2-1-8- كارآفرینی روستایی.. 23

2-1-9- توسعه. 23

2-2-1- تاریخچه و مبانی نظری مطالعات فقر. 26

2-2-2- دیدگاه های مرتبط با کارآفرینی.. 30

2-2-3- دیدگاه جامعه شناختی و جمعیت شناختی.. 30

2-2-4- دیدگاه روانشناختی.. 31

2-2-5- دیدگاه اقتصادی (کارآفرینی درون تئوری اقتصادی) 31

2-2-6- دیدگاه توسعه ای و محیطی.. 33

2-2-7- دیدگاه نهادی.. 33

2-3-1- دیدگاه روانشناختی.. 34

2-3-2- دیدگاه جامعه شناختی.. 34

2-3-3- دیدگاه علوم سیاسی.. 35

2-4-1- رویکردهای نظری توانمندسازی.. 36

2-4-2- فرآیند توانمندسازی.. 37

2-4-3- چارچوب توانمندسازی.. 38

2-4-4- حوزه های توانمندسازی مددجویان.. 40

2-4-5- ساماندهی افراد و ایجاد تشکل.. 42

2-4-6- رویكردهای سازمانی.. 43

2-4-7- نظریه های گونه ی اول. 44

2-4-8- نظریه های گونه ی دوم. 45

2-4-9- نظریه های گونه ی سوم. 45

2-4-10- نظریه های گونه ی چهارم. 45

2-4-11- نوع شناسی کمیته امداد امام خمینی (ره) 46

2-4-12- اهمیت موضوع توانمندسازی در کمیته امداد امام خمینی (ره) 48

2-4-13- جایگاه کمیته امداد در توانمندسازی مددجویان تحت پوشش این نهاد. 49

2-4-14- توانمندسازی مددجویان.. 50

2-4-15- عوامل موثر بر توانمندسازی خانواده های تحت حمایت کمیته امداد. 51

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1-1- موقعیت، حدود و وسعت منطقه مورد مطالعه. 56

3-1-2-توپوگرافیو ژئومورفولوژی.. 58

3-1-3- اقلیم. 59

3-1-4- منابع آب.. 64

3-2-1- جمعیّت و ویژگیهای آن.. 70

3-4-1- روش پژوهش…. 76

3-4-2- جامعه آماری و تعداد نمونه. 77

3-4-3- شاخصهای تحقیق.. 80

3-4-4- روش و ابزار گردآوری دادهها و اطلاعات.. 83

3-4-5- شیوه تجزیه و تحلیل داده‎ها 83

3-4-6- مدل تصمیم‎گیری چند شاخصه (MCDM) 84

3-4-7- فرآیند تحلیل سلسله مراتبی (AHP) 86

3-4-8- روایی و پایایی ابزار تحقیق.. 90

فصل چهارم: یافته­های تحقیق

4-1-1- وضعیت سنی پاسخگویان.. 94

4-1-2- وضعیت جنسی.. 96

4-3-1- وضعیت سواد. 96

4-2-1- علل قرار گرفتن تحت پوشش کمیته امداد. 98

4-2-2- روند تغییرات خانوارهای تحت پوشش کمیته امداد. 99

4-3-3- شدت اثرات موانع یا محدودیتهای مطرح در توانمندسازی خانوارهای روستایی………………………..103

فصل پنجم: جمع­بندی و نتیجه گیری

فصل ششم: فهرست منابع

1-6- منابع ……………………………………………………………………………………………………………………………….121

2-9-2- عفونت حفره دهانی.. 31

2-9-3- عفونت مجاری تنفسی.. 31

2-9-4- سرطان مقعد. 31

2-9-5- سرطان گردن رحم. 32

2-9-6- HPV در کودکان. 34

2-10- اپیدمیولوژی.. 35

2-11- مطالعه سرطان گردن رحم و عفونت پاپیلوماویروس در ایران. 37

2-12- تشخیص…. 38

2-13- پاسخ ایمنی در برابر HPV.. 40

2-13-1- ایمنی اختصاصی.. 41

2-13-1- 1- پاسخ ایمنی هومورال. 41

2-13-1-2- پاسخ ایمنی سلولی.. 42

2-13-2-پاسخ ایمنی ذاتی.. 43

2-14- درمان. 44

2-15- پیشگیری.. 45

2-16- واکسیناسیون. 46

2-17- واکسیناسیون علیه HPV.. 47

2-17-1- واکسن های نوترکیب با ناقل زنده 50

2-17-2-واکسن های پروتئینی و پپتیدی.. 51

2-17-3-ذرات شبه ویروس( VLPs). 52

2-17-4- DNA واکسن ها 56

-5-17-2 واکسن های خوراکی.. 59

2-18- اهمیت پاسخ های ایمنی هومورال و واکسن های پیشگیری کننده 63

2-19- اهمیت پاسخ های ایمنی سلولی و واکسن های درمان کننده 64

2-20-ایمونوانفورماتیک در علم واکسن.. 65

2-20-1-ﭘﺎﯾﮕﺎه های داده ها (Databases) 68

2-20-1-1- پایگاه های داده اﯾﻤﻮﻧﻮﻣﯿﮏ… 68

2-20-1-2- ﭘﺎﯾﮕﺎه داده اپی توپ ها و ﺳﺎﺧﺘﺎرهای آﻧﺘﯽ ﺑﺎدی ﺑﺮای ﺳﻠﻮل B.. 69

2-20-1-3- ﭘﺎﯾﮕﺎه داده اﭘﯽ ﺗﻮپ ﺳﻠﻮلT.. 72

2-20-2-اﺑﺰارها و اﻟﮕﻮرﯾﺘﻢ های ﻣﺘﻨﻮع ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ.. 73

