1-11- پیشگیری ………………………………………………………………………………………………………………………………..22

1_11 _1_ پیشگیری در جامعه ……………………………………………………………………………………………………………23

1_11_2_ پیشگیری با واکسن سل………………………………………………………………………………………………………..23

1-12- اهمیت مبارزه صحیح با سل ……………………………………………………………………………………………………..23

1-13- سل گاوی……………………………………………………………………………………………………………………………….24

1-13-1-بیماری سل در گاو ……………………………………………………………………………………………………………….24

1-13-2-علائم بالینی سل گاوی…………………………………………………………………………………………………………..26

1-13-3-تشخیص بیماریسل در گاو …………………………………………………………………………………………………27

1-13-4-کنترل بیماری سل ………………………………………………………………………………………………………………..27

1_14_ راههای ابتلا به سل گاوی ………………………………………………………………………………………………………..29

1-15- تعیین هویت مایکوباکتریومها ……………………………………………………………………………………………………30

1_15_1_تعیین هویت مایکوباکتریومها بر اساس خصوصیات فنوتیپیک ………………………………………………….30

1- 15 -2- تعیین هویت مایکوباکتریومها بر اساس خصوصیات ژنوتیپی………………………………………………….35

1-15-2-1-تشخیص بیماری ……………………………………………………………………………………………………………..36

1-15-2-2- تعیین هویت مولکولی مایکوباکتری هاجهت تعیین گونه ……………………………………………………..39

1-15-2-2-1-پروب های اسید نوکلئیک ……………………………………………………………………………………………..39

1-15-2-2-2 ریبوتایپینگ ………………………………………………………………………………………………………………….39

1-15-2-2-3- روش هیبریدیزاسیونDNA–DNA ……………………………………………………………………………39

1-15-2-2-4-پروب های هیبریداسیون داخل ژنومی تجاری …………………………………………………………………40

1-15-3-ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس ………………………………………………………………………………40

1-16-تکنیک های ژنومی …………………………………………………………………………………………………………………..42

1 _16_1_تكنیك های ژنومی كه اساس آنها PCR نمی باشد …………………………………………………………………..42

1_16_1_2_انگشت نگاری DNA به روش RFLP …………………………………………………………………………….43

1_16_2_1_اسپولیگوتایپینگ………………………………………………………………………………………………………………50

1_16_1_2_5_استفاده از مخلوط پروب ها در RFLP………………………………………………………………………..50

1_16_2_2_ VNTR ……………………………………………………………………………………………………………………….51

فصل دوم (مروری بر تحقیقات انجام شده)…………………………………………………………………………………………55

2-1-تاریخچه بیماری سل ………………………………………………………………………………………………………………….56

2-2-وضعیت بیماری سل در جهان ……………………………………………………………………………………………………..58

2-3-تاریخچه سل گاوی در ایران ……………………………………………………………………………………………………….65

فصل سوم (مراحل روش تحقیق)………………………………………………………………………………………………………70

3-1-جمع آوری نمونه ها …………………………………………………………………………………………………………………..71

3-2-مواد و تجهیزات مورد نیاز……………………………………………………………………………………………………………71

3_2_1_ مواد مصرفی…………………………………………………………………………………………………………………………71

3_2_2_تجهیزات مورد نیاز ………………………………………………………………………………………………………………..73

3_2_2_2 _تجهیزات مورد نیاز برای استخراج DNA…………………………………………………………………………….73

3_2_2_3_ تجهیزات برای PCR…………………………………………………………………………………………………………73

3_2_2_4_ تجهیزات برای هضم آنزیمی………………………………………………………………………………………………74

3_2_2_5_ تجهیزات الکتروفورز DNA و ساترن بلاتینگ……………………………………………………………………..74

3_2_2_6_ تجهیزات هیبریداسیون………………………………………………………………………………………………………74

3_2_2_7_ تجهیزات آشکار سازی………………………………………………………………………………………………………74

3_2_2_8_ تجهیزات مورد نیاز برای نانودراپ………………………………………………………………………………………74

موارد روش تحقیق …………………………………………………………………………………………………………………………….74

3_3_13_4_1_تهیه گسترش از نمونه و رنگ آمیزی……………………………………………………………………………..74

3_4_1_3_تفسیر نتایج گسترش…………………………………………………………………………………………………………..76

3_4_ 2_کشت نمونه ها……………………………………………………………………………………………………………………..76

3_4_2_ 1_صلایه کردن نمونه ها ………………………………………………………………………………………………….76

3_4_2_2_ آلودگی زدایی و هموژنیزاسیون ……………………………………………………………………………………..76

3_4_2_3_سانتریفیوژ و خنثی سازی PH……………………………………………………………………………………… 78

3_4_2_4_ کشت در لوله های لونشتاین – جانسون حاوی گلیسیرین و پیرووات……………………………….79

