n تحقیقات مربوط به روابط پویشی پرفشار سیبری با دیگر سامانه های دور در قالب پیوند از دور 6

n تحقیقات مربوط به قلمرو گسترش زبانه های هوای سرد پرفشار سیبری 7

n تحقیقات مربوط به شرایط زمانی و مکانی پرفشار سیبری در سرزمین ایران 8

2-1. بنیادهای پژوهش…. 10

2-1-1. هوا 10

2-1-2. آب وهوا 11

2-1-3. دما 11

2-1-4. تغییرات دمایی.. 11

2-1-5. آستانه. 12

2-1-6. حداکثر دمای روزانه. 12

2-1-7. حداقل دمای روزانه. 12

2-1-8. روز سرد. 12

2-1-9. دمای بحرانی.. 12

2-1-10. وزش هوا 12

2-1-11. فرارفت هوای سرد. 12

2-1-12. فشار 13

2-1-13. شیب تغییرات فشار 13

2-1-14. توده های هوا 13

2-1-15. مفهوم همدید. 13

2-1-16. نقشه های هوا 13

2-1-17. ایستگاه همدید. 14

2-1-18. آب وهواشناسیهمدید. 14

2-1-19. ناوه (زبانه کم فشار) 14

2-1-20. پشته (زبانه پرفشار) 15

2-1-21. پرفشارها (آنتی سیکلون) 15

2-1-22. پرفشارهای گرمایی.. 15

2-1-23. پرفشار های پویشی.. 16

2-1-24. نقشه سطح متوسط دریا 16

2-1-25. نقشه های ترازهای بالای جو. 16

2-1-26. نقشه های هم ارتفاع ژئوپتانسیل.. 16

2-1-27. پرفشار سیبری.. 17

2-1-28. عامل اصلی تشکیل پرفشار سیبری.. 18

2-1-29. گسترش پرفشار سیبری روی ایران.. 19

2-1-30. پرفشار جنب حاره 19

2-1-31. بادهای غربی.. 19

2-1-32. کم فشار سودان.. 19

2-1-33. واچرخند عربستان.. 20

2-2. سرزمین پژوهش…. 20

2-2-1. سیمای طبیعی ایران مرکزی.. 20

2-2-2. پهنه های آبی اثر گذار بر ایران مرکزی.. 22

< دریای مدیترانه. 22

<دریای سرخ و خلیج عدن.. 22

<دریای سیاه 22

2-2-3. پراکنش دما 23

2-2-4. میانگین دمای ماهانه. 24

2-2-5. دمای بیشینه مطلق ماهانه. 25

2-2-6. دمای کمینه مطلق ماهانه. 26

2-2-7. بارش سالانه. 27

2-2-8. میانگین ماهانه بارش…. 28

2-2-9. پراکنش فشار 30

2-2-10. میانگین ماهانه سمت و سرعت باد غالب در هشت ایستگاه نمونه 32

3-1. پرسش های پژوهش…. 36

3-2. فرضیات پژوهش…. 36

3-3. گزینش سرزمین پژوهش و ایستگاه های داده سنجی.. 36

3-4. منابع داده ها 38

3-5. تعیین ویژگی های عمومی آب وهوایی سرزمین پژوهش…. 38

3-6. مراحل شناسایی و استخراج موج های سرما 39

3-7. معیار تعیین موج های سرما 42

3-8. معیار تعیین موج سرمای بحرانی.. 42

3-9. معیار تعیین روز اوج سرمای بحرانی.. 42

3-10. مراحل آزمون فرضیه نخست تحقیق.. 43

3-10-1. تهیه داده های ترازی.. 43

3-10-2. تبدیل داده های فشرده به متن.. 43

3-9-3. تعیین محدوده طراحی الگوهای همدید. 43

3-10-4. تبدیل داده های رقومی به نقشه. 44

3-10-5. ترسیم نقشه های ارتفاعی.. 45

3-10-6. تعیین بیرونی ترین پربند بسته برای هر سرما 46

3-10-7. تعیین پربند پشتیبان پرارتفاع سیبری.. 47

3-11. مراحل آزمون فرضیه دوم. 47

3-11-1. رسم نقشه های بردار باد. 47

3-11-2. رسم نقشه های خطوط جریان باد. 48

3-11-3. رسم نقشه های دما 48

3-11-4. کمی کردن نقشه های بردار باد. 48

3-11-5. اسکریپت نویسی میانگین بردارهای باد. 48

3-11-6. اسکریپت نویسی تعیین جهت و سمت غالب بردارهای باد 49

3-11-7. فراخوانی اسکریپت dat.gs به محیط GrADS. 50

3-11-8. کارتوگرافی و تکنیک رسم نقشه ها 52

4-1. تحلیل آماری 47 موج سرماهای بحرانی 53

4-1-1. سه ویژگی سرماهای بحرانی.. 55

<دوام. 55

<شدت… 56

<گسترش مکانی.. 56

4-1-2. نتایج آماری سرماهای بحرانی ایران مرکزی.. 57

4-2. نتایج همدید سرماهای بحرانی ایران مرکزی.. 58

4-2-1. نقش پرفشار سیبری در سرماهای بحرانی ایران مرکزی.. 58

<تراز دریا 65

<تراز 1000 ه.پ… 67

<ترازهای 750 و 500 ه.پ… 69

<تحلیل موقعیت پربند پشتیبان.. 73

<تحلیل الگوهای همدید- تراز 1000 ه.پ… 74

<تحلیل الگوهای همدید- تراز 750 ه.پ… 75

<تحلیل الگوهای همدید- تراز 500 ه.پ… 76

4-2-2. نقش فرارفت های شرقی در سرماهای بحرانی ایران مرکزی 77

<سمت باد، دما و خطوط جریان در ترازهای بالا. 77

<تحلیل سرعت و سمت میانگین باد. 87

<تحلیل الگوهای بردار باد در تراز 1000 ه.پ… 88

5-1. آزمون فرض…. 90

5-2. نتیجه گیری.. 91

5-3. پیشنهادها 92

5-4. تنگناهای تحقیق.. 92

<سرچشمه ها 93

<چکیده لاتین.. 97