2-20-2-1-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮل B.. 74

2-20-2-2-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮل B ﺑﺮ ﻣﺒﻨﺎی ﻣﯿﻞ ذاﺗﯽ آﻣﯿﻨﻮاﺳﯿﺪ. 75

2-20-2-3-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ ﺳﻠﻮلB ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از روش های ﯾﺎدﮔﯿﺮی ﻣﺎﺷﯿﻦ.. 77

2-20-2-4-روش ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﻏﯿﺮ پیوسته ﺳﻠﻮل B.. 78

2-20-2-5-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ های ﺳﻠﻮل T.. 82

2-20-3- ﮐﺎرﺑﺮدهای ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ.. 83

2-21-واکسن همگانی (Universal vaccine) 84

2-22- واكسن سازی معكوس Reverse Vaccinology.. 84

2-23-ادجوانت ها 86

2-24-به دست آوردن قطعه DNA یاژن مورد نظر. 89

2-25-کلونینگ ژن. 90

2-25-1- مراحل کلون کردن ژن. 90

2-25-2- میزبان کلونینگ… 90

2-26- آنزیم های محدود کننده 91

2-26-1-آنزیم لیگاز. 91

2-27- حامل های کلونینگ… 91

2-28-غربالگری وجود ژن. 92

2-29-انواع سیستم های بیانی و مزیت اشرشیاکلی.. 92

2-30-وکتورهای بیان کننده 94

2-30-1- وکتورهای بیان کننده سیستمpET.. 94

2-31-وکتورهای پلاسمیدی.. 96

2-32-توالی شاین دلگارنو(SD)(Shine-delgarno) 97

2-33-استراتژی بیان در سیستمpET.. 97

2-34-نقشه و مشخصات وکتورpET28a(+) 98

2-35-تولید پروتئین نوترکیب.. 99

2-36-مراحل تهیه یک پروتئین نوترکیب در اشرشیاکلی.. 99

2-37-بیان ژن و تولید پروتئین نوترکیب در E.coli. 100

2-38-راهکارهای افزایش تولید پروتئین نوترکیب در اشرشیاکلی.. 101

2-39-تخلیص پروتئین نوترکیب.. 102

2-40- فرضیات و هدف از انجام تحقیق.. 103

2-40-1 -فرضیات.. 103

2-40-2 – هدف از انجام تحقیق.. 103

فصل سوم: مواد و روش ها…104

3-1-مجموعه توالی های پروتئین.. 105

3-2-پیش بینی اپی توپ سلول B.. 105

3-3-قابلیت دسترسی اپی توپ به حلال. 106

3-4-محل های N-Glycosylated.. 107

3-5-ترجمۀ معکوس اولین ساختمان. 107

3-6-بهینه سازی کدون، تعیین کدون های نادر (rare codon) 108

3-7-تولید ساختار واکسن.. 109

3-8-تهیه باکتری مستعد شده 109

3-9-ترانسفورم نمودن پلاسمید بیانی.. 111

3-10- SDS-PAGE. 114

3-11-بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی در مقیاس کم. 115

3-12-کشت انبوه سویه بیانی و تهیه جسم سلولی.. 117

3-13-بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی در مقیاس بالا. 117

3-14-الکتروفورز پروتئین در ژل آکریل آمید در حضور SDS. 119

3-15- رنگ آمیزی ژل با کوماسی بلوR-350.. 122

3-15-1- روش تهیه محلول ها 122

3-15-2- روش رنگ آمیزی.. 123

3-16- وسترن بلاتینگ… 123

3-16-1- انتقال در تانک… 124

3-16-2- مسدودسازی غشا 125

3-16-3- تشخیص با آنتی بادی.. 125

3-17-تخلیص پروتئین با یون های نیکل متصل به ماتریکس NTA نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی روی ماتریکس Ni-NTA.. 126

3-18-بهینه سازی تخلیص…. 127

3-19-ارزیابی پروتئین تخلیص شده با روش SDS-PAGE. 127

3-20-تخلیص انبوه پروتئین نوترکیبHPV واکسن کاندید چند اپی توپی.. 128

3-21- دیالیز و تغلیظ پروتئین HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده 134

3-22- ارزیابی پروتئین تخلیص شده 136

3-23- روش برادفورد. 136

3-23-1- طرز تهیه محلول های مورد نیاز. 137

3-23-2- طرز تهیه محلول برادفورد. 137

3-23-3- طرز تهیه محلول استاندارد پروتئین ذخیره با غلظت 1000μic/ml. 137

3-23-4- طرز تهیه محلول استاندارد پروتئین با غلظت 10,100mic/ml 137

3-24- بررسی خلوص پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده با روش SDS-PAGE. 138

3-25-بررسی پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده با وسترن بلات.. 138

3-26-پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی.. 139

3-27- حیوان آزمایشگاهی.. 139

3-28-ادجوانت فروند ناقص…. 139

3-29-گروه های تجربی و واکسیناسیون موش ها 140

3-30- بررسی پاسخ های همورال. 141

3-30-1- بررسی سطح آنتی بادی توتال در رقت های مختلف سرمی.. 142

فصل چهارم: نتایج ….144

4-1-پیش بینی اپی توپ سلول B.. 145

4-2- قابلیت دسترسی اپی توپ ها 149

4-3-محل های N-Glycosylated.. 151

4-4-انتخاب اپی توپ ها و اتصال پپتیدها برای تولید ساختمان واکسن.. 153

4-5-ارزشیابی توالی پروتئین.. 155

4-6-ترجمۀ معکوس ساختمان اول. 157

4-7-نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی با روش SDS-PAGE.. 159