3_4_3_بررسی کشت لوله های لونشتاین – جانسون ………………………………………………………………………80

3_4_4_ رنگ آمیزی به روش فلئورو کروم …………………………………………………………………………………. 80

3_4_5_ انجام تست های بیوشیمیایی تعیین هویت ………………………………………………………………………….81

3_4_5_1_تست نیاسین ……………………………………………………………………………………………………………….82

3_4_5_2_ تست کاتالاز ……………………………………………………………………………………………………………. 82

3_4_ 6_کشت مجدد در لوله لونشتاین – جانسون…………………………………………………………………………….82

3_4_7_استخراجDNA ………………………………………………………………………………………………………………..83

3_4_7_1_آماده سازی مواد مصرفی برای استخراج DNA……………………………………………………………… 83

3_4_7_2_ كنترل و جمع آوری سلولهای باكتری رشد یافته ……………………………………………………………..83

3_4_7_3_مراحل استخراج DNA ………………………………………………………………………………………………..84

3_4_8_ارزیابی كیفیت و کمیتDNAاستخراج شده………………………………………………………………………….86

3_4_8_1_ارزیابی كفیت DNA استخراج شده………………………………………………………………………………..86

3_4_8_1_1_آماده سازی مواد مصرفی جهت ارزیابی کیفیDNAاستخراج شده…………………………….86

بافر تریس-بورات-EDTA یک برابر……………………………………………………………………………………………….86

بافر نمونه………………………………………………………………………………………………………………………………………86

ژل آگارز……………………………………………………………………………………………………………………………………….86

3_4_8_2_ارزیابی کمیت DNA استخراج شده برای انجام PCR و RFLP……………………………………… 88

3_4_8_3_ PCR بر اساس پروتکل WHO………………………………………………………………………………….. 90

3-4-8-3-1مراحل PCR روی نمونه های DNA استخراج شده………………………………………………………..91

3-4-9- الكتروفورز محصولPCR……………………………………………………………………………………………….. 92

RFLP …………………………………………………………………………………………………………………………………………92

3_4_10_هضم DNA کروموزمی به وسیله آنزیم Pvu II………………………………………………………………. 93

3_4_11_جداسازی قطعاتDNA به وسیله الکتروفورز……………………………………………………………………..94

3_4_12_ ساترن بلاتینگ ………………………………………………………………………………………………………………94

3_4_12_1_آماده سازی محلول های مورد نیاز ساترن بلاتینگ …………………………………………………………94

3_4_12_2_عمل آوری ژل قبل از بلاتینگ ……………………………………………………………………………………..96

3_4_12_3_بلاتینگ به روش موئینه ……………………………………………………………………………………………….96

3_4_12_3_عمل آوری غشا بعد از بلاتینگ ……………………………………………………………………………………97

3_4_13_تثبیت DNA برروی غشا ………………………………………………………………………………………………..98

3_4_14_تهیه پروب های هیبریداسیون و مک هیبریداسیون …………………………………………………………………..98

3_4_14_1_پروب PGRS ………………………………………………………………………………………………………………..99

3_4_14_2_به دست آوردن رقت مناسب برای پروبPGRS به روش مک هیبریداسیون………………………..99

3_4_15_شناسایی ……………………………………………………………………………………………………………………………100

3_4_16_دات بلاتینگ ……………………………………………………………………………………………………………………..101

3_4_17_پری هیبریداسیون و هیبریداسیون با پروب نشان دار با دیگوکسیژنین ……………………………………..102

3_4_17_1_مرحله پری هیبریداسیون ………………………………………………………………………………………………..102

3-4-17-2- مرحله هیبیریداسیون ………………………………………………………………………………………………………102

فصل چهارم(نتایج و بحث )…………………………………………………………………………………………………………….104

نتایج و بحث ……………………………………………………………………………………………………………………………………105

4-1- نمونه برداری ………………………………………………………………………………………………………………………….105

4-2- بررسی كشت لوله های لونشتاین– جانسون ………………………………………………………………………………..105

4-3-آزمون وجود IS6110 ………………………………………………………………………………………………………………106

4-3-1- نتایج واكنش PCR……………………………………………………………………………………………………………. 106

4-4- بررسی کمیت DNA استخراج شده برای هضم آنزیمی((RFLP…………………………………………………..107

4-5- بررسیDNA استخراج شده ……………………………………………………………………………………………………..108

4-6- نتایج هضم آنزیمی(RFLP)، بررسی الکتروفورز و تهیه عکس……………………………………………………….109

4-7- نتایج ساترن بلاتینگ ………………………………………………………………………………………………………………..110

فصل پنجم(نتیجه گیری و پیشنهادات)……………………………………………………………………………………………….114

پیشنهادات ……………………………………………………………………………………………………………………………………….125

منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………..126

منابع فارسی………………………………………………………………………………………………………………………………………126

منابع انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………………………………127

فهرست جدول ها

عنوان جدول صفحه

جدول1–1نامگذاری مایکوباکتریوم ها ……………………………………………………………………………………………………. 8

جدول1-2:لیست جدید تستهای رایج شیمیائی برای تمایز گونه­های مختلف کندرشدمایکوباکتریای …………….33

جدول 1- 3: لیست جدید تستهای رایج شیمیائی برای تمایز گونه­های مختلف سریع الرشدمایکوباکتریایی…..…………… 35

جدول 3-1: تعداد 65 نمونه عقده­های لنفاوی گاو ارسالی به موسسه سرم سازی رازی ……………………………….. 71