تغییر در بسامد بلایای آب و هوایی مانند موج های سرما یکی از مهمترین جنبه های تغییر آب و هوا است (کنکال و همکاران؛ 1999). همه ساله افراد زیادی با گسترش و وقوع موج های گرم و یا بوران های سرمایی هلاک می شوند (علیجانی،1390). در این میان دماهای بسیار سرد به عنوان خطر یا بحران برای انسان تعریف شده اند. اساسا عنصر دما از دیرباز مورد توجه آب وهواشناسان بوده (عساکره؛ 1388)، تغییرات کوتاه مدت و درازمدت آن می­تواند ساختار آب و هوای هر محل را دگرگون سازد.

بر اساس گزارش هیأت بین الدول آب وهوا (IPPC. 2001)دمای سطح کره زمین در فاصله زمانی 1861-2001 میلادی حدود 0.6 درجه سانتی گراد افزایش یافته است. این درحالی است که رفتار فراسنج دمای حداقل و حداکثر با یکدیگر متفاوت بوده، دمای حداقل به طور آشکاری نرخ افزایشی داشته است. با وجود افزایش دمای حداکثر، نرخ آن از نرخ دمای حداقل کمتر بوده است (کارل و همکاران،1993).

از این رو بنا به قول شعبانی و همکاران (1392: 896)، مدلسازی متغیرهای حدی دمای هوا و پیش بینی دماهای حداکثر و حداقل به عنوان یکی از مهمترین پارامترهای آب وهوای با توجه به تغییرات آب وهوایی، گرمایش جهانی و خشکسالی­ها، قطعاً فرصت بیشتری را جهت برنامه ریزی و ارائه تمهیدات لازم به خصوص در آب و هواهای خشک و نیمه خشک در اختیار برنامه ریزان قرار می دهد.

1-1). بیان مساله

ایران به دلیل گستردگی زیاد در طول و عرض جغرافیایی، پیچیدگی در پیکربندی ناهمواری ها و یورش توده های هوا با خاستگاه های گوناگون، از نظر دمایی شرایط ویژه ای دارد. تکرار توده های هوایی که به وسیله سامانه های چرخندی و واچرخندی و یا گسترش زبانه های آنها به ایران می رسند و شرایط رطوبتی و دمایی هوای روزمره را تعیین می کنند؛ در درازمدت، شرایط آب و هوایی ایران را به وجود می آورد (علیجانی،1383: 37).

سرزمین ما به دلیل شرایط جغرافیایی خاص، یعنی موقعیت آن در رابطه با گردش عمومی جو و قرار گرفتن آن در عرضهای جغرافیایی میانه، در فصول مختلف سال تحت تاثیر آنتی سیکلونهایی با منشاهای مختلف و خصوصیات فیزیکی گوناگون قرار می گیرد، از جمله این آنتی سیکلون ها، پرفشار سیبری است که مهم ترین مرکز کنش جوی اوراسیا طی زمستان است و اثر محسوسی بر آب وهوای ایران دارد (لشکری 1375: 4).

از جمله سامانه های موثر بر توده هوای وارد شونده به سرزمین ایران می توان به موارد زیر اشاره کرد؛

n توده هوای عموما گرم و خشک ناشی از پرفشاره جنب حاره: پرفشاره جنب حاره، سامانه پویشی (دینامیکی) بزرگی در مقیاس سیاره ای است که کانونی روی اقیانوس اتلس شمالی دارد. در دوره گرم سال زبانه ای از پرفشار جنب حاره روی ایران است. قلمرو این زبانه از تراز 700 تا 1000 ه.پ گسترش دارد و سبب حاکمیت هوایی گرم و خشک بر بخش بزرگی از ایران (شبانکار و جلبیان، 1389: ص 48)، بویژه در سرزمین های دور از ساحل می شود. با حرکت پرفشارجنب حاره و رودباد همراه با آن به عرض های پایین تر، از ماه دسامبر و ورود بادهای غربی به ایران در دوره سرد سال (امام هادی، 1383: 36) می توان شاهد ورود توده های هوایی دیگری بود.

بروسلا…………………………………………………………….

1-8 روشهای تشخیص…………………………………………………………………………………..

1-9 درمان بیماری ………………………………………………………………………………………..

1-10 واکسیناسیون…………………………………………………………………………………………

1-10-1 تولید پروتئین نوترکیب Omp31…………………………………………….

1-10-2 استفاده از NPAP…………………………………………………………………..

1-10-3 استفاده ازبروسلاملیتنسیسسویه WR201……………………………………..

1-10-4 استفاده ازپروتئینهای غشاءداخلی16و19(Omp16&Omp19)بروسلاآبورتوس

1-10-5 تولید سویه زنده تخفیف حدت یافته با جهش بر روی ژنهایmanBA ،virB2 و asp24 در هر دو سویهبروسلا آبورتوسوبروسلا ملیتنسیس

1-10-6 جهش بر روی ژنهای دخیل در سنتز LPS………………………………………….

1-10-7 استفاده از LPS خالص شدهبروسلاملیتنسیس……………………………………

1-10-8 استفاده از پروتئین CP24…………………………………………………………………

1-10-9 نتیجه گیری در مورد بهترین حالت ممکن واکسن انسانیبروسلاملیتنسیس…

1-10-10 مجوز استفاده از واکسنبروسلاابورتوسسویه RB51 برای استفاده در گاوها…

1-11 دیواره سلولی باکتری های گرم منفی……………………………………………………….