4-8- نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی با روش وسترن بلاتینگ… 161

4-9-نتایج بررسی پاسخ های ایمنی همورال. 162

4-9-1- نتایج بررسی سطح آنتی بادی توتال اختصاصی واکسن کاندید. 162

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری………164

5-1- بحث و نتیجه گیری.. 165

5-2-پیشنهادات و چشم اندازها 168

References …169

ضمائم:

فهرست اشکال :

شکل 2-1.ساختمان ویروس پاپیلوما……………………………………………………………………………………………………………………….16

شکل 2-2. نقشه ژنومی در پاپیلوما ویروس……………………………………………………………………………………………………………..18

شکل2-3.نمایی از تکثیر پاپیلوما ویروس در ارتباط با عملکرد پروتئین های غیرساختاری……………………………………………..18

شکل2-4. مواردی از عفونت پاپیلوما ویروس ها……………………………………………………………………………………………………..30

شکل 2-5. مراحل اصلی پاپیلوماویروس و محل آنها در اپی تلیوم اسکوآموس…………………………………………………………….41

شکل 2-6. ساختار شماتیک و توالی ژنی ناحیه بیانی pET-28a(+)…………………………………………………………………………..99

شکل4-1. نمایش انتخاب اپی توپ ها با میزان بالای قابلیت دسترسی به حلال ، در اینجا ساختمان های پروتئین L1 از سروتایپ های HPV 11, 16, 18, 31, 45 نشان داده شده اند…………………………………………………………………………………151

شکل4-2.طراحی اولیه ساختار اپی توپ های منتخب ، E1 تا E10 برای پروتئین L1 و E11 تا E20 برای L2 طراحی شدند………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..155

شکل 4-3. آنالیز آنتی ژنی سیتی ساختمان توسط برنامه پروتئان آنالیز ،. این نتایج نشان داد که قسمت های اصلی ساختار پروتئنی جدید خصوصیات هیدروفیلیک دارد، بنابراین توان آنتی ژنیک را دارد……………………………………………………………157

شکل4-4. توالی ترجمه شده معکوس برای بهینه سازی کدون و کدون نادر برای افزایش سطح بیان ژن و انحلال پذیری پروتئین ارزشیابی شد. به این منظور OPTIMIZER و سرورهای GenScript با هم بکار برده شدند…………………..158

ششکل 4-5. نتایج ترجمه معکوس و بهینه سازی …………………………………………………………………………………………………159

شکل 4-6.نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی و مشاهده باند در محدوده 45 کیلو دالتون……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….160

شکل4-7. pET28a(+)/HPV، SDS-PAGE قبل و بعد از تخلیص پروتئین ، نتیجه تخلیص به صورت تک باند و در محدوده 45KD است………………………………………………………………………………………………………………………………………….160

شکل4-8. نتایج Western Blot و SDS-PAGE ، نتیجه در محدوده 45KD است……………………………………………..161

شکل4-9. SDS-PAGE بعد از تخلیص انبوه پروتئین ، نتیجه به صورت تک باند و در محدوده 45KD است…………..162

فهرست جداول:

جدول 2-1. خصویات واکسن چهار ظرفیتی و دوظرفیتی HPV ……………………………………………………………………………….53

جدول 2-2.واکسن های پیشگیری کننده در حال توسعه……………………………………………………………………………………………61

جدول2-3.واکسن های درمانی HPV درحال توسعه………………………………………………………………………………………………..62

ﺟﺪول2-4.ﭘﺎﯾﮕﺎه داده اپی توپ ها و ﺳﺎﺧﺘﺎرهای آﻧﺘﯽ ﺑﺎدی ﺑﺮای ﺳﻠﻮل B ﻣﺨﺘﻠﻒ ……………………………………………………..72

ﺟﺪول 2-5. ﺗﻌﺪادی از اﺑﺰارهای ﻣﻮﺟﻮد جهتﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮل B ………………………………………………………….75

ﺟﺪول 2- 6 . ﻣﻨﺎﺑﻊ ﻣﻮﺟﻮد جهتﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮلB ……………………………………………………………………………80

جدول3-1. سکانس های استفاده شده برای طراحی ساختار کاندید یونیورسال واکسن HPV……………………………………..105

جدول3-2.گروه بندی موش های مورد مطالعه………………………………………………………………………………………………………141

جدول 4-1. پیش بینی اپی توپ سروتیپ های HPV 11.16.18, 31, 45 با استفاده از سرور BCPREDS……………….149

جدول 4-2.فهرست نتایج مدل سازی همولوژی برای پروتئین های L1 از HPV نوع های 11، 16، 18، 31 و 45………..150

جدول4-3. امتیاز و محدوده آسپاراژین در توالی اپی توپ ها را نشان می دهد…………………………………………………………153

