1-8-1: روش کشت… 18

1-8-2: روش آگلوتیناسیون لاتکس (LAT). 19

1-8-3: روش مولکولی.. 19

1-9: ژنوم هموفیلوس آنفلونزا: 19

1-9-1: ژنوم مولد کپسول پلی ساکاریدی.. 21

1-9-1-1: منطقه I. 22

1-9-1-3: منطقه II. 22

1-9-1-2: منطقه III. 22

1-9-1-4: قطعه IS1016 23

1-9-1-5: تعداد کپی جایگاه cap. 24

1-9-1-6: تکامل ژنوم سویه های کپسول دار هموفیلوس آنفلونزا 25

1-9-1-7: ژنوتیپ های Hib.. 27

1-10: روش های تعیین تعداد کپی جایگاه cap در ژنوم هموفیلوس آنفلونزا: 28

1-11: Real-time PCR.. 28

1-11-1: تعریف و مفهوم : 28

1-11-2: مزایای روش Real-time PCR: 29

1-11-3: انواع روش های Real-time PCR: 29

1-11-4: روش های تعیین کمیت با Real-time PCR: 32

1-11-4-1: Absolute Quantification : 32

1-11-4-2: چگونگی رسم یک منحنی استاندارد: 32

1-11-4-3: Relative Quantification.. 33

1-11-5: کاربرد های Real-time PCR: 34

1-12: بیان مساله. 34

1-13: ضرورت انجام تحقیق.. 35

1-14: اهداف پژوهش…. 36

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

2-1: مطالعات انجام شده در ایران. 38

2-2: مطالعات انجام شده در خارج از ایران. 39

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1: محیط های کشت… 43

3-1-1: محیط کشت شکلات آگار. 43

3-1-1-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز. 43

3-1-1-2: روش تهیه 1000 میلی لیتر محیط کشت شکلات آگار. 43

3-1-2: محیط کشت آگار خون دار. 44

3-1-2-1: روش تهیه 1000 میلی لیتر محیط کشت شکلات آگار. 44

3-1-3: محیط کشت BHI+ supplement مایع.. 44

3-1-3-1: مواد و دستگاه های مورد نیاز. 44

3-1-3-2: روش تهیه 500 میلی لیتر محیط کشت BHI+ supplemenمایع.. 44

3-2: کشت نمونه ها 45

3-3: فریز کردن باکتری.. 45

3-3-1: مواد و تجهیزات لازم. 45

3-3-2: روش فریز کردن. 45

3-4: شناسایی عمومی هموفیلوس آنفلونزا 46

3-4-1: تست نیاز های غذایی.. 46

3-4-2: رنگ آمیزی گرم. 46

3-4-2-1: مواد و تجهیزات لازم. 46

3-4-2-2: روش رنگ آمیزی گرم. 46

3-5: واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR). 47

3-5-1: استخراج DNA از باکتری به روش جوشاندن. 47

3-5-1-1: مواد و تجهیزات لازم. 47

3-5-1-2: روش استخراج.. 48

3-5-2: پرایمرها 48

3-5-2-1: آماده سازی پرایمرها 49

3-5-3: برنامه PCR.. 49

3-5-4: تهیه مستر میکس PCR.. 50

3-5-4-1: مواد و تجهیزات لازم. 50

3-5-4-2: روش تهیه مسترمیکس…. 50

3-5-5: تهیه 500 میلی لیتر بافر TAE 10X.. 53

3-5-5-1: مواد و تجهیزات لازم. 53

3-5-5-2: روش تهیه بافر. 53

3-5-6: الکتروفورز محصول PCR.. 53

3-5-6-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز. 53

3-5-6-2: تهیه ژل آگارز جهت الکتروفوز. 53

3-5-6-3: روش الکتروفورز محصول PCR.. 54

3-6: استخراج PRP. 54

3-6-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز. 54

3-6-2: تهیه ml50 محلول CTAB 0.5 M… 54

3-6-3: تهیه ml 50 محلول NaCl 0.4 M… 55

3-6-4: روش استخراج PRP. 55

3-7: اندازه گیری PRP به روش بیال. 56

3-7-1: مواد و تجهیزات لازم. 56

3-7-2: روش اندازه گیری PRP. 56

3-8:تعیین تعداد کپی cap با استفاده از Real-time PCR: 57

3-8-1: مواد و تجهیزات لازم: 57

3-8-2: شرایط واکنش: 57

3-8-3: کمیت سنجی مطلق(Absolute quantification): 59

3-8-3-1: انجام و تخلیص محصول PCR برای منحنی استاندارد. 59

3-8-3-2: تهیه منحنی استاندارد. 60