1-11-1 اندوتوکسین …………………………………………………………………………..

1-11-2 ساختمانLPS………………………………………………………………………

1-11-3 عملکردLPS………………………………………………………………………..

1-11-4 تاثیراتLPS………………………………………………………………………….

1-12نایسریا………………………………………………………………………………………………….

1-12-1 پورین های مننگوکوک………………………………………………………….

1-12-2PorA…………………………………………………………………………………..

فصل دوم: (سابقه وپیشینه تحقیق)

فصل سوم: (مواد و روشها)

3-1 وسایل مورد استفاده ……………………………………………………………………………….

3-2 مواد مورد استفاده……………………………………………………………………………………

3-3 روش کار ……………………………………………………………………………………………..

3-4 رنگ آمیزی گرم…………………………………………………………………………………….

3-5 طرز تهیه استوک ………………………………………………………………………………

3-6 روش استخراجDNAپلاسمیدی…………………………………………………………..

3-6-1 طرز تهیه محلولهای مورد نیاز برای استخراج پلاسمید…………………….

3-6-2 مراحل استخراجDNAپلاسمیدی……………………………………………….

3-7 الکتروفورز …………………………………………………………………………………………..

3-7-1 طرز تهیه ژل آگاروز……………………………………………………………………

3-7-2طرز تهیه بافرTBE(1X)…………………………………………………………….

3-8 بررسی بیان پروتئین……………………………………………………………………………..

3-9 نحوه آماده سازی جایگاه ژل…………………………………………………………………

3-10 روش تهیه بافر متراکم کننده…………………………………………………………….

3-11 روش تهیه بافرجداکننده ……………………………………………………………….

3-12 روش تهیه بافر تانک……………………………………………………………………..

3-13 آماده سازی الکتروفورز عمودی……………………………………………………………

3-13-1 آماده سازی پروتئین ………………………………………………………………

3-13-2 بارگذاری پروتئین………………………………………………………………….

3-14 رنگ آمیزی ژل.SDS-PAGE…………………………………………………………..

3-14-1 ساخت محلول رنگ………………………………………………………………

3-14-2 نحوه رنگ آمیزی…………………………………………………………………..

3-15 خالص سازی پروتئین نوترکیبE.coli………………………………………………..

3-16 شکستن سلولها برای آزادسازی پروتئین………………………………………………..

3-17 خالص سازی با ستون نیکل سفارز……………………………………………………….

3-17-1 مواد مورد نیاز برای تهیه بافرهای خالص سازی………………………..

3-18 بردفورد……………………………………………………………………………………………

3-18-1 تهیه معرف بردفورد…………………………………………………………..

3-19 جداسازیLPSبروسلا ملیتنسیس……………………………………………………….

3-19-1 پروتکل جدا سازیLPS……………………………………………………

3-19-2 تهیه محلول دیالیز یا بافرفسفات…………………………………………..

3-20 سنجش غلضتLPSبروسلا ملیتنسیس……………………………………………..

3-20-1 تهیهLPSمنحنی استاندارد………………………………………………….

3-21 روش کونژوگاسیونLPSباPorA…………………………………………………..

3-22 خالص سازی کونژوگاسیون………………………………………………………………..

 

فصل چهارم:(نتایج )

4-1 احیا باکتری نوترکیبPorA……………………………………………………………….

4-2 استخراجDNAپلاسمیدی ……………………………………………………………….

4-3 بررسی بیان پروتئین …………………………………………………………………………..

4-4 خالص سازی پروتئین نوترکیبPorA………………………………………………..

4-5 بردفورد…………………………………………………………………………………………….

4-6 جداسازیLPSبروسلا ملیتنسیس………………………………………………………

4-7 سنجش غلظتLPSبروسلا ملیتنسیس………………………………………………

4-8 کونژوگاسیونLPSباPorA………………………………………………………………

فصل پنجم: (بحث)…………………………………………………………………………………..

نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………….

منابع و ماخذ …………………………………………………………………………………………..

فهرست جدول ها

جدول1-1 طبقه بندی بروسلا……………………………………………………………………………………………

جدول 1-2 مقایسه بیماری زایی گونه های مهم بروسلا……………………………………………………….

جدول1-3 فراوانی شکایات بیماران مبتلا به بروسلوز بستری…………………………………………………

جدول1-4 فراوانی بعضی از یافته های بروسلوز طی چند فقره مطالعه…………………………………….

جدول 3-1 بافر جدا کننده 12%…………………………………………………………………………………………

جدول3-2 بافر متراکم کننده 6%…………………………………………………………………………………………

جدول3-3 بافر تانک………………………………………………………………………………………………………..

جدول3-4 تهیه معرف بردفورد………………………………………………………………………………………….

جدول3-5 تهیه معرف مورد استفاده در سنجشLPS…………………………………………………………..

فهرست شکل ها

شکل1-1 انواع سلولهایی که توسط باکتریبروسلا آبورتوسدر میزبان طبیعی و در میزبان تصادفی درگیر میشوند…………………………………………………………………………………………………………………….

شکل1-2 شکل فرضی از تعاملات باکتریبروسلا آبورتوسبا ماکروفاژ……………………………………

شکل 3-1 الکتروفورز با ژل پلی اکریل آمید…………………………………………………………………………..

شکل 4-1 کشت پارویی……………………………………………………………………………………………………..

شکل 4-2 DNA پلاسمیدی……………………………………………………………………………………………..

شکل4-3SDS-PAGE,PorA………………………………………………………………………………………..

شکل 4-4 باند خالص سازی شده PorA……………………………………………………………………………..

شکل 4-5 معادله منحنی استاندارد برای سنجش غلضت پروتئین خالص سازی شدهPorA………..

شکل4-6 باندهای LPSبروسلا ملیتنسیس…………………………………………………………………………….

شکل 4-7 معادله منحنی استاندارد سنجشLPS…………………………………………………………………..