جدول 3-2: لیست مواد مصرفی …………………………………………………………………………………………………………… 72

جدول 3_3 : مواد متشکله در محیط کشت لونشتاین- جانسون ………………………………………………………………… 79

جدول 3-4: تست­های تعیین هویت مایکوباکتریوم­ها ………………………………………………………………………………. 81

جدول 3-5: برنامه دما، زمان و چرخه ترموسایکلر ………………………………………………………………………………….. 91

جدول 4-1- نمونه­های مورد استفاده به همراه الگوهای مشاهده شده و مکان جغرافیائی نمونه­ها ………………………….. 113

 

فهرست شکل ها

ی نوشته‌ها

1-2-3- کلمات و اصطلاحات کاربردی در MLVA 24

1-3-3- مزایای MLVA نسبت به سایر روش های ژنوتایپنگ 26

1-4- اهداف پایان نامه 31

1-4-1- هدف علمی پایان نامه 31

1-4-2- اهداف جزئی 31

1-4-3- اهداف کاربردی 31

1-5- فرضیه ها 31

1-6- سئوالات 31

1-7- ضرورت انجام تحقیق 32

1-8- جنبه جدید بودن و نوآوری تحقیق 32

1-9- واژه نامه ها و اصطلاحات فنی 32

فصل دوم مروری بر ادبیات تحقیق و پیشینه تحقیق 34

بررسی متون: 35

فصل سوم :مواد وروشها 39

3-1-مواد و تجهیزات 40

3-1-1-دستگاه ها ووسایل مورد نیاز: 40

3-1-2-مواد مصرفی مورد نیاز: 41

3-1-3- محیطهای کشت مورد استفاده: 41

3-2-ترکیبات و محلولهای مورد نیاز و فرمول ساخت آنها 42

3-2-1-تهیه محلول(%25) SDS: 42

3-2-2- محلول EDTA(5/0 مولار): 42

3-2-3-تامپون لیز کننده سلول 42

3-2-4- تامپون TE حاوی RNase 42

3-2-5- بافر(5X)TBE: 42

3-2-7- محلول فنل-کلروفروم-ایزو آمیلیک الکل(PCI): 43

3-3- روش انجام طرح: 44

3-3-1- نوع مطالعه: 44

3-3-2-جامعه مورد مطالعه: 44

3-3-3- جمع آوری اطلاعات: 44

3-3-4- انجام امور باکتریولوژیک: 44

3-4- ژنوتایپینگ ایزوله های سالمونلا با استفاده از روش MLVA 46

3-4-1- انجام آزمایش PCR جهت تکثیر لوکوس های VNTR 46

3-4-2- الکتروفورز محصولات VNTR 50

3-4-3- محاسبه ی اندازه و تعداد تکرار های VNTR 52

3-4-4-تجزیه و تحلیل داده های VNTR 52

فصل چهارم یافته ها 54

4-1- نمتایج حاصل از جمع آوری نمونه ها 55

4-2- نتایچ حاصل از استخراج ژنوم باکتریایی 57

4-3- نتایج حاصل از واکنش PCR جهت تکثیر لوکوس های VNTR 58

4-4- میزان تنوع الل های VNTR 74

4-5- آنالیز داده ها با استفاده از الگوریتم Minimum Spanning Tree 74

4-6- آنالیز داده های VNTR با استفاده از روش NJ 75

فصل پنجم :بحث ونتیجه گیری 77

5-1- بحث 78

5-2- نتیجه گیری و جمع بندی 91

منابع: 92

چکیده انگلسی 96

فهرست جداول و نمودارها

عنوان صفحه

جدول1-1، ویژگی های بیو شیمیایی سالمونلا 8

جدول 1-2، طبقه بندی نوین سالمونلا و میزان سروتایپ ها در زیر گونه ها 9

جدول 3-1، نام لوکوس ها و پرایمر های اختصاصی 47

جدول 3-2،مقادیرموردنیازجهت انجام واکنش هایPCRبرای تکثیرلوکوس­هایVNTR 48

جدول 3-3، برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر جهت تکثیر لوکوس های SENTR2،

SENTR3 و SE-7 49

جدول3-4،برنامه ریزی دستگاه­ترموسایکلرجهت تکثیرلوکوس­هایENTR6وSE-8 49

جدول 3-5، برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر برای تکثیر لوکوس SE-4 49

جدول 3-6، برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر جهت تکثیر لوکوس SE-10 50

جدول 3-7، برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر جهت تکثیر لوکوس SE-6 50