3-8-4: کمیت سنجی نسبی (Relative Quantification): 62

3-9: تعیین ژنوتیپ نمونه ها با استفاده از PCR : 62

فصل چهارم: نتایج

4-1: نتایج روش های تشخیص عمومی.. 65

4-1-1: نتایج نیاز غذایی.. 65

4-1-2: نتایج رنگ آمیزی گرم. 65

4-2: نتایج آزمون PCR.. 66

4-2-1: تایید هموفیلوس آنفلونزای کپسول دار بودن نمونه ها 66

4-2-2: تایید تیپ b بودن نمونه ها 68

4-2-3: نتیجه نهایی PCR.. 69

4-2-4: مشاهده سوش جهش یافته Hib‾ در میان نمونه ها 72

4-3: نتایج سنجش PRP به روش بیال. 72

4-4: نتایج Real-time PCR.. 73

4-4-1: کمیت سنجی نسبی: 74

4-4-2: کمیت سنجی مطلق: 77

4-5: نتایج تعیین ژنوتیپ: 82

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1: بحث و نتیجه گیری.. 84

5-3: پیشنهادات… 87

منابع …89

خلاصه انگلیسی.. 98

فهرست جداول

جدول 1-1: نیاز گونه های مختلف هموفیلوس به فاکتورهای مختلف به فاکتورهای X و V 7

جدول 1-2: بیوتایپ های هموفیلوس آنفلونزا 8

جدول 3-1: لیست پرایمرها برای تایید Hib.. 48

جدول 3-2: برنامه PCR.. 50

جدول 3-3: مواد PCR.. 52

جدول3-4: پرایمرهای اولیگونوکلئوتیدی استفاده شده برای Real time PCR.. 58

جدول3-5: مواد واکنش برای Real-time PCR.. 61

جدول3-6 : برنامه واکنش Real-time PCR.. 61

جدول 3-7: پرایمر های مورد استفاده برای تعیین ژنوتیپ نمونه های منتخب… 63

جدول 3-8: برنامه دمایی واکنش PCR برای پرایمرهای K و L.. 63

جدول 4-1: لیست نمونه ها و نتایج PCR.. 70

جدول 4-2: میزان PRP نمونه های هموفیلوس آنفلونزا تیپ b.. 73

جدول 4-3 : نمونه های منتخب و میزان PRP. 74

جدول4-4: کمیت سنجی نسبی ژن rpoB و قطعه IS106 توسط Real-time PCR.. 75

جدول4-5: کمیت سنجی نسبی ژن rpoB و ژن capb توسط Real-time PCR.. 75

جدول4-6: نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه rpoB.. 78

جدول 4-7: نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه capB.. 78

جدول 4-8: نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه IS1016. 78

جدول4-9: نتایج کمیت سنجی مطلق (تعداد کپی) جایگاه های rpoB, IS1016 و capB 79

جدول 4-10 : تعداد کپی جایگاه های capb و IS1016 نسبت به جایگاه تک کپی rpoB 80

فهرست تصاویر

شکل1-1: انتشار باسیل های گرم منفی، هموفیلوس و سایر باکتریهای نرمال و سخت رشد. 5

شکل 1-2: تست نوارهای X ، V و XV.. 7

شکل 1-3: ساختار پلی ساکارید های کپسولی هموفیلوس آنفلونزا (تیپ های a-f). 10

شکل 1-4: تظاهرات کلینیکی بیماریهای با عامل Hib بصورت درصد. 14

شکل 1-5: کشورهایی که از سال 1997 تا 2012 به برنامه واکسیناسیون علیه Hib پیوستن 18

شکل 1-6: نقشه ژنتیکی حلقوی Haemophilus influenza Rd.. 20

شکل 1-7: ساختار ژنتیکی جایگاه cap در هموفیلوس آنفلونزا سروتایپ های a,b,c,d,e,f. 21

شکل 1-8: جایگاه cap و ژن های تشکیل دهنده 24

شکل 1-9 : درخت تکاملی سویه های کپسول دار هموفیلوس آنفلونزا 26

شکل1-10 : تفاوت های بین ژنوتیپ I و II در جایگاه cap. 28

شکل 1-11: نحوه اتصال نشانگر سایبرگرین.. 30

شکل1-12: مکانیسم عمل SYBR Green به عنوان عامل متصل شونده به DNA.. 31

شکل1-13: رسم منحنی استاندارد. 33

شکل 3-1: ویال های آماده برای PCR روی یخ.. 52

شکل 4-1: رشد باکتری در حضور دیسک XV و عدم رشد در حضور دیسک X و V.. 65

شکل 4-2: رنگ آمیزی گرم نمونه ها نشان دهنده کوکوباسیل های گرم منفی.. 66

شکل 4-3: نتایج PCR برای ست پرایمر A و B 67