چکیده

بروسلوز یکی از پنج بیماری عفونی مشترک بین انسان و دام است که در اثر آلودگی با باکتری های جنسبروسلابه وجود می آید .بروسلاها، باکتری های کوچک ، غیر متحرک ، گرم منفی کوکوباسیل و درون سلولی اختیاری که در طیف وسیعی از حیوانات ایجاد بیماری می کنند .بروسلاآبورتوسوبروسلاملی تنسیسعمده ترین گونه های عامل بروسلوز انسانی هستند.واکسنهای بروسلوز حیوانی شامل باکتریهای غیر فعال شده و یا سویه های زنده تخفیف حدت یافته دو مشکل اساسی در انسان ایجاد می کنند: نخست آنکه گاهی ایجاد بیماری مینمایند و دوم آنکه با واکنشهای ازدیاد حساسیت ناخواسته همراه اند. در همین راستا در سالهای اخیر ایمنی زایی با آنتی ژنهای مختلفی از گونه هایبروسلابه شکل مونووالان طبیعی کونژوگه و یا نوترکیب مورد مطالعه و بررسی قرار گرفته است.از بین عوامل ویرولانس این ارگانیسم ،لیپوپولی ساکارید(LPS) بعنوان عامل ویرولانس اصلی شناخته شده است و سویه های جهش یافته و فاقد این جزء از دیواره سلولی، فاقد ویرولانس و توان بقای درون سلولی هستند.همچنین LPS به لحاظ ایمونولوژیک آنتی ژن اصلی سطح سلولیبروسلامحسوب میشود. به همین دلیل امروزه استفاده از LPSبروسلابه دلیل داشتن خواص آنتی ژنیک و ایمونوژنیک قوی جهت طراحی و تولید یک واکسن موثر انسانی بسیار مورد ارزیابی و مطالعه قرار میگیرد.امروزه پژوهش های متعددی در زمینه واکسن های زیر واحدی مونووالانت و یا کونژوگه ،با جایگزینی اجزاء دیگر باکتری از جمله پروتئین های غشاء خارجی جهت ایجاد پاسخ های ایمنی وابسته به لنفوسیتTصورت گرفته است وزیکول غشاء خارجی مننگوکوک(OMV) متشکل از پروتئینهای کلاس 1 تا 4،فسفولیپید پلی ساکارید کپسولی و لیپواولیگوساکارید میباشد،این ماکرومولکول در خلال سیر رشد باکتری در بدن میزبان رها میشود و پژوهش ها نشان میدهد که نقش عمده ای را در القائ ایمنی حفاظت بخش پس از ابتلا به بیماری دارد.از مهمترین اجزائ این ماکرومولکول میتوان به PorA،از خانواده کلاس1 پروتئین غشائ خارجی اشاره نمود که توانایی ایجاد پاسخ های باکتریسیدی را دارد. علاوه بر این وجود سایر ترکیبات از جمله لیپوالیگوساکارید و فسفولیپیدها،دارای خاصیت آدجوانتی بوده و پاسخ حفاظتی مناسبی را در انسان ایجاد مینمایند.

در این مطالعه ویال لیوفلیزه، حاوی porA ای که داخلE.coliکلون شده بود احیا گردید سپس برای اطمینان از اینکه porA روی پلاسمید باکتری کلون شده است استخراج DNA پلاسمیدی انجام شد.در مرحله ی بعد بیان پروتئین porA انجام گردید و برای شناسایی و بررسی کیفیت و کمیت پروتئین ، با روش SDS-PAGE بررسی شد. برای بیشترین بیان ،خالص سازی پروتئین با ستون کروماتوگرافی (نیکل – سفاروز) انجام گردید وسپس با انجام بردفورد غلظت پروتئین بدست آمد.در مرحله ی بعد LPSبروسلا ملیتنسیسجداسازی گردید و برای بررسی کیفیت و کمیت آن با روش SDS-PAGE بررسی شد وسپس با انجام ازمایش غلظت LPS بدست آورده شد.در نهایت LPSبروسلا ملیتنسیسبا porAنیسریاکونژوگه گردید.

بیشترین بیان پروتئین porA در ساعت چهارم و پنجم در محدوده ی باند 65KD مشاهده شد . پس از خالص سازی پروتئین یک باند تک در محدوده ی 65KD مشاهده گردید و با انجام بردفورد غلظت پروتئین porA ،5 میکروگرم بر میلی لیتر بدست آمد.رویSDS-PAGE باندهای LPS مشاهده شد .با انجام ازمایش غلظت LPS ، 97/3میکروگرم برمیلی لیتر بدست آمد.

کلمات کلیدی:لیپوپلی ساکارید ، بروسلا ملیتنسیس، نیسریا مننژیتیدیس، وزیکول غشای خارجی (OMV) ،porA

فصل اول

مقدمه

1-1-طبقهبندی بروسلا:

بروسلاها جزء آلفا پرتئوباکتریا هستند و از نظر فیلوژنیک با باکتریهای پاتوژن و همزیست (از جمله ریزوبیوم و آگرباگتریوم) گیاهان ، پارازیت های داخل سلولی جانوران ( از جملهبارتونلاوریکتزیا) و فرصت طلب ها و آزادزیها مانند اوکراباکتریوم و کلوباکتر مرتبط می باشند .(کلاسن وهمکاران،1996؛ مورنو و همکاران ،2002 ؛ پریسنت و همکاران،2002 )

