن…………………………………………………………………………………………………………..71

1-24-4-2-7) تأثیر کف……………………………………………………………………………………………………………………………….71

1-24-4-2-8) تأثیر استریلیزاسیون……………………………………………………………………………………………………………..73

1-24-4-2-9) تأثیر ویسکوزیته……………………………………………………………………………………………………………………74

1-24-4-2-10) تأثیراریترومایسین تولید شده…………………………………………………………………………………………….76

1-24-5) برداشت و خالص سازی محصول…………………………………………………………………………………………………..77

1-25) سویا و علت انتخاب آن به عنوان منبع نیتروژنی بومی……………………………………………………………………..79

1-25-1) علل انتخاب سویا و توسعه کشت آن……………………………………………………………………………………………..79

1-25-2) تاریخچه سویا…………………………………………………………………………………………………………………………………80

1-25-3) تولید و مصرف جهانی سویا……………………………………………………………………………………………………………81

1-25-4) سویا در ایران………………………………………………………………………………………………………………………………….82

1-25-5) اجزای ترکیبی سویا……………………………………………………………………………………………………………………….82

1-25-6) کنجاله سویا……………………………………………………………………………………………………………………………………83

1-26) کلزا و علت انتخاب آن به عنوان منبع نیتروژنی بومی……………………………………………………………………….83

1-26-1) علل عمده انتخاب کلزا و توسعه کشت آن…………………………………………………………………………………….84

1-26-2) تاریخچه کلزا…………………………………………………………………………………………………………………………………..85

1-26-3) تولید جهانی کلزا…………………………………………………………………………………………………………………………….86

1-26-4) اجزای ترکیبی کلزا…………………………………………………………………………………………………………………………86

فصل دوم : بر متون گذشته

2-1) پیشینه پژوهش……………………………………………………………………………………………………………………………………..88

فصل سوم : مواد و روش ها

3-1) روش گردآوری اطلاعات و انجام پژوهش……………………………………………………………………………………………..93

3-2) سویه باکتری مورد استفاده در پژوهش………………………………………………………………………………………………..93

3-3) معرفی رنگ های مورد استفاده…………………………………………………………………………………………………………….94

3-4) محیط های کشت مورد استفاده……………………………………………………………………………………………………………95

3-4-1) محیط کشت اسپورزایی……………………………………………………………………………………………………………………95

3-4-1-1) تهیه سوسپانسیون اسپوری………………………………………………………………………………………………………….98

3-4-2) محیط کشت مرحله بذردهی( پیش کشت_ seeding)……………………………………………………………99

3-4-2-1) انتخاب بهترین ارلن در مرحله بذردهی…………………………………………………………………………………….100

3-4-3) محیط کشت مرحله تخمیر…………………………………………………………………………………………………………….104

3-4-3-1) غلظت های کنجاله سویا و کنجاله کلزا مورد استفاده شده در محیط تخمیر………………… ……..105

3-5) نمونه گیری………………………………………………………………………………………………………………………………………….106

3-6) سنجش اریترومایسین تولید شده……………………………………………………………………………………………………….106

3-6-1) تهیه بافر کربنات بی کربنات با pH 6/9 ………………………………………………………………………………………107

3-6-2) تهیه بافر با pH 6/9 اشباع از کلروفرم و کلروفرم اشباع از بافرpH 6/9 ……………………………………..108

3-6-3) تهیه بافر سیترات_فسفات با pH 2/4…………………………………………………………………………………………..108

3-6-4) تهیه محلول بروموفنل بلو……………………………………………………………………………………………………………….108

3-6-5) تهیه محلول های استاندارد اریترومایسین……………………………………………………………………………………..109

3-6-6) استخراج اریترومایسین از مایع تخمیر با استفاده از کلروفرم…………………………………………………………111

3-6-7) تشکیل کمپلکس رنگی اریترومایسین و بروموفنل بلو…………………………………………………………………..112

3-6-8) اندازه گیری میزان جذب کمپلکس رنگی اریترومایسین و بروموفنل بلو……………………………………..113

3-7) محیط کشت پایه سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین………………………………………………………………….113

3-7-1) محیط کشت مولر هینتون آگار………………………………………………………………………………………………………113

3-7-2) محیط کشت مولر هینتون براث……………………………………………………………………………………………………..114

3-7-3) استخراج اریترومایسین از محیط کشت تخمیر……………………………………………………………………………..114

3-7-4) سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین…………………………………………………………………………………………..114