هیدروکلراید…………………………………………………………………………………..16

1-7-5-3- میترامایسین………………………………………………………………………………………………………………17

1-7-5-4 بلئومایسین سولفات…………………………………………………………………………………………………….19

1-7-5-5- میتومایسین ها……………………………………………………………………………………………………………21

1-7-5-5-1 میترامایسین C………………………………………………………………………………………………………..22

1-7-5-6- استرپتوزوستین…………………………………………………………………………………………………………22

1-8-سرطان ریه………………………………………………………………………………………………………………………..23

1-8-1- علائم سرطان ریه……………………………………………………………………………………………………….. 26

1-8-2- سرطان در ایران…………………………………………………………………………………………………………… 26

1-9-اکتینومیست ها…………………………………………………………………………………………………………………….28

1-9-1-متابولیت های ثانویه ی اکتینومیست ها………………………………………………………………………………….30

1-10-هدف از پژوهش………………………………………………………………………………………………………………33

فصل دوم: پیشنه ی تحقیق

فصل سوم: مواد و روش­ها

3-1- ترکیبات استفاده شده………………………………………………………………………………………………………….39

3-2- دستگاه های استفاده شده……………………………………………………………………………………………………42

3-3- سویه های اکتینومیست………………………………………………………………………………………………………..43

تولید اسپور باکتری………………………………………………………………………….43

3-5- آماده سازی محیط پیش کشت………………………………………………………………………………………………44

3-6- آماده سازی محیط کشت تخمیر……………………………………………………………………………………………44

3-7- احیا و کشت سویه…………………………………………………………………………………………………………….45

3-8- تهیه پیش کشت……………………………………………………………………………………………………………… 45

3-9- تولید متابولیت ها………………………………………………………………………………………………………………45

3-10- استخراج متابولیت ها………………………………………………………………………………………………………45

3-11- نگهداری عصاره ها………………………………………………………………………………………………………..46

3-12-1- کشت آرتمیا……………………………………………………………………………………………………………..46

3-12-2- آزمون ارزیابی سمیت در آرتمیا…………………………………………………………………………………..47

3-13- غربالگری ثانویه، ارزیابی سمیت در کشت سلولی……………………………………………………………..48

3-13-1- انتخاب دودمان سلولی…………………………………………………………………………………………….. 48

3-13-1-1 محیط کشت………………………………………………………………………………………………………….49

3-13-1-1-1- مراحل تهیه محیط کشت دودمان سلولی A549…………………………………………………..49

3-13-1-1-2-تجدیدکشت دودمان سلولی A549……………………………………………………………………..50

3-13-1-1-3- شمارش سلول ها و بررسی میزان فعالیت سلول…………………………………………………..51

3-13-2- تهیه محلول تریپسین………………………………………………………………………………………………….52

3-14- آزمون MTT………………………………………………………………………………………………………………..53

3-15- شمارش سلول برای انجام آزمونMTT……………………………………………………………………………54

ژوهش……………………………………………………………………….54

3-17- بررسی ریخت شناسی سلول ها تیمار شده با عصاره اکتینومیست ها……………………………………..55

3-18- شناسایی سویه های منتخب اکتینومیست………………………………………………………………………….56

3-18-1- بررسی مورفولوژی میکروسکوپی……………………………………………………………………………. 56

3-18-2- بررسی میسلیوم های هوایی و آرایش زنجیره اسپوری……………………………………………………56

3-18-3- بررسی رشد میسلیومی در محیطISP2 broth………………………………………………………………56

3-19- مطالعه شیمیوتاکسونومی………………………………………………………………………………………………56

3-19-1- تهیه بیومس برای تعیین ایزومر دی آمینوپامیلیک اسید(DAP)……………………………………………56

3-20- شناسایی توالی نوکلئوتیدی ژن 16S rRNA سویه های منتخب…………………………………………….. 58

3-20-1- تهیه محیط کشت Luria Broth(LB)……………………………………………………………………………..58

3-20-2- تهیه زیست توده برای مطالعات فیلوژنتیک……………………………………………………………………..59

3-20-3- استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………………59

3-20-4- تائید بررسی کیفیت استخراج DNA………………………………………………………………………………61

3-20-4-1- تهیه ژل آگاروز……………………………………………………………………………………………………..61

3-20-4-1-1- تهیه بافر(TAE)Tris-Acetate-EDTA………………………………………………………………..61

3-20-5- انجام فرایند واکنش زنجیره پلیمراز(PCR)……………………………………………………………………..62

3-20-5-2- شرایط واکنش PCR………………………………………………………………………………………………62

3-20-5-3- بررسی محصولات PCR………………………………………………………………………………………..63

3-20-5-4- خالص سازی محصولات PCR……………………………………………………………………………….63

3-20-6- تعیین توالی نوکلئوتیدی قطعات تکثیر شده از ژن 16S rRNA………………………………………….63

3-20-7- مقایسه توالی نوکلئوتید ژن 16S rRNA سویه های اکتینومایست منتخب…………………………….63

فصل چهارم: نتایج

4-1- شرایط پیش تخمیر و تخمیر و میزان متابولیت تولید شده توسط40 سویه اکتینومیست بررسی شده در این پژوهش………………………………………………………………………………………………………………………………65

4-2- نتایج حاصل از تست ارزیابی سمیت متابولیت های ثانویه………………………………………………………..68

4-3- نتایج مربوط به بررسی ریخت شناسی سلول ها در تست سمیت سلولی………………………………….. 71

4-4- نتایج مربوط به تست سمیت سلولی با روش MTT……………………………………………………………….72

4-5- بررسی ریخت شناسی سلول ها پس از تیمار با عصاره سویه ی اکتینومیست های منتخب………………74