جنسبروسلابر اساس تفاوت آنتی ژنتیک ، میزبان اصلی ، کشت باکتری در محیط ها و شرایط فیزیکوشیمیایی مختلف ، واکنش با آنتی سرمهای اختصاصی و تشابهDNAبه هفت گونه تقسیم می گردد ، خصوصیات کلی این گونه ها در جدول( 1-1) آمده است . تاکنون 7 بیووار دربروسلاآبورتوس، 3 بیووار دربروسلاملی تنسیسو 5 بیوار در بروسلا سویسرا مشخص نموده اند . در سایر گونه ها تاکنون بیووار خاصی شناخته نشده است (مورنو و همکاران،2002 ؛یانگ،1995؛جاوتز و همکاران،1998؛کو و همکاران،2003)

جدول 1-1: طبقه بندی بروسلا

ی نوشته‌ها

1-5-7-2 ) کاندیدا آلبیکنس : 18

1-6 ) ولوواژینیت كاندیدائی : 19

1-6-1 ) علایم ولوواژینال : 20

1-6-2 ) مراحل بیماری زایی کاندیدا : 21

1-6-3 ) عوامل مربوط به پاتوژن : 22

1-6-4 ) عوامل مربوط به میزبان : 23

1-6-5 ) ایمنی در ولوواژینیت كاندیدیایی : 27

1-6-6 ) تشخیص RVVC : 28

1-6-7 ) درمان : 28

1-6-8 ) عوامل مؤثر بر روی درمان : 28

1-7 ) تعاریف اولیه از شیمی دارویی : 28

1-7-1 ) سیر تاریخی شیمی دارویی : 29

1-7-2 ) تاریخ معرفی شیمی دارویی به عنوان علم : 29

1-7-3 ) جنبه های بنیادی داروها : 29

1-7-4 ) کاربرد داروها : 30

1-8 ) داروهای ضد قارچی : 30

1-8-1 ) آزول ها : 31

1-8-2 ) آنتی بیوتیک های پلی اِن : 32

1-8-3 ) مقاومت گونه های مختلف کاندیدا علیه داروهای ضد قارچی : 32

1-8-4 ) مکانیسم های مقاومت در برابر عوامل ضد قارچی : 32

1-9 ) مکانیسم اثر فلوکونازول : 33

33

1-9-2 ) مکانیسم مقاومت کاندیدا علیه فلوکونازول : 34

1-9-3 ) نحوه استفاده از داروهای آزول : 34

3-1) اسامی تعدادی از مواد، وسایل و دستگاه های مورد استفاده: 42

3-1-1) مواد و محیط کشت های مورد ازمایش: 42

42

3-2) مواد و روش ها: 45

3-2-1) جمع آوری نمونه ها: 45

3-2-2) بررسی مستقیم میکروسکوپی: 45

3-2-3)کشت روی محیط: 46

تهیه محیط کشت سابورو دکستروز آگار: 46

3-2-4) تشخیص آزمایشگاهی گونه های کاندیدا : 47

3-2-4-1) بررسی پرگنه در محیط کروم آگارکاندیدا: 47

3-2-4-2) آزمایش ایجاد لوله زایا : 48

3-2-4-3)مورفولوژی و بررسی کلامیدوکونیدی بر روی کورن میل آگار( CMT80 ) : 48

3-2-4-4)بررسی ایجاد کلامیدوکونیدی در محیط کازئین اگار: 49

3-2-4-5) رشد در دمای 45 درجه سانتی گراد : 49

3-2-4-6) واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR و RAPD : 50

3-2-5) تهیه سوسپانسیون سلول مخمری کاندیدا آلبیکنس: 54

3-2-6 ) روش میکرودیلوسین : 54

3-2-7 ) موارد کنترل مثبت و کنترل منفی آزمایشات : 55

3-2-8 ) انتقال میکروپلیت ها به گرم خانه ( گرم خانه گذاری ) : 55

3-2-9 ) کشت مجدد محتویات هر یک از حفرات میکروپلیت روی محیط سابورو دکستروز آگار حاوی کلرامفنیکل ( SC ) : 56

59

5-1 ) ارزیابی تعیین گونه های کاندیدا در مبتلایان به ولوواژینیت عود کنندکاندیدایی: 72

5-2 ) ارزیابی عملکرد ضد قارچی داروی فلوکونازول روی قارچ کاندیدا آلبیکنس : 74

منابع : 79

فهرست جداول

عنوان صفحه

جدول 1- برخی از گونه های بیماریزای کاندیدا و نام مرحله جنسی آنها 16

جدول2- مشخصاتمورفولوژیکگونه های بیماریزای پر اهمیت کاندیدا 16

جدول- 3 مروری بر انواع عفونتهای کاندیدایی و عوامل مستعدکننده آنها 17

جدول 4-2 : تعداد و درصد عدم رشد قارچ ( کشندگی ) کاندیدا آلبیکنس… 61

جدول 4-1 : نتایج فعالیت های مهار رشد ( MIC90 ) و قارچ کشی ( MFC ) داروی فلوکونازول روی سویه های قارچ کاندیدا آلبیکنس… 60

جدول 4-3 : تعداد و درصد مهار رشد قارچ کاندیدا آلبیکنس… 61

جدول 4-4 : میانگین و انحراف معیار غلظت کشندگی قارچ کاندیدا آلبیکنس… 62

جدول 4-5 : میانگین و انحراف معیار مهار کنندگی قارچ کاندیدا آلبیکنس… 62

جدول 4-6 : میانگین و انحراف معیار سن در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدیایی. 62

جدول 4-7 : مقایسه گروه های سنی در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی. 63

جدول 4-8 : مقایسه تعداد دفعات زایمان در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی. 64

جدول 4-9 : بررسی وضعیت بارداری در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی. 64

جدول 4-10 : بررسی شدت علائم بیماری در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی. 65

جدول 4-11 : بررسی عوارض جسمی و روحی ناشی از ولوواژینیت کاندیدایی در مبتلایان 66

جدول 4-12 : بررسی سابقه استفاده از داروی فلوکونازول در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی 67

جدول 4-13 : بررسی سابقه استفاده از داروهای ضد قارچی ( غیر از فلوکونازول ) در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی 68