3-7-5) تهیه مایع تلقیح………………………………………………………………………………………………………………………………115

3-7-6) تهیه چاهک…………………………………………………………………………………………………………………………………….116

3-7-7) تهیه بافر فسفات با pH 8………………………………………………………………………………………………………………116

3-7-8) تهیه محلول های استاندارد…………………………………………………………………………………………………………….116

3-7-9) افزودن محلول های آنتی بیوتیک در پلیت ها……………………………………………………………………………….117

3-7-10) اندازه گیری قطر هاله مهار رشد…………………………………………………………………………………………………..117

3-7-11) رسم منحنی استاندارد………………………………………………………………………………………………………………….117

3-8) سنجش غلظت اریترومایسین به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا…………………………………………..118

3-8-1) فاز متحرک……………………………………………………………………………………………………………………………………..118

3-8-2) آماده سازی مایع تخمیر…………………………………………………………………………………………………………………118

3-8-3) اندازه گیری مقداراریترومایسین……………………………………………………………………………………………………..119

3-9) کروماتوگرافی لایه نازک TLC …………………………………………………………………………………………………………119

فصل چهارم: نتایج پژوهش

4-1) بررسی اثر کنجاله سویا بر رشدSaccharopolyspora erythraeaو تولید اریترومایسین ( محیط شاهد )…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..123

4-1-1) اثر کنجاله سویا در pH محیط کشت تولید اریترومایسین (کنترل)…………………………………………….123

4-1-2) اثر کنجاله سویا بر درصد بیومس تولید شده (کنترل)…………………………………………………………………..124

4-1-3) اثر کنجاله سویا در میزان تولید اریترومایسین ( کنترل)………………………………………………………………125

4-1-4) بررسی اثر کنجاله سویا بر روی مورفولوژیSaccharopolyspora erythraea(کنترل)…..125

4-2) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر تولید اریترومایسین……………………………………………….128

4-2-1) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر pH محیط کشت……………………………………………..129

4-2-2) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر بیومس تولیدی…………………………………………………130

4-2-3) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر میزان اریترومایسین تولیدی…………………………….130

4-3) غلظت بهینه ترکیب کنجاله سویا و کلزا برای محیط کشت تولید اریترومایسین……………………………..131

4-4) اثر ترکیب کنجاله سویا با غلظت بهینه 15 گرم در لیتر و کنجاله کلزا با غلظت بهینه 15 گرم در لیتر بر روی پارامترهای مورد بررسی درتخمیر……………………………………………………………………………………………………132

4-4-1) بررسی اثر غلظت بهینه در میزان تولید اریترومایسین…………………………………………………………………..132

4-4-2) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی pH محیط کشت تخمیر…………………………………………………………….133

4-4-3) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی درصد بیومس تولیدی…………………………………………………………………133

4-4-4) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی مورفولوژیSaccharopolyspora erythraea…………………134

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

5-1) تأثیر مواد تشکیل دهنده و ترکیبات به کار رفته در محیط کشت تخمیر در تولید آنتی بیوتیک…..137

5-1-1) اثر منابع نیتروژنی در تولید اریترومایسین…………………………………………………………………………………..137

5-1-1-1) مقایسه اثر غلظت های مختلف ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا به عنوان منبع نیتروژنی در تولید اریترومایسین……………………………………………………………………………………………………………………………………..138

5-2) همزمانی رشدSaccharopolyspora erythraeaو تولید اریترومایسین……………………………….144

5-3) رابطه بین میزان رشد باکتری و تغییرات بیومس در طول فرآیند…………………………………………………….145

5-3-1) سینتیک رشد میکروبی………………………………………………………………………………………………………………….146

5-4) رابطه بین منبع نیتروژنی استفاده شده در این پژوهش و pH محیط کشت تخمیر………………………..148

5-5) رابطه بین مورفولوژی سویه مولد و تولید اریترومایسین…………………………………………………………………….149

5-6) برآورد هزینه ها……………………………………………………………………………………………………………………………………153

5-6-1) محاسبه میزان اریترومایسین تولیدی و قیمت تمام شده منبع نیتروژنی مورد استفاده در آن در هر Batch صنعتی……………………………………………………………………………………………………………………………………………..153