4-6- شناسایی اکتینومیست های منتخب………………………………………………………………………………………..74

4-6-1- بررسی ریخت شناسی اکتینومیست های منتخب…………………………………………………………………74

4-6-3- بررسی فیلوژنتیکی اکتینومیست های منتخب………………………………………………………………………77

4-6-3-1- تائید استخراجDNA اکتینومیست های منتخب………………………………………………………………77

4-6-4- تائید استخراج ژن16S rRNA از ژل آگاروز……………………………………………………………………..77

4-6-4-1- نتایج مربوط به توالی خوانی ژن 16S rRNA……………………………………………………………….78

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

منابع……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 91

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………101

پیوست ها………………………………………………………………………………………………………………………….102

فهرست جداول

عنوان صفحه

جدول ‏1‑1: میزان شیوع و مرگ و میر ناشی از انواع سرطان در هر دو جنس زن ومرد. 25

جدول ‏1‑2: تغییرات تنوع سرطان در ایران در طی سال های 1376-1318.. 27

جدول ‏1‑3:گروه های مختلف اکتینومیست ها 29

جدول ‏1‑4: تعدادی از متابولیت های استخراج شده توسط اکتینومیست ها 32

جدول ‏3‑1:مواد شیمایی استفاده شده 39

جدول ‏3‑2:دستگاه های استفاده شده 42

جدول ‏3‑3:ترکیبات محیط کشت ISP2 اصلاح شده 44

جدول ‏3‑4:ترکیبات محیط پیش تخمیر. 45

جدول ‏3‑5:نمک های مورد نیاز برای تهیه آب نمک دریایی مصنوعی.. 46

جدول ‏3‑6:ترکیبات مورد استفاده درتهیه محیط کشت دودمان A549. 49

جدول ‏3‑7:ترکیبات محیط کشت… 58

جدول ‏4‑1:نتایج حاصل از مرحله ی تولید واستخراج متابولیت های ثانویه. 64

جدول ‏4‑2:درصد کشندگی در عصاره ها با محدوده اثری بین 40-59% (محدوده اثر خوب). 67

جدول ‏4‑3:درصد کشندگی در عصاره ها با محدوده اثری بین 39-20% (محدوده اثر متوسط). 69

جدول ‏4‑4:درصد کشندگی در عصاره ها با محدوده اثری بین 0-19% (محدوده اثرضعیف). 70

جدول ‏4‑5: نتایج مربوط به بررسی مرفولوژی سلول پس از تیمار با عصاره ها 70

جدول ‏4‑6: نتایج مربوط به مقایسه مقدار جذب بین عصاره ها با شاهد…………………………………………….. 72

جدول ‏4‑7: شماره دسترسی در Gene Bank ومیزان تشابه اکتینومیست های منتخب با اکتینومیست های ثبت شده براساس ترادف نوکلئوتید های ژن 16S rRNAدر ژنوم…………………………………………………………… 80

فهرست نمودارها

عنوان صفحه

نمودار ‏4‑1:مقایسه میانگین مقدار جذب بین عصاره های سویه هایی که 05/0≥p داشتندبا شاهد(A549). 73

فهرست اشکال صفحه

شکل ‏1‑1: ساختمان شیمیایی داکتینومایسین.. 12

شکل ‏1‑2: ساختمان شیمیایی دانوروبیسین.. 14

شکل ‏1‑3: ساختمان شیمیایی دوکسوروبیسین.. 16

شکل ‏1‑4: ساختمان شیمیایی میترامایسین.. 17

شکل ‏1‑5:ساختمان شیمیایی بلئومایسین.. 18

شکل ‏1‑6:ساختمان شیمیایی میتومایسین.. 20

شکل ‏1‑7: ساختمان شیمیایی استرپتوزوستین.. 22

شکل ‏3‑1: این تصاویر به عنوان نمونه از میزان آسیب می باشد که برای درک بهتر هر مفهوم آسیب دیدگی……………………………………………………………………………………………………………………………………….54

شکل ‏4‑1: تصاویر مربوط به بررسی ریخت شناسی سلول ها پس از تیمار سلول A549 با عصاره باکتری ها…………………………………………………………………………………………………………………………………….73

شکل ‏4‑2: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 863. 74

شکل ‏4‑3: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 919. 74

شکل ‏4‑4: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 877. 74

شکل ‏4‑5: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 676. 75

می گیرد—— 23

2-8-5- سیستماتیک مولکولی—– 24

2-8-6- حشرات تراریخته———- 25

2-9- میکروستلایت ها یا توالی های ساده تکرار شونده———— 26

2-10- نشانگر ISSR و کاربرد آن در مطالعات گیاهی و جانوری— 30

2-11- منابع تغییرات و چند شکلی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————– 31

2-11-1- نمونه DNA————— 32

2-11-2- طبیعت آغازگرهای مورد استفاده:-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—– 32

2-11-3- روش کشف————— 33

2-12- کاربردهای تکنیک ISSR—- 34

2-12-1- انگشت نگاری ژنتیکی—- 34

2-12-2- تنوع ژنتیکی و آنالیز فیلوژنتیکی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—— 34

2-12-3- نقشه یابی ژنتیکی——– 34

2-12-4- تعیین فراوانی توالی های ساده تکراری (SSR)———- 35

2-12-5- مطالعه جمعیت های طبیعی و گونه زایی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 35

2-13- چشم انداز کاربرد ISSR در ژنتیک مولکولی————— 36

2-14- کاربرد نشانگر ISSR در حشره شناسی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—- 37

2-15- نشانگرهای DNA مبتنی بر واکنش زنجیره ای پلیمراز—– 38

فصل سوم

مواد و روش ها——– 40

3-1- جمع آوری نمونه ها———— 41

3-2- استخراج DNA زنبور عسل— 43

3-3- تعیین کیفیت DNA استخراج شده-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——– 45

3-3-1- الکتروفورز DNA در ژل آگارز 1 درصد-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد– 45

3-3-2- بررسی غلظت DNA استخراج شده-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—– 46