جدول 4-14 : بررسی سابقه ابتلا به بیماری های خاص در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی 68

جدول 4-15 : بررسی سابقه استفاده از دارو در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی. 69

جدول 4-16 : بررسی روش درمانی در موارد قبلی بیماری در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی 70

جدول 4-17 : بررسی وضعیت سیستم ایمنی در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی. 70

فهرست نمودارها

عنوان …………………………………………………………………………………………………………… صفحه

نمودار 4-1 : مقایسه درصدی گروه های سنی در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی. 63

نمودار 4-2 : مقایسه درصدی شدت علائم بیماری در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی 66

نمودار 4-3 : مقایسه درصدی عوارض جسمی و روحی ناشی از ولوواژینیت کاندیدایی در مبتلایان 67

نمودار 4-5 : مقایسه درصدی وضعیت سیستم ایمنی در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی 70

نمودار 4-4 : مقایسه درصدی سابقه استفاده از دارو در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی 69

فهرست شکل ها

عنوان صفحه

شکل3 -1: گرم خانه. 43

شکل3 -2 : اتوکلاو. 44

شکل3 – 3 : هود لامینار 44

شکل 3– 4 : میکروسکوپ نوری.. 44

شکل3 – 5 : کشت کاندیداروی محیط سابرو دکستروز آگار 46

شکل3- 6 : محیط سابرودکستروز آگار ( قبل از کشت قارچ ) 46

شکل 3– 7 : وجود كاندیدا آلبیكنس در محیط كروم آگار 48

شکل3- 8 : مرحله ورتکس در استخراج DNA.. 51

شکل3- 9 : مراحل استخراج DNA.. 52

شکل3 – 12 : پر کردن حفره های میکروپلیت توسط سمپلر و سر سمپلر در روش میکرودیلوسین 55

57

.. 57

57

59

… 59

 

چکیده

زمینه و هدف:میزان بروز ولوواژینیت کاندیدیایی عود کننده توسط گونه های کاندیدا روند رو به افزایشی را نشان می دهد. بر اساس مطالعات، بعضی از گونه های کاندیدا نسبت به داروهای ضد قارچی مثل فلوکونازول مقاومت نشان می دهند. بنابراین با جداسازی و شناسایی گونه های کاندیدای مسبب فرم عود کننده ولوواژینال و تعیین حساسیت آنها به داروی فلوکونازول می توان الگوی مناسبی از بیماران و مقاومت دارویی آنرا در منطقه جغرافیایی مورد پژوهش گزارش کرد.

روش کار:جدایه ی مخمری مورد آزمایش مستقیم، کشت و آزمایش های تکمیلی برای شناسایی گونه های مختلف کاندیدا از قبیل روش های مولکولی PCR RFLP ) ( و غیر مولکولی (سابرو دکستروز آگار، کروم آگار، تست لوله زایا) قرار گرفتند. سپس فلوکونازول بر روی هر کدام از نمونه ها به روش میکرودیلوسیون براث آزمایش شد و حداقل غلظت مهارکنندگی و حداقل غلظت قارچ کشی داروها اندازه گیری و حساسیت آنها تعیین شد.

یافته ها:در بررسی حداقل غلظت مهارکنندگی ایزوله های جدا شده مشخص شد تأثیر داروی ضد قارچی فلوکونازول علیه سویه های کاندیدا آلبیکنس حاصل از بیماران مبتلا به ولوواژینیت کاندیدایی عودکننده حساس وابسته به دوز می باشد.

2-3- اندوفیت و کلونیزاسیون ………………………………………………………………………………… 18

2-4- باکتری­های اندوفتیک و کاربرد آن­ها……………………………………………………………………. 21

2-4-1- افزایش تولید هورمون­های گیاهی……………………………………………………………………. 21

2-4-2- تثبیت بیولوژیکی نیتروژن……………………………………………………………………………… 25

2-4-3- فیتوبیورمیدیشن………………………………………………………………………………………….. 28

2-4-4- انحلال فسفات…………………………………………………………………………………………… 39

2-4-5- تولید سیدروفور……………………………………………………………………………………………. 41

2-4-6- تولید آنتی­بیوتیک و آنتی­بیوزیس………………………………………………………………………. 44

2-5- باکتری­های اندوفتیک و تولید آنزیم……………………………………………………………………….. 51

2-6- تنوع و جمعیت میکروارگانیسم­های یافت شده به­عنوان اندوفتیک………………………………….. 53

فصل سوم (مواد و روش­ها)

3-1- جداسازی و کشت باکتری اندوفتیک………………………………………………………………………. 59

3-1-1- مواد و وسایل لازم جهت جداسازی و کشت باکتری­های اندوفتیک از گیاه­گندم……………. 59

3-1-2- روش کار……………………………………………………………………………………………………. 59

3-1-2-1- نمونه و نمونه­گیری…………………………………………………………………………………….. 59

3-1-2-2- کشت و شناسایی………………………………………………………………………………………. 60

3-2-شناسایی فنوتیپی باکتری­های اندوفتیک…………………………………………………………………….. 60

3-2-1-رنگ­آمیزی گرم…………………………………………………………………………………………….. 60

3-2-2- تست کاتالاز……………………………………………………………………………………………….. 61

3-2-3- تست سیتوکروم­اکسیداز………………………………………………………………………………….. 61

3-2-4- تست کوآگولاز…………………………………………………………………………………………….. 61

3-2-5- تست حرکت………………………………………………………………………………………………. 62

3-2-6- تست هیدرولیز­ژلاتین…………………………………………………………………………………….. 62

3-2-7- تست سیمون­سیترات……………………………………………………………………………………… 63

3-2-8- تستMR/VP………………………………………………………………………………………………….63

3-2-9- تست هیدرولیز­نشاسته……………………………………………………………………………………. 63

3-2-10- تست هیدرولیز­کازئین………………………………………………………………………………….. 64

3-3- شناسایی باکتری­های تولید­کننده ترکیبات ضد­قارچی به روش مولکولار…………………………… 64