5-6-1-1) استفاده از 30 گرم در لیتر کنجاله سویا (محیط کنترل) در تخمیر…………………………………………154

5-6-1-2) استفاده از ترکیب 15 گرم در لیتر کنجاله سویا و 15 گرم در لیتر کنجاله کلزا……………………..154

5-7) پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………………..156

منابع و مراجع…………………………………………………………………………………………………………………..158

خلاصه انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………….165

ضمائم …………………………………………………………………………………………………………………………….166

 

عنوان فهرست جداول صفحه

(جدول 1-1) گروه های میکروبی تولید کننده آنتی بیوتیک………………………………………………………………………..14

(جدول 1-2) برخی آنتی بیوتیک های مهم و مکانیسم عمل آنها………………………………………………………………..23

(جدول 1-3) مواد معدنی به کار رفته در محیط کشت…………………………………………………………………………………60

(جدول 1-4) محدوده دمایی رشد میکروارگانیسم های مختلف…………………………………………………………………..64

(جدول 1-5) تأثیر دی اکسید کربن بر تولید سیزومیسین در طی فرآیند تخمیر……………………………………….71

(جدول 3-1) محیط کشت اسپورزایی ISP medium 2…………………………………………………………………………..95

(جدول 3-2) محیط کشت اسپورزایی CSL ……………………………………………………………………………………………….96

(جدول3-3) ترکیبات محلول میکروالمنت…………………………………………………………………………………………………….96

(جدول3-4) ترکیبات محیط کشت بذردهی……………………………………………………………………………………………….99

(جدول3-5) ترکیبات محیط کشت تخمیر………………………………………………………………………………………………….104

(جدول3-6) مقادیر کنجاله سویا و کنجاله کلزا در محیط های تخمیر………………………………………………………106

(جدول3-7) محلول های نهایی اریترومایسین استاندارد…………………………………………………………………………….111

(جدول5-1) آنالیز ترکیبی کنجاله سویا افزوده شده به محیط کشت تخمیردر این پژوهش……………………139

(جدول5-2) آنالیز ترکیبی کنجاله کلزای افزوده شده به محیط کشت تخمیردر این پژوهش………………….140

(جدول5-3) اسیدآمینه های ضروری کنجاله سویا استفاده شده در این پژوهش……………………………………..140

(جدول5-4) اسیدآمینه های غیر ضروری کنجاله سویا استفاده شده در این پژوهش………………………………141

(جدول5-5) اسیدآمینه های ضروری کنجاله کلزا استفاده شده در این پژوهش……………………………………….141

(جدول5-6) اسیدآمینه های غیر ضروری کنجاله کلزا استفاده شده در این پژوهش………………………………..142

عنوان فهرست نمودارها صفحه

(نمودار 4-1) تغییرات pH در طول فرآیند تولید آنتی بیوتیک در محیط کشت کنترل…………………………..123

(نمودار 4-2) تغییرات درصد بیومس در طول فرآیند تولید آنتی بیوتیک در محیط کشت کنترل ( منحنی رشد باکتری )………………………………………………………………………………………………………………………………………………..124

( نمودار 4-3) میزان تولید اریترومایسین در محیط کشت کنترل……………………………………………………………..125

(نمودار 4-4) اثر غلظت های مختلف ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا روی pH محیط کشت در روزهای نمونه گیری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………129

(نمودار 4-5) تغییرات درصد وزن تر بیومس تولیدی در محیط کشت تخمیر در روزهای مختلف و تمامی غلظت ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..130

(نمودار 4-6) تغییرات غلظت تولیدی اریترومایسین در محیط کشت تخمیر در روزهای مختلف و تمامی غلظت ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..131

(نمودار 4-7) تولید اریترومایسین در طول فرآیند در محیط کشت حاوی غلظت بهینه……………………………132

(نمودار 4-8) تغییرات pH درطی فرآیند تولید اریترومایسین در محیط کشت تخمیر حاوی غلظت بهینه……….133

(نمودار4-9) تغییرات درصد وزن تر بیومس تولیدی درطی فرآیند تولید اریترومایسین در محیط کشت تخمیر حاوی غلظت بهینه……………………………………………………………………………………………………………………………134

عنوانفهرست اشکال صفحه

(شکل1-1) اریترومایسین و الئاندومایسین، نمونه ای از ماکرولیدهای 14 عضوی……………………………………….27