3-3-3- رقیق سازی DNA استخراجی برای دستیابی به غلظت ng/µl25—— 47

3-4- واکنش زنجیره ای پلیمراز—– 47

3-5- الکتروفورز محصول PCR روی ژل آگارز-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—- 49

3-6- نمره دهی باندهای مشاهده شده روی آگارز نشانگر غالب ISSR———— 50

3-7- ورود داده های حاصل از ژل ها به نرم افزار اکسل————- 51

3-8- اندازه گیری فواصل و تشابه های ژنتیکی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—- 54

3-9- روش های گروهبندی داده ها-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————— 55

3-10- تجزیه خوشه ای————- 56

3-11- نیکویی برازش خوشه بندی یا ضریب کوفنتیک———– 56

3-12- تجزیه به مولفه های اصلی— 57

3-13- آنالیز داده های مولکولی—– 58

3-14- بررسی های مورفولوژیکی—- 58

3-15- تجزیه به مؤلفه اصلی——– 60

3-16- آنالیز داده های مورفولوژیکی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————– 61

فصل چهارم

نتایج—————– 62

بررسی تنوع مرفولوژیکی نژادهای زنبور عسل مورد مطالعه——– 63

4-2- نتایج مربوط به هفت صفت ظاهری اندازه گیری شده روی زنبوران عسل پنج استان ایرانبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد- 63

4-3- همبستگی خصوصیات ظاهری زنبور عسل پنج استان ایران—————- 64

4-4- ماتریس های شباهت و تفاوت بین زنبورهای پنج استان مختلف ایران—— 65

4-5- تجزیه خوشه ای و تجزیه به مولفه های اصلی بر اساس داده های مرفومتریکبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————— 66

4-6- بررسی تنوع ژنتیکی نژادهای زنبور عسل مورد مطالعه—— 67

4-7- تعداد باندهای تولیدی هر آغازگر برای زنبورهای استان های مورد مطالعه– 72

4-8- تعداد باندهای تولیدی در هر نژاد زنبور عسل—————- 72

4-9- تعداد باندهای تولید هر آغازگر و کارایی آنها در تکثیر—— 73

4-10- ماتریس های شباهت و تفاوت بین زنبورهای پنج استان مختلف ایران—- 74

4-11- تجزیه خوشه ای و تجزیه به مولفه های اصلی بر اساس داده های مولكولی– 74

4-12- بررسی شاخص نشانگری و قدرت تمایز آغازگرهای مورد مطالعه روی زنبور عسلبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——- 76

4-13- تعداد کل جایگاه های ژنی و تعداد جایگاه های ژنی چندشکل در زنبورهای مورد مطالعهبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد- 77

4-14- دندوگرام اجماعی حاصل از داده های ژنتیکی و مرفومتریک————— 78

فصل پنجم

بحث و نتیجه گیری— 79

چگونگی کاربرد و آنالیز نشانگر ISSR در تنوع ژنتیکی زنبور عسل- 81

بررسی تنوع ژنتیکی نژادهای زنبورعسل مورد مطالعه————- 87

پیشنهادات:———- 90

منابع—————– 91

فهرست جداول

جدول 2-1: نام های متفاوت و همنام تکنیک ISSR-PCR- 31

جدول3-1: مکان و آدرس های محل نمونه برداری زنبور عسل- 42

جدول 3-2 مواد واكنش، حجم و غلظت نهایی اجزای واكنش زنجیره پلیمراز 48

جدول3-3: صفات مرفولوژیک اندازه گیری شده 59

جدول 4-1: میانگین هفت صفت مرفولوژیک زنبوران کارگر مورد مطالعه- 63

جدول4-2: اندازه هفت صفت مرفولوژیک زنبور عسل پنج استان ایران- 64

جدول 4-3: همبستگی بین صفات ظاهری اندازه گیری شده در زنبور عسل- 65

جدول 4-4: ضریب فاصله مرفولوژیکی و تشابه مرفولوژیکی بین پنج جمعیت زنبور عسل- 65

جدول 4-5: لیست آغازگرها، توالی آنها و چند شكلی مشاهده شده در نژادهای زنبور عسل- 68

جدول 4-6: تعداد باندهای تولیدی هر آغازگر برای زنبورهای استان های مورد مطالعه- 72

جدول 4-7: ضریب تشابه ژنتیکی و فاصله ژنتیکی بین پنج جمعیت زنبور عسل بر اساس نشانگر ISSR- 74

جدول 4-8: میزان برخی شاخص های آغازگرهای مورد استفاده در مطالعه تنوع ژنتیکی زنبور عسل- 76

فهرست اشکال

شکل 2-1: نقاشی کشف شده از زنبورداری در والنسیای اسپانیا 6

شکل 2-2: طبقه بندی انواع نشانگرهای ژنتیکی- 17

شکل3-1: پنج استان جمع آوری نمونه ی زنبور عسل- 41

شکل3-2: نمایی از مکان های جمع آوری نمونه های زنبور عسل- 42

شکل 3-3: دستگاه حمام آب مورد استفاده در این آزمایشات– 43

شکل 3-4: دستگاه سانتریفیوژ مورد استفاده در این آزمایشات– 44

شکل 3-5: بررسی کیفیت DNA استخراج شده ژنومی روی ژل آگارز 1 درصد- 46

شکل 3-6: دستگاه نانودراپ اسپکتروفوتومتر مورد استفاده در تعیین غلظت DNA- 47

شکل 3-7: برنامه واكنش زنجیره ای پلیمراز 49

شکل 3-8: دستگاه های PCR مورد استفاده در این آزمایشات– 49

شکل 3-9: تانک الکتروفورز ژل آگارز مورد استفاده در این آزمایشات– 50

شکل 3-10: دستگاه BioDoc Analyzer و سیستم تصویربرداری از ژل آگارز 50

شکل 3-11: باندهای موجود و نمره دهی لوکوس های موجود حاصل از تصویربرداری ژل های آگارز نشانگر ISSR- 51