3-3-1- مواد و وسایل مورد استفاده جهت استخراجDNA…………………………………………………64

3-3-2- روش استخراجDNAژنومی…………………………………………………………………………… 65

3-3-3- روش تهیه ژل آگارز یک درصد……………………………………………………………………….. 65

3-3-4- انجامPCR………………………………………………………………………………………………………….. 66

3-3-4-1- وسایل مورد استفاده برای انجام PCR و شرایط دمایی دستگاه ترموسایکلر……………… 66

فصل چهارم (نتایج و بحث)

4-1- جداسازی باکتری­های اندوفتیک از گیاه­گندم…………………………………………………………….. 67

4-2- شناسایی فنوتیپی باکتری­های اندوفتیک 68

4-3- ارزیابی اثر آنتاگونیسمی باکتری­های اندوفتیک برعلیه قارچ­های بیوکنترلی و قارچ­های پاتوژن
گیاهی……………………………………………………………………………………………………………………. 70

4-4- بررسی فعالیت آنزیمβ-1و4­گلوکاناز……………………………………………………………………. 76

4-4-1- مواد و وسایل لازم………………………………………………………………………………………… 76

4-4-2- روش تهیه محلول نمکی 1­مولار………………………………………………………………………. 76

4-4-3- ترکیبات محیطCMCآگار1%…………………………………………………………………………… 77

4-4-4 معرف آزمایش کنگورد…………………………………………………………………………………….. 77

4-4-5 کشت و بررسی……………………………………………………………………………………………… 77

4-5- نتایج مربوط به شناسایی مولکولی باکتری­ها……………………………………………………………… 77

4-5-1- آنالیز کیفی محصولاتPCR……………………………………………………………………………78

4-5-2- نتایج تعیین توالی………………………………………………………………………………………….. 78

فصل پنجم (نتیجه­ گیری)

5-1. نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………… 92

5-2پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………. 98

منابع و ماخذ……………………………………………………………………………………………………………. 99

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………. 109

فهرست جداول

عنوان جدول صفحه

جدول2-1. مشخصه­هایی از بیماری زنگ…………………………………………………………………………………………5

جدول2-2. مشخصه­هایی از بیماری سیاهک……………………………………………………………………………………..6

جدول2-3. انواع میکوتوکسین فوزاریومی……………………………………………………………………………………….12

جدول2-4. انواع ترشحات ریشه……………………………………………………………………………………………………18

جدول2-5. اندوفیتیک­های تثبیت­کننده نیتروژن………………………………………………………………………………..28

جدول2-6. میکروارگانیسم­های مولد اسید­آلی………………………………………………………………………………….32

جدول2-7. میکروارگانیسم­های مولد بیوسورفاکتانت………………………………………………………………………..33

جدول2-8. میکروارگانیسم­های مولد گلیکوپروتئین………………………………………………………………………….34

جدول2-9. میکروارگانیسم­های اکسید­کننده و احیاء­کننده…………………………………………………………………..35

جدول2-10. میکروارگانیسم­های دخیل در فیتوبیورمیدیشن……………………………………………………………….39

جدول2-11. میکروارگانیسم­های مولد سیدروفور…………………………………………………………………………….43

جدول2-12. اندوفیت­های مولد آنتی­بیوتیک و عملکرد آن­ها……………………………………………………………..50

جدول3-1. شرایطPCR……………………………………………………………………………………………………………….66

جدول3-2. چرخهPCR………………………………………………………………………………………………………………..66

جدول3-3. توالی پرایمرطراحی شده برای16S rRNA………………………………………………………………………66

جدول4-1. نتایج آزمون­های بیوشیمیایی…………………………………………………………………………………………68

جدول4-2. اسامی قارچ­های مورد آزمون………………………………………………………………………………………..71

جدول4-3. نتایج آنتاگونیسمی برعلیهFusarium moniliforme………………………………………………………..72

جدول4-4. نتایج آنتاگونیسمی برعلیهFusarium graminearum……………………………………………………..72

جدول4-5. نتایج آنتاگونیسمی برعلیهFusarium oxysporum…………………………………………………………..72

جدول4-6. نتایج آنتاگونیسمی برعلیهFusarium culmorum…………………………………………………………..72

جدول4-7. نتایج آنتاگونیسمی برعلیهTricoderma virida………………………………………………………………73

جدول4-8. نتایج آنتاگونیسمی برعلیهTricoderma harizanum……………………………………………………….73

جدول4-9. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه.Tricoderma asperellum………………………………………………………73

جدول4-10. نتایج آنتاگونیسمی برعلیهMacrophomina phaseolina………………………………………………73

جدول4-11. ترکیبات محیطCMCآگار1%……………………………………………………………………………………..76

جدول4-12. نتایجBlast……………………………………………………………………………………………………………..79

فهرست شکل­ها

ی نوشته‌ها

4

1-2 میکرو ارگانیسم های تولید کننده

6

1-3 مکانیسم تنظیم کننده ترشح آنزیم آسپاراژیناز

10

1-4 کلاس های عمومی از ال-آسپاراژیناز

11

1-5 روش تعیین سختی و ساختار ال-آسپاراژیناز

12

1-6 ویژگی های ساختاری ال-آسپاراژیناز

12

1-6-1ساختار مونومری آنزیم ال-آسپاراژیناز

12

1-6-1-1 شرح جایگاه فعال ال-آسپاراژیناز

14

1-6-2 ساختار تترامر آنزیم ال-آسپاراژیناز

15

1-6-3 ساختار اُکتامر آنزیم ال-آسپاراژیناز

17

1-7 انواع آنزیم ال-آسپاراژیناز برحسب منشأ جداسازی

18

1-7-1-آنزیم های بومی

18

1-7-1-1 ال-آسپاراژینازی از اشرشیا کلی

18

1-7-1-2 ال-آسپاراژینازی از اروینیا

19

1-7-2 آنزیم اصلاح شدهPEG) -آسپاراژیناز)