جدول 4-1، در فایل EXCEL 73

جدول 4-2، ضریب تنوع هانتر- گاتسون برای هر لوکوس محاسبه شده 74

نمودار 4-1، میزان فراوانی هر یک از سرو تایپ های سالمونلا در پژوهش حاضر 56

نمودار 4-2، میزان شیوع هر یک از سرو تایپ های سالمونلا در پژوهش حاضر 56

فهرست اشکال

عنوان صفحه

شکل 1-1 تصویر دکتر سالمون دامپزشک آمریکایی. 5

شکل1-2 باکتری سالمونلا 6

شکل 1-4مای شماتیک از VNTR ها 23

شکل 1-5 پروفایل اللی 24

شکل 1-6 آنالیز MLVA بوسیله MST 25

شکل 1-7، مزایای MLVA 26

شکل 1-8، مراحل انجام MLVA 27

شکل 4-1، میزان خلوص DNA نمونه ی شماره ی 53 57

شکل 4-2، میزان خلوص DNA نمونه ی شماره ی 24 57

شکل 4-3، لوکوس ENTR6 58

شکل 4-4، لوکوس SE4 59

شکل 4-5، لوکوس SE4 60

شکل 4-6، لوکوسSE6 61

شکل 4-7، لوکوس SE6 62

شکل 4-8، لوکوسSE7 63

شکل 4-9، لوکوسSE7 64

شکل 4-10، لوکوسSE8 65

شکل 4-11، لوکوسSE8 66

شکل 4-12، لوکوسSE10 67

شکل 4-13، لوکوسSE10 68

شکل 4-14، لوکوسSENTR2 69

شکل 4-15، لوکوسSENTR2 70

شکل 4-16، لوکوسSENTR3 71

شکل 4-17، لوکوسSENTR3 72

شکل 4-18، آنالیز داده های VNTR با استفاده از الگوریتم MST. 75

شکل 4-22، درختچه ی NJ 76

 

چکیده فارسی :

مقدمه:سالمونلاانتریکا سبب ایجاد سالمونلوزیس در انسان می شود.سالمونلاانتریکا سرووار انتریتیدیس، دومین سروتایپی می باشد که در سطح دنیا سبب ایجاد سالمونلوزیس می شود. تکنیک MLVA، یکی از روش های نوین ژنوتایپینگ جهت تمایز ایزوله های باکتریایی در همه گیری ها و یا تعیین قرابت فیلوژنتیکی این ایزوله ها می باشد. هدف از این پژوهش، ژنوتایپینگ سویه های سالمونلا انتریتیدیس جدا شده از نمونه های بالینی در تهران بر پایه ی روش MLVA.

مواد و روش ها:در این پژوهش، 51 ایزوله ی سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس از نمونه های بالینی در طی سال های 1387 تا 1389 در تهران جدا شدند. ایزوله های سالمونلا انتریتیدیس با استفاده از تکنیک های بیوشیمیایی و سرولوژیکی تایید شدند. جهت انجام تکنیک MLVA، از هشت لوکوس VNTR استفاده شد.

نتایج:10 ژنوتایپ متفاوت MLVA، در این پزوهش شناسایی شد. با استفاده از روش MST، 51 ایزوله یسالمونلاانتریتیدیس در 2 کلونال کمپلکس قرار گرفتند. همچنین با استفاده از تکنیک NJ، این ایزوله ها در دو کلاستر جای گرفتند.

بحث و نتیجه گیری:نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که تکنیک MLVA، یک روش قدرتمند و آسان می باشد و می توان از این تکنیک در اپیدمی ها ی ناشی ازسالمونلاانتریتیدیس استفاده نمود.