شکل 3-12: ورود داده های حاصل از نمره دهی ژل های آگارز به نرم افزار اکسل جهت آنالیز- 51

شکل 3-13: نمایی از بال جلویی زنبور عسل و صفات اندازه گیری شده 60

شکل 3-14: دستگاه استریومیکروسکوپ مجهز به دوربین مورد استفاده در آزمایشات– 60

شکل 4-1: دندروگرام حاصل از آنالیز خوشه ای بر اساس روش UPGMA با ماتریس تشابهCorr 66

شکل 4-2: مقایسه زنبورهای عسل مورد بررسی با استفاده از روش تجزیه به مولفه های اصلی- 67

شکل 4-3: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 1 با استفاده از مارکر bp 50- 69

شکل 4-4: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 2 با استفاده از مارکر bp 50- 70

شکل 4-5: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 3 با استفاده از مارکر bp 50- 70

شکل 4-6: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 4 با استفاده از مارکر bp 50- 71

شکل 4-7: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 5 با استفاده از مارکر bp 50- 71

شکل 4-8: تعداد باندهای تولیدی در نژادهای زنبور عسل- 73

شکل 4-9: تعداد باندهای تولیدی آغازگرهای مورد استفاده 73

شکل 4-10: دندروگرام حاصل از آنالیز خوشه ای بر اساس روش UPGMA با ماتریس تشابه Jaccard 75

شکل 4-11: پلات سه بعدی حاصل از تجزیه به مختصات اصلی به روش ماتریس تشابه Jaccard 75

شکل 4-12: تعداد کل جایگاه های ژنی و تعداد جایگاه های ژنی چندشکل 77

شکل 4-13: دندروگرام اجماعی حاصل از داده های ژنتیکی و مرفولوژیکی- 78

CSF)…………………………………………………………………………………….13

ژن gcsf………………………………………………………………………………………………………………………….13

پروتئین GCSF………………………………………………………………………………………………………………..13

عملکرد پروتئین GCSF…………………………………………………………………………………………………….14

فصل دوم مواد و روش ها

میکروارگانیسم های مورد استفاده………………………………………………………………………………………..17

محیط های کشت مورد نیاز………………………………………………………………………………………………..17

پلاسمیدهای مورد استفاده…………………………………………………………………………………………………..18

آنزیم ها و کیت ها……………………………………………………………………………………………………………18

آنتی بیوتیک ها…………………………………………………………………………………………………………………18

الکتروفورز افقی محصول PCR و یا نمونه DNA بر روی ژل آگارز………………………………………….19

تخلیص محصول هضم آنزیمی با استفاده از کیت تخلیص از ژل آگارز……………………………………..19

واکنش لیگاسیون قطعات تخلیص شده…………………………………………………………………………………20

تهیه سلول های مستعد ‘E. coli TOP10F به روش تیمار با کلرید کلسیم…………………………………..20

انتقال پلاسمید به سلول های مستعد……………………………………………………………………………………..21

بررسی کلونهای نوترکیب به روش سریع………………………………………………………………………………21

PCR بر روی کلنی های باکتریایی/مخمری…………………………………………………………………………..22

استخراج پلاسمید در مقیاس کم………………………………………………………………………………………….22

استخراج پلاسمید در مقیاس زیاد………………………………………………………………………………………..23

الکتروفورز پروتئین بر روی ژل پلی اکریل آمید(SDS-PAGE)………………………………………………..24

سنتز ژن gcsf…………………………………………………………………………………………………………………..29

PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf……………………………………………………………………………………….30

کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا………………………………………………………………………31

هضم آنزیمی وکتور pGH-gcsf………………………………………………………………………………………….32

هضم آنزیمی وکتوربیانی pHan…………………………………………………………………………………………33

کلون نمودن قطعه gcsf در وکتور بیانی pHan………………………………………………………………………33

بررسی کلون های نوترکیب pHan-gcsf……………………………………………………………………………….34

هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf…………………………………………………………………………………………35

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf……………………………………………..35

PCR اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین……………………………………………………………………35

کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy………………………………………………….37

بررسی کلون های نوترکیب pGEM-zeo……………………………………………………………………………..38

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf………………………………………………39

هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf و pGEM-zeo……………………………………………………………………39

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی تیمار شده با آلکالین فسفاتاز pHan-gcsf………40

بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin………………………………………………………………………41

انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا…………………………………41

هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin………………………………………………………………………41

الکتروپوریشن سلول های هانسونلا پلی مورفا………………………………………………………………………..42

تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony PCR اختصاصی ژن زئوسین………………………..43

بیان پروتئینGCSF در هانسونلا پلی مورفا…………………………………………………………………………..44

کشت سلولهای مخمری……………………………………………………………………………………………………..44

بررسی بیان پروتئین نوترکیب با روش SDS-PAGE………………………………………………………………44

تزریق نمونه پروتئینی به خرگوش………………………………………………………………………………………..45

ایمونوبلاتینگ…………………………………………………………………………………………………………………..46

فصل سوم نتایج

سنتز ژن gcsf…………………………………………………………………………………………………………………..49

PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf………………………………………………………………………………………49