20

1-8 کاربرد ال – آسپاراژینازها

22

1-8- 1 مکانیسم عمل به عنوان یک کمک کننده به فرآوری مواد غذایی

23

1-8-2 مکانیسم عمل به عنوان یک دارو

25

1-9 علم شیمی و فارماکولوژی برای دارو

26

1-10 نیمه عمر دارو

26

1-11 مسائل و رویکردهای مرتبط با استفاده درمانی از ال-آسپاراژیناز

27

1-11-1 عوارض ایمونولوژیک

27

1-11-2 مقاومت در برابر آسپاراژیناز

27

1-11-3 سمیت دارو

28

1-12 فارموکینیتیک

29

فصل دوم : مروری بر تحقیقات انجام شده

2_1 تحقیقات انجام شده در ایران و خارج از ایران

32

2-1-1 تحقیقات انجام شده بر روی باکتری های خاکزی مولد آنزیم ال-آسپاراژیناز

32

2-1-2 تحقیقات انجام شده بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز به منظور بهینه سازی

34

2-1-3 تحقیقات انجام شده بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز با استفاده از محیط کشت اختصاصیM₉

37

2-1-4 تحقیقات انجام شد بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز با استفاده از روش نسلریزاسیون

38

2-1-5 تحقیقات انجام شده بر روی باکتری های مولد آنزیم ال-آسپاراژیناز جدا شده ار آب و رسوبات

39

2-1-6 تحقیقات انجام شده بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز بر اساس روش SDS-PAGE

39

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1 غربالگری سویه های مولد آنزیم از خاک

42

3-2 جداسازی و کشت باکتری

42

3-2-1 مواد و وسایل لازم جهت جداسازی و کشت باکتری از خاک

42

3-2-2 کشت

43

3-3 فعالیت آنزیم

45

3-4 روش های اندازه گیری آمونیاك

45

3-5 مواد و وسایل لازم بررسی فعالیت آنزیم

45

3-6 معرف آزمایش

46

3-7 خواندن جذب لوله هایTestوBlank

46

3-8 مراحل کلونینگ

47

3-9 شرح مراحل کلونینگ

48

فصل چهارم: نتایج

4-1 نتایج مربوط به جداسازی

60

4-1-1 نتایج کشت

60

4-1-2 نتایج رنگ آمیزی گرم و تست های بیوشیمیایی

61

4-1-3 نتایج بررسی فعالیت آنزیمی

63

4-1-4 نتیجه آنالیز کیفی قطعه تکثیر یافته

66

4-1-5 نتایج مربوط به مستعد سازی

66

4-1-6 نتایج مربوط به کشت ماتریکس

66

4-1-7 نتایج تستQuick- check

67

4-1-8 نتایج استخراج پلازمید

68

4-1-9 نتایجPCRتاییدی

69

4-1-10نتایج تعیین توالی نمونه:Bacillus cereus strain

69

4-1-11نتایج تعیین توالی نمونه:Bacillus thuringiensis strain

74

4-1-12 نتایج تعیین توالی نمونه :Oerskovia turbata

79

فصل 5 نتایج

5-1 نتیجه

83

5-2 جمع بندی

83

5-3 محدودیت ها

83

5-4 پیشنهادها

84

منابع

85

فهرست جداول

جدول ‏1-1 تعدادی از میکروارگانیسم های تولیدکننده آسپاراژیناز	7
جدول1-2 منابع میکروبی ال-آسپاراژیناز و خواص آن	8
جدول1-3 مشخصات ال-آسپاراژیناز نشان دهنده فعالیت گلوتامیناز	19
جدول1-4 خواص آنزیم های اشرشیا کلی و اروینیا و برخی از فرآورده های بومی و اصلاح شده	20
جدول1-5 مقایسه ای از سمیت ال-آسپاراژیناز بومی وPEG	29
جدول1-6. خواص برخی از ال-آسپاراژینازهای میکروبی	31
جدول 3-1 مواد لازم جهت ساخت محیط کشت	42
جدول 3-2 مقادیر مورد نیاز برای تهییه میکسPCRبا در نظر گرفتن+n	51
جدول 3-3 شرایط دمایی و زمانی مورد نیاز برای میکروتیوپ ها	51
جدول 3-4 مقادیر اضافه شده به داخل میکروتیوپ0/2cc	54
جدول 3-5 : میزان مواد اضافه شده به داخل میکروتیوپ در مرحله یQuick-check	57
جدول4-1 قطر هاله تشکیل شده توسط سویه ها روی محیط برحسب میلی متر	61
جدول4-2 رنگ آمیزی گرم نمونه های آنزیم مثبت	62
جدول4-3 نتایج مربوط به آزمودن های بیوشیمیایی نمونه های آنزیم مثبت	63
جدول4-4 جذب نمونه های مولد آنزیم در طول موج 600 نانومتر	64
جدول4-5 جذب نمونه های مولد آنزیم در طول موج 480 نانومتر	72
جدول4-6 نتایج در سطح جنس و گونه	80

فهرست نمودار ها

نمودار 1-1 طبقه بندی عمومی ازآسپاراژیناز	11
نمودار 4 – 1 میزان جذب نمونه های مولد آنزیم ال آسپاراژیناز در 600 تاتومتر	64
نمودار 4- 2 میزان جذب نمونه های مولد آنزیم ال آسپاراژیناز در 480 تاتومتر	65

فهرست شکل ها