1-4- 4-4 پلی مورفیسم های افزایش هموسیستئین…………………………………………….. 19

1-4-4-5 پلی مورفیسم هایی در فیبرینوژن……………………………………………………………. 19

1-4-4-6 واریانت های میتوکندریایی………………………………………………………………………. 20

1-4-5 نقش آلودگی………………………………………………………………………………………………………… 21

1-5 عواملی که در آترواسکلروزیس جلوگیری می کند………………………………………………………. 21

1-5-1 استروژن ها…………………………………………………………………………………………………………… 21

1-5- 2 آنتی اکسیدان ها و عمکرد آنها………………………………………………………………………… 21

1-5-3 پرهیزهای غذایی………………………………………………………………………………………………….. 22

1-5-4 ورزش……………………………………………………………………………………………………………………. 23

1-6 سیستم RAAS و عملکرد آن……………………………………………………………………………………. 23

1-7 طبقه بندی ترکیبات RAAS و ویژگی شان…………………………………………………………….. 25

1-7-1 رنین……………………………………………………………………………………………………………………… 25

1-7-2 آنژیوتانسینوژن ، آنژیوتانسین 1 و 2…………………………………………………………………. 25

1-7-3 آنزیم مبدل آنژیوتانسین 1 (ACE ) و آنزیم مبدل آنژیوتانسین 2 ( ( ACE2. 26

1-7-4 رسپتورهای 1 و 2………………………………………………………………………………………………. 27

1-8 التهاب و سیستمRAAS…………………………………………………………………………………………….. 29

1-9 واریانت ها در ژن AGT……………………………………………………………………………………………….. 30

1-10 RAAS موضعی……………………………………………………………………………………………………….. 30

1-10-1 RAAS موضعی در قلب……………………………………………………………………………….. 31

1-11 تولید آنژیوتانسین بافتی……………………………………………………………………………………………… 31

1-11- 1 تولید آنژیوتانسین در جریان درونی ( بین شکاف )……………………………………….. 31

1-11-2 تولید آنژیوتانسین در غشاء سلولی……………………………………………………………………. 32

1-11-3 تولید آنژیوتانسین در داخل سلول…………………………………………………………………… 32

1-12 تاثیرات RAAS روی سلول های قلبی………………………………………………………………….. 33

1-13 تاثیرات RAAS روی جریان کرونری………………………………………………………………………. 34

1-14 تاثیرات RAAS روی جریان منظم شریان……………………………………………………………… 34

1-15 جداسازی و خالص سازی DNA……………………………………………………………………………… 36

1-16 واکنش زنجیره پلی مراز ……………………………………………………………………………………………. 38

1-16-1 مراحل اصلی در واکنش زنجیرۀ پلی مراز………………………………………………………. 39

1-16-2 طراحی پرایمر ………………………………………………………………………………………………….. 40

1-16-3 دمای اتصال پرایمر ……………………………………………………………………………………………. 41

1-17 الکتروفورز…………………………………………………………………………………………………………………….. 42

1-18 روش آشکارسازی اسیدنوکلئیک………………………………………………………………………………… 43

1-19 یافتن جهش ها با روش PCR – SSCP………………………………………………………………. 44

1-20 تعیین توالی بازهای DNA ………………………………………………………………………………………. 46

1-21 مروری بر مطالعات گذشته…………………………………………………………………………………………… 48

1-22 اهداف تحقیق……………………………………………………………………………………………………………….. 52

2 فصل دوم : مواد و روش ها……………………………………………………………………………………………………….. 53

2-1 مشخصات بیماران…………………………………………………………………………………………………………… 54

2-2 بافرها و محلول ها…………………………………………………………………………………………………………… 55

2-2-1 روش تهیه EDTA……………………………………………………………………………………………. 55

2-2-2 روش تهیه الکل 75/…………………………………………………………………………………………… 55

2-2-3 روش تهیه پرایمرها………………………………………………………………………………………………. 55

2-2-4 روش تهیه اتیدیوم بروماید………………………………………………………………………………….. 55

2-2-5 روش تهیه بافر TBE 10X……………………………………………………………………………… 56

2-2-6 روش تهیه بافر TBE ./5X……………………………………………………………………………… 56

2-2-7 روش تهیه لودینگ بافر PCR…………………………………………………………………………… 56

2-2-8 روش تهیه لودینگ بافر SSCP………………………………………………………………………… 57

2-2-9 روش تهیه محلول NAOH………………………………………………………………………………. 57

2-2-10 روش تهیه آمونیوم پرسولفات 10/………………………………………………………………….. 57

2-3 کیت استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………… 57

2-4 تکنیک PCR………………………………………………………………………………………………………………… 59

2-4-1 شرایط تکثیر قطعه مورد نظر……………………………………………………………………………… 60

2-4-2 مراحل PCR………………………………………………………………………………………………………. 61

2-5 الکتروفورز ژل آگاروز……………………………………………………………………………………………………… 61

2-6 آنالیز ژل SSCP…………………………………………………………………………………………………………… 62

2-7 آماده سازی ژل پلی آکریل آمید…………………………………………………………………………………… 62

2-8 مراحل رنگ آمیزی ژل SSCP…………………………………………………………………………………… 63

3 فصل سوم : نتایج…………………………………………………………………………………………………………………………. 64

4 فصل چهارم : بحث و نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………… 72

4-1 نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………………………. 76

4- 3 پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………………… 77

4-4 مراجع……………………………………………………………………………………………………………………………… 78

عنوان فهرست شکل ها صفحه

شکل 1-1: مکانیسم پیشنهادی در وقوع آترواسکلروزیس……………………………………………………………….. 10

شکل 1-2 : خلاصه ای از تاثیرات HDL-C………………………………………………………………………………….. 15

شکل 1-3 : کل عملکرد سیستم RAAS………………………………………………………………………………………. 24

شکل 1-4 : مسیر کلاسیک و غیر کلاسیک RAAS ………………………………………………………………….. 28

شکل 1-5 : ساختار پروتیین های درگیر در سیستم RAAS …………………………………………………….. 29

شکل 1-6 : طرح پیشنهادی تولید آنژیوتانسین 1 و 2 درقلب……………………………………………………….. 33

شکل 1-7 : تاثیرات آنژیوتانسین 2 روی قلب………………………………………………………………………………….. 35

شکل 1-8 : مراحل زنجیره پلی مراز…………………………………………………………………………………………………. 40

شکل 1-9 : ژل الکتروفورز ………………………………………………………………………………………………………………… 43

شکل 1-10 : روش SSCP …………………………………………………………………………………………………………….. 46

شکل 3-1 : تصویری از الکتروفورز محصول PCR نمونه های مورد مطالعه بر روی ژل آگاروز…. 65