(شکل1-2) مسیر کلی بیوسنتز اریترومایسین……………………………………………………………………………………………….29

(شکل1-3) ساختار شیمیایی اریترومایسین………………………………………………………………………………………………….31

(شکل1-4) نمونه ای از یک فرمانتور همزن دار…………………………………………………………………………………………….50

(شکل1-5) شمایی از یک راکتور مجهز به همزن………………………………………………………………………………………….69

(شکل1-6) یک دستگاه تخمیر مجهز به سیستم تزریق هوا…………………………………………………………………………70

(شکل1-7) نمونه ای از کف شکن های مکانیکی………………………………………………………………………………………….72

(شکل1-8) کشتزار کلزا در کلاله ایران…………………………………………………………………………………………………………86

(شکل 3-1) تصویری از آمپول لیوفیلیزه حاوی سویه باکتریSaccharopolyspora erythraea….93

(شکل3-2) تصویری از اسپورهای تشکیل شده بر روی محیط اسپورزایی CSL در روز 10 …………………….98

(شکل3-3) تصویری از واکنش رنگی اریترومایسین تولیدی و محلول بروموفنل بلو………………………………….112

(شکل 3-4) کروماتوگرافی لایه نازک…………………………………………………………………………………………………………..120

(شکل3-5) کروماتوگرافی لایه نازک…………………………………………………………………………………………………………..121

(شکل4-1) مورفولوژی میسلیوم هایSaccharopolyspora erythraeaدر روز چهارم تخمیر……..126

(شکل4-2) مورفولوژی میسلیوم هایSaccharopolyspora erythraeaدر روز ششم تخمیر……….126

(شکل 4-3) مورفولوژی میسلیوم هایSaccharopolyspora erythraeaدر روز هشتم تخمیر…….127

(شکل4-4) مورفولوژی میسلیوم هایSaccharopolyspora erythraeaدر روز دهم تخمیر………..127

(شکل 4-5) مورفولوژی میسلیوم هایSaccharopolyspora erythraeaدر روز یازدهم تخمیر…..128

چکیده

امروزه یکی از مهم ترین و پرمصرفترین آنتی بیوتیک های مورد استفاده اریترومایسین می باشد که در درمان طیف وسیعی از بیماری ها مورد استفاده قرار می گیرد. برای تولید این آنتی بیوتیک پنج مرحله کلیدی وجود دارد که از بین این مراحل، مهم ترین و پر هزینه ترین مرحله که در آن اریترومایسین تولید می شود مرحله تخمیر است. ترکیبات محیط کشت مرحله تخمیر نقش مهمی را در میزان تولید محصولات ثانویه و پارامترهای تخمیر ایفا می کنند همچنین سوبسترای نیتروژنی یکی از اجزای اصلی محیط کشت در این مرحله و یکی از موارد اصلی هزینه در مخلوط محیط کشت می باشد. بنابراین استفاده از منابع نیتروژنی با قیمت مناسب و بازده قابل قبول از اهمیت ویژه ای برخوردار است . در این پژوهش اثرغلظتهای مختلف ترکیبی از دو منبع نیتروژنی کنجاله سویا و کنجاله کلزا در تولید آنتی بیوتیک اریترومایسین بررسی شده است. برای تولید اریترومایسین از باکتری رشته ایSaccharopolyspora erythraeaاستفاده شده است. سوسپانسیون اسپوری به محیط بذردهی تلقیح شده و در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 40 تا 44 ساعت با دور rpm 200 در شرایط هوازی گرما گذاری شد و بهترین نمونه بذردهی به ارلن های حاوی محیط تخمیر اضافه شد و با pH اولیه 8/6 در شیکر انکوباتوردار با دمای 33 درجه سانتیگراد و دور rpm220 به مدت 11 روز گرما گذاری شد. در طول فرایند تغییراتمورفولوژیکباکتری ، pH ، درصد وزن تر بیومس تولیدی از روز چهارم به صورت یک درمیان اندازه گیری شد . میزان اریترومایسین تولید شده به روش اسپکتروفتومتری سنجیده شد . غلظت های منابع نیتروژنی مورد استفاده عبارت بود از :

1- کنجاله سویا 15 گرم در لیتر و کنجاله کلزا 15 گرم در لیتر ( هر کدام 50 % محیط )