طراحی پرایمر های اختصاصی ژن gcsf……………………………………………………………………………….49

بهینه سازی واکنش PCR برای ژن gcsf……………………………………………………………………………….50

کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا………………………………………………………………………51

هضم آنزیمی وکتور کلونینگ pGH-gcsf و وکتور بیانی pHan……………………………………………….51

بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf…………………………………………………………………………………52

بررسی کلونها به روش سریع……………………………………………………………………………………………..52

انجام PCR ژن gcsf بر روی پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf……………………………………………………52

هضم آنزیمی وکتور تأیید شده pHan-gcsf…………………………………………………………………………..53

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf……………………………………………..54

PCR اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین (Sh ble)…………………………………………………….54

کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy………………………………………………….55

تأیید کلون های نوترکیب pGEM-zeocin……………………………………………………………………………55

بررسی سریع کلونهای نوترکیب…………………………………………………………………………………………..55

هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب pGEM-zeo با BglII……………………………………………………………56

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf………………………………………………57

بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin……………………………………………………………………57

بررسی سریع کلونهای نوترکیب…………………………………………………………………………………………..57

بررسی کلونها به روش Colony-PCR…………………………………………………………………………………58

برش آنزیمی وکتور نوترکیب pHan-gcsf-zeo………………………………………………………………………58

انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا…………………………………59

هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin و انتقال به سلول هانسونلا………………………………….59

تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony-PCR ژن زئوسین……………………………………….59

بیان پروتئینGCSF در هانسونلا پلی مورفا………………………………………………………………………….60

تأیید پروتئین نوترکیب تولید شده با روش Immuno-Blotting……………………………………………….61

فصل چهارم :بحث و پیشنهادات

رویکرد کلی پژوهش…………………………………………………………………………………………………………63

فصل پنجم : منابع و پیوست

فهرست منابع و مواخذ……………………………………………………………………………………………………….66

پیوست ها…………………………………………………………………………………………………………………………75

 

مقدمه

تولید پروتئین های نوترکیب یک بازار میلیارد دلاری دارا می باشد. از طرف دیگر تولید یک محصول نوترکیب جدید با انتخاب یک میزبان مناسب شروع می شود. در میان سیستم های بیانی مختلف، سلولهای مخمری به عنوان تک سلولی های تولید کننده با ویژگی دستکاری های ژنتیکی ساده و داشتن مسیرهای ترشحی اختصاصی که در تولید پروتئین کامل و فعال و انتقال آن به خارج از سلول مؤثر می باشند، یکی از بهترین انواع سیستم های شناخته شده می باشند. ساکارومیسس سرویزیه، پیکیا پاستوریس و هانسونلا پلی مورفا در اکثر مطالعات به عنوان سلولهای مخمری میزبانی مورد استفاده قرار گرفته اند که دارای مسیر مشترک بیوشیمیایی در متابولیسم متانول می باشند. در حال حاضر تکنولوژی هانسونلا به دلیل میزان بیان بالا مورد توجه جهانی قرار گرفته است. از جمله اقلام دارویی تولید شده در این سلولها میتوان به واکسن هپاتیت B، انسولین و اینترفرون آلفا و بتا اشاره نمود.

هدف از این مطالعه ، استفاده از وکتور بیانی طراحی شده جهت بیان فاکتور رشد کلنی گرانولوسیتی (GCSF) نوترکیب به عنوان پروتئین کاندید می باشد.

مواد و روش ها

cDNA کد کننده ژن فاکتور محرک رشد کلونی گرانولوسیتی در وکتور بیانی طراحی شده مربوط به هانسونلا پلی مورفا که شامل پروموتر، توالی سیگنال پپتید، توالی خاتمه دهنده رونویسی و شاخص انتخابی اوکسوتروفی می باشد کلون گردید و بدین ترتیب وکتور بیانی مورد نظر ساخته شد. هضم های آنزیمی به منظور تأیید قطعات کلون شده در وکتور بیانی طراحی شده انجام شد. القاء بیان پروتئین نوترکیب در این سیستم با متانول صورت گرفت و ایمونوبلاتینگ جهت تأیید پروتئین تولید شده نوترکیب صورت گرفت.

نتایج

ماهیت توالیهای کلون شده در وکتور بیانی از طریق هضم های آنزیمی با استفاده از سایتهای طراحی شده در توالی سنتز شده و مشاهده قطعات مورد نظر در ژل آگارز ارزیابی شد. وکتور نوترکیب به فرم خطی با روش الکتروپوریشن به سلول مستعد هانسونلا پلی مورفا انتقال داده شد و القاء بیان پروتئین با متانول صورت پذیرفت. پروتئینی حدوداً 20 کیلو دالتونی بر روی ژل SDS-PAGE مشاهده گردید که با ایمونوبلاتینگ پروتئین تولید شده به عنوان GCSF تأیید شد.

بحث

پروتئین تولید شده با روش بلاتینگ تأیید گردید. در ادامه بایستی عملکرد این پروتئین در واکنشهای ایمونولوژیکی مورد بررسی قرار گیرد. از طرف دیگر عملکرد این پروتئین در مقایسه با فرم تولید شده در E. coli مقایسه شود.

کلید واژه ها

هانسونلا پلی مورفا، فاکتور محرک رشد کلونی گرانولوسیتی (GCSF)، مهندسی ژنتیک

فصل اول : مقدمه

در طول چند دهه اخیر به سه دلیل زیر مطالعات زیادی بر روی مخمر هانسونلا پلی مورفا صورت گرفته است:

1. رشد سریع این مخمر با مصرف متانول به عنوان تنها منبع کربن و انرژی،