شکل 3-2 : تصویری از آنالیز SSCP روی ژل پلی آکریل آمید…………………………………………………… 66

شکل 3-3 : تشخیص جهش 4360C>T با استفاده از تکنیک SSCP و تعیین توالی………… 67

شکل 3-4 : تشخیص جهش 4543T>C با استفاده از تکنیک SSCP و تعیین توالی………… 67

شکل 3-5 : هم ردیفی نوکلئوتید برای تغییر 4360C>T……………………………………………………………. 68

شکل 3-6 : هم ردیفی نوکلئوتید برای تغییر4543T>C…………………………………………………………….. 65

شکل 3-7 : هم ردیفی پروتیین برای تغییر T207M …………………………………………………………………. 66

شکل 3-8 : هم ردیفی پروتیین برای تغییر M268T …………………………………………………………………. 66

شکل 3-9 : نتیجه Blastn برای جهش 4360C> T همولوگ با حیوان pan paniscus… 67

شکل 3-10 : نتیجه Blastn برای جهش 4543T> C همولوگ با حیوان pan paniscus….. 67

عنوان فهرست جداول صفحه

جدول 1-1 : فعالیت های رسپتور نوع یک و دو آنژیوتانسین 2…………………………………………………….. 28

جدول 1-2 : مواد لازم جهت تهیه ژل SSCP با درصدهای مختلف……………………………………………. 45

جدول 2-1 : مشخصات بیماران…………………………………………………………………………………………………………. 55

جدول 2-2 : مشخصات پرایمر در این مطالعه………………………………………………………………………………….. 59

جدول 2-3 : مقدار مواد مورد استفاده در مخلوط PCR در حجم Lµ25………………………………….. 60

چکیده :

آترواسکلروزیس “بیماری اصلیعروق کرونرقلب” بیماری است که بر روی شریانهای بزرگ و متوسط بدن تاثیر میگذارد. انواع متفاوتی از سلول ها، اندام ها و شماری از فرآیندهای فیزیولوژیکی در این عارضه درگیر هستند. سیستمRAAS یک سیستم مهم در تنظیم فشارخون، آب و الکترولیت های بدن انسان و سایر موجودات زنده است. مطالعه وسیعی روی واریانت های ژن های کد کنندۀ این سیستم، که باعث گسترش فشار خون و بیماری آترواسکلروزیس می گردد، صورت گرفته است. ژنAGTنخستین ژنی است که با فشارخون بالا ارتباط دارد و واریانت های این ژن احتمالا با افزایش فشارخون و گسترش آترواسکلروزیس مرتبط هستند.

این مطالعه بر روی دومین اگزون ژنAGT(آنژیوتانسین) بر روی 70 فرد مبتلا به آترواسکلروزیس انجام گرفت. پس از استخراج DNA از نمونه ها و PCR ، ژن تکثیر شده با روش SSCP⁵برای یافتن پلی مورفیسم یا تغییرات جدید در ژن، مورد بررسی قرار گرفت. هفت مورد از نمونه های دارای شیفت باندی برای تعیین ماهیت تغییر، تعیین توالی شدند. در این بررسی دو جهش در موقعیت های 4543T>C و 4360C>T مشخص شد، که در جهش اول متیونین موقعیت 268 به تروئونین (M268T) و در جهش دوم در کدون 207 اسیدآمینه تروئونین به متیونین (T207M) تبدیل می گردد. این تغییرات احتمالا افزایش غلظت های پلاسماییAGTو افزایش فشارخون را به همراه دارند.

کلمات کلیدی:آترواسکلروزیس، آنژیوتانسینوژن، PCR-SSCP، موتاسیون، آنژیوتانسین 2، فشار خون بالا

به دام افتاده در آنها را آزاد میکند………………………………………………………………………………..22

2-5-3 تولید گازهایی از قبیل متان، دی اکسیدکربن،هیدروژن و نیتروژن که نفت را از فضاهای

مرده به خارج می رانند………………………………………………………………………………………………22

2-6 تجزیه بیولوژیک نفت………………………………………………………………………………………….23

2-7 اثرات سوء آلودگی های نفتی تحت تاثیر برخی عوامل مهم به شرح زیر قرار میگیرند………23

2-7-1 حجم نفت……………………………………………………………………………………………………..23

2-7-2 نوع نفت………………………………………………………………………………………………………..24

2-8 آلودگی های نفتی………………………………………………………………………………………………24

فصل سوم

روش کار

3-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………………26

3-2 هدف کاربردی این بخش……………………………………………………………………………………27

3-3 دستگاه ها و وسایل مورد استفاده…………………………………………………………………………..27

3-4 مواد مورد استفاده………………………………………………………………………………………………28

3-5 روش کار…………………………………………………………………………………………………………29

3-5-1 مرحله اول……………………………………………………………………………………………………31

3-5-2 مرحله دوم روش تلقیح و کشت باکتری ……………………………………………………………32

3-5-3 مرحله سوم روش رنگ آمیزی منفی…………………………………………………………………33

3-5-4 مرحله چهارم روش رنگ امیزی گرم………………………………………………………………..34

3-5-5 مرحله پنجم شروع غربالگری پس از هفته هشتم………………………………………………….34

3-5-6 مرحله ششم محیط کشت اختصاصی جامد برای جداسازی باکتری احیا کننده نیترات .35

3-5-7 مرحله هفتم روش تهیه سریال رقت…………………………………………………………………..35

3-6 تست احیای نیترات……………………………………………………………………………………………37

3-7 تست CHN ……………………………………………………………………………………………………37

3-7-1 خلاصه ای از ویژگی های تست CHN ……………………………………………………………38

3-8 غربالگری در محیط کشت غنی شده BHI ……………………………………………………………39

فصل چهارم

نتایج

4-1مشاهدات میکروسکوپی……………………………………………………………………………………41

4-2 غنی سازی……………………………………………………………………………………………………..41

4-3 نتایج کشت اختصاصی نیترات براث……………………………………………………………………42

4-4 نتایج تست احیای نیترات………………………………………………………………………………….42

4-5 نتایج کشت در محیط BHI………………………………………………………………………………43

4-6 نتایج تست CHN …………………………………………………………………………………………..44

4-7 تفسیر نتایج تست CHN ………………………………………………………………………………….45

فصل پنجم

بحث و نتیجه گیری

5-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………….48

5-2 بیوتکنولوژی و اهمیت بیوتکنولوژی نفت…………………………………………………………..48

5-3 بحث…………………………………………………………………………………………………………..52

5-4 نتیجه گیری………………………………………………………………………………………………..55

5-5 پیشنهادات………………………………………………………………………………………………….56

پیوست الف ………………………………………………………………………………………………………57

منابع فارسی……………………………………………………………………………………………………….58

منابع انگلیسی……………………………………………………………………………………………………..58

فهرست جداول

جدول 1-1 نسبت ترکیبی نفت خام………………………………………………………………………………………………………..3

جدول 4-1 مقادیر آنالیز عنصری در نمونه شاهد…………………………………………………………………………………..44

جدول 4-2 مقادیر آنالیز عنصری در نمونه MSM ……………………………………………………………………………..45

فهرست نمودار

نمودار1-1 قیمت های نفت خام به صورت واقعی و صوری …………………………………………………………………10

چکیده

حضور وسیع باكتریهای بی هوازی و آركی ها در سیستم نفتی زیرزمین به وسیله بسیاری از مطالعات مورد بررسی قرار گرفته است. فرآیندهای آرام بی هوازی در زیر زمین فراوان می باشد كه به همراه تجزیه زیرزمینی هیدروكربن ها كه در ارتباط با احیای نیترات و متانوژنز و یا در مخازن نفتی در جائیكه وفور سولفات وجود دارد، به همراه احیای سولفات است. میكروارگانیزم هایی كه قادر به استفاده از نفت خام به عنوان تنها منبع انرژی و كربن می باشند، با تولید یكسری محصولات جانبی و یا با شكستن تركیبات هیدروكربنی سنگین كمك شایانی در رفع مشكلات موجود در صنعت نفت کرده اند.

در این مطالعه باکتری هایی از منطقه ی لاوان ، سکوی سلمان واقع در استان خوزستان جداسازی شدند که دارای قابلیت استفاده ازهیدروکربنهای ازته به عنوان تنها منبع کربن، ازت و انرژی بطور موثر بود. تحقیقات نشان می دهد که این باکتریهای بی هوازی قادرند برخی ترکیبات کمپلکس ، حلقوی و خطی نفت خام را تجزیه کرده و از ازت موجود در این ترکیبات استفاده کنند. هدف از این مطالعه بررسی باکتری های مصرف کننده نفت خام به عنوان تنها منبع انرژی ، ازت و کربن و تجزیه ی آن به مواد قابل بازیافت و تعیین شرایط بهینه ی رشد آنها می باشد. نمونه ها پس از نمونه گیری در کمترین زمان ممکن به آزمایشگاه منتقل شدند و در محیط های رشد مناسب کشت داده شدند. در ابتدا برای بی هوازی کردن محیط کشت از روش Hungate استفاده کرده و با استفاده از serum bottle وcrimped seal کردن و در نهایت تنظیم گاز، محیط رشد باکتری ها به صورت بی هوازی تهیه شدند. نمونه ها در محیط کشت BSM کشت داده شدند سپس به دلیل fastidious بودن باکتری های بی هوازی در محیط کشت MSM که یک محیط حداقل نمکی می باشد و حاوی 1٪ نفت خام استریل به عنوان منبع کربن بود کشت صورت گرفت. غنی سازی نمونه ها با افزودن 0.01٪ گلوکز و نیز محلول ویتامین ها و Trace mineral به محیط کشت انجام شد. استفاده از محیط کشت اختصاصی نیترات براث برای کشت باکتری ها در این مرحله صورت گرفت تا از سایر باکتری های بی هوازی رشد کرده در محیط جدا شوند. در محیط نیترات براث پس از مشاهده ی تغییر رنگ محیط کشت از وجود باکتری های تجزیه کننده ی نیترات (NRB ) اطمینان حاصل شد. در مراحل بعد برای جدا کردن کلنی به دلیل عدم دسترسی به گلاو باکس میکروبی کشت در محیط کشت شیب دار با استفاده از serum bottle و جوشاندن محیط کشت برای خارج کردن اکسیژن محلول در آن و تنظیم گاز با purge کردن گاز ازت در آن به صورت بی هوازی کشت انجام شد. اضافه کردن محلول ویتامین ها نیز در همه مراحل کشت انجام شد. تست احیای نیترات جهت انتخاب بهترین سویه در شرایط بی هوازی و رشد در محیط غنی شده انجام شد و جهت بررسی عملکرد باکتری روی ساختار نفت و چگونگی تغییرات ایجاد شده در ساختار نفت توسط باکتری های NRB جدا شده، از تست CHN استفاده شد تا کاهش مقدار ازت مشخص گردد.

کلمات کلیدی : نفت خام،باکتری احیا کننده نیترات ، بی هوازی ، پر نیاز ، باکتری احیا کننده سولفات

فصل اول

کلیات

• مقدمه

نفت خام کمپلکس ترکیبی است که بطور عمده از هیدروکربن های متغیر اشباع شده و اشباع نشده تشکیل شده است. بیوتکنولوژی نفت مجموعه ای از متد و روش ها برای تولید، تغییر و اصلاح فراورده ها و تولید میکروارگانیسم ها برای کاربردهای ویژه است. مثلا تحقیقات در زمینه ی MEOR (Microbial Enhanced Oil Recovery) بمنظور افزایش برداشت از چاه های نفت به روش های میکروبی به منظور استخراج بیشتر نفت می باشد . میکروارگانیسم ها ابزار اصلی تحقیق در زمینه ی بیوتکنولوژی هستند که شامل باکتری ها، قارچ ها، جلبک ها ومیکروب هایی که در حوزه ی نفت در فرآیندهای پالایش-انتقال-تغییر و تبدیل مواد ،محیط زیست و خوردگی از ابزارهای اصلی بشمار می روند می باشند. که این منوط به حفظ و نگهداری میکروارگانیسم ها بدون کمترین تغییر ژنتیکی میباشد. در بخش مطالعات مخزن در ایران برای اولین بار مطالعه ی مخزن آزادگان با یک شرکت نروژی Sintef انجام شده روی سه میدان بزرگ نفت مارون، بی بی حکیمه و اهواز مشترک با شرکت نروژی استات اویل مطالعه شده. از 6/3 میلیون بشکه نفت 5/1 میلیون بشکه از این سه میدان تامین شده است. مطالعه جامع میدان (F.F.S ) و توسعه ی میدان ( M.D.D ) روی این زمینه فعالیت می کنند. مطالعه ی دیگر با شرکت روسی تاتنفت در زمینه ی ازدیاد برداشت به روش میکروبی میباشد که کار بزرگ و منحصر به فردی است. در ایران 3 منطقه ی نفتی وجود دارد: زاگرس ، منطقه ی ایران مرکزی و منطقه ی کپه داغ که ایران مرکزی در فارس و شمال بندر عباس و کپه داغ در شرق گرگان و شمال شرق ایران قرار دارد. نفت خام ایران متشکل از مواد آلی است که قسمت اعظم آن کربن و هیدروژن همراه با مقادیر کم گوگرد ، ازت ، اکسیژن و مقادیر جزئی فلزات از جمله نیکل ، وانادیوم و…. میباشد. ( جدول 1-1 )

(جدول 1-1) نسبت ترکیبی نفت خام

ی نوشته‌ها

فصل دوم (مروری بر ادبیات تحقیق و پیشینه آن)……………………………………………………………………………….7

2-1-کلیات (تاریخچه سابقه مطالعه و تحقیق کفزیان در ایران و جهان ………………………………………………….8

2-2-معرفی استان سمنان…………………………………………………………………………………………………………………9

2-3-چشمه های استان سمنان ……………………………………………………………………………………………………….11

2-4-معرفی مهم ترین راسته ها و خانواده های ماکروبنتوزهای آبهای شیرین ایران………………………………….12

2-5-راسته بهاره ها (پلکوپترا)……………………………………………………………………………………………………….12

2-6-راسته یکروزه ها(افموپترا)………………………………………………………………………………………………………16

2-7-راسته دوبالان (دیپترا)…………………………………………………………………………………………………………….23

2-8-بال موداران(تریکوپترا)…………………………………………………………………………………………………………..32

2-9-راسته ناجورپایان(آمفی پودا)…………………………………………………………………………………………………..37

2-10-رده تورکیان……………………………………………………………………………………………………………………….38

فصل سوم (مواد و روش کار)………………………………………………………………………………………………………….40

3-1-نمونه برداری………………………………………………………………………………………………………………………..41

3-2-وسایل نمونه برداری کفزیان…………………………………………………………………………………………………..41

3-3-نگهداری نمونه ها ………………………………………………………………………………………………………………..43

3-4-شناسایی ماکروبنتوزها……………………………………………………………………………………………………………43

3-5-دانه بندی رسوبات و تعیین موادآلی………………………………………………………………………………………….43

3-6-تعیین موقعیت ایستگاههای مطالعاتی………………………………………………………………………………………..44

3-7-منطقه مورد بررسی………………………………………………………………………………………………………………..47

3-8-عملیات آزمایشگاهی……………………………………………………………………………………………………………..52

3-9-سنجه یا معیار جمعیتی………………………………………………………………………………………………………….52

3-10-شاخص ها…………………………………………………………………………………………………………………………53

فصل چهارم (نتایج)……………………………………………………………………………………………………………………….56

4-1-رده بندی نمونه های موجود……………………………………………………………………………………………………57

فصل پنجم (بحث)………………………………………………………………………………………………………………………99

5-1-بحث و نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………………..100

5-2-پیشنهادها…………………………………………………………………………………………………………………………..107

منابع…………………………………………………………………………………………………………………………………………109

منابع فارسی ………………………………………………………………………………………………………………………………109

منابع لاتین………………………………………………………………………………………………………………………………….113

چکیده انگلیسی …………………………………………………………………………………………………………………………121