2-1 ALCAM در درمان سرطان………………………………………………………………………………………… 19

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1 مواد مورد استفاده………………………………………………………………………………………………… 24

3-1-1 باکتری مورد استفاده……………………………………………………………………………………. 24

3-1-2 پلاسمید…………………………………………………………………………………………………………………….. 24

3-1-3 انزیم ………………………………………………………………………………………. 25

3-1-4 کیت های ازمایشگاهی……………………………………………………………………………………… 25

3-1-5 انتی بیوتیک ها……………………………………………………………………………………………….. 25

3-1-6 محیط کشت باکتری………………………………………………………………….. 25

3-1-7 ژل الکتروفورز…………………………………………………………………………………………….. 25

3-1-8 مواد شیمیایی…………………………………………………………………………. 25

3-1-9 وسایل و تجهیزات ازمایشگاهی……………………………………………………………………… 25

3-2 انالیز بیوانفورماتیکی ناحیه ALCAM.. ………………………………………………………………………………………………… 31

3-2-1 استخراج توالی مورد نظر…………………………………………………………………………….. 31

3-2-2 بهینه سازی توالی یا Optimization………………………………………………………………………………………………………. 32

3-3 سنتز شیمیایی DNA ALCAM………………………………………………………………………………….. 32

3-3-1 سنتز شیمیایی ژن نوترکیب………………………………………………………………………………………….. 32

3-3-2 پایداری و شرایط نگهداری DNA سنتز شده…………………………………………………………………….. 32

3-3-3 محلول سازی DNA لیوفیلیزه………………………………………………………………………….. 33

3-4 کلونینگ پلاسمید- AMP⁺pBSK حاوی DNA پروتئین ALCAM ………………………………………………………………………. 33

3-4-1 اماده سازی باکتری شایسته…………………………………………………………………………………….. 33

3-4-1-1 مواد و محلول ها…………………………………………………………………………………….. 33

3-4-1-2 روش کار…………………………………………………………………………………………….. 34

3-4-2 ترانسفورماسیون پلاسمید به سلول های مستعد TOP10 E.coli………………………………………………………….. 35

3-4-2-1 روش کار……………………………………………………………………………………………….. 35

3-4-3 ارزیابی کلونی ها…………………………………………………………………………………………………………….. 36

3-4-4 استخراج پلاسمید – AMP⁺pBSK حاوی DNAپروتئین ALCAM…………………………………………………………… 36

3-4-5 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده…………………………………………………………. 38

3-4-5-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion…………………………………………………………………………………… 39

3-4-5-2 الکتروفورز…………………………………………………………………………………………….. 39

3-5 ساب کلونینگ ژن پروتئین ALCAM……………………………………………………………………………………………………. 39

3-5-1 تخلیص DNA ناحیه CD166از ژل…………………………………………. 39

3-5-2 لایگیشن……………………………………………………………………………………………………………… 43

3-5-3 ترانسفورماسیون……………………………………………………………………………………………………….. 43

3-5-3-1 اماده سازی سلول های شایسته……………………………………………………………………. 44

3-5-3-2 ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coli BL21(DE3) با محصول لایگیشن…………………………………………. 45

3-5-4 ارزیابی کلونی ها…………………………………………………………………………………………………….. 45

3-5-5 استخراج پلاسمید بیانی pet-28aحاوی ژنپروتئین ALCAM……………………………………………………………. 46

3-5-6 تایید انزیمی پلاسمید استخراج شده…………………………………………………………. 48

3-6 بیان پروتئین پروتئین ……………………………………….. 48

3-6-1 القاء بیان پروتئین به کمک …………………………………………… 49

3-6-2 بررسی بیان به کمک تکنیک SDS-page……………………………………………………………………………………………………………. 49

3-6-2-1 محتویات كیت. SDS-page ………………………………………………………………………………………………………………… 50

3-6-2-2روش انجام SDS_page………………………………………………………………………………………………………………. 51

فصل چهارم: نتایج

4-1نتایج حاصل از انالیز بیوانفورماتیکی پروتئین پروتئین ALCAM…………………………………………………………. 55

4-1-1 نتایج حاصل از بهینه سازی توالی یا Optimization……………………………………………………………………………….. 55

4-2 سنتز شیمیایی DNA پروتئین ALCAM……………………………………………………………………………………………………………….. 60

4-3 کلونینگ پلاسمید- AMP⁺pBSKحاوی DNA پروتئینALCAM…………………………………………………………………………… 62

4-4 ساب کلونینگ ژن پروتئین ALCAM…………………………………………………………………………………………. 63

4-5 بیان پروتئین پروتئین ALCAMو تائید ان به کمک تکنیک SDS-page…………………………………………….. 66

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

بحث…………………………….. 68

نتیجه گیری…………………………………………. 80

منابع…………………………………. 81

فهرست شکل ها

شکل1-1. ساختار پروتئینALCAM………………………………………………………………………………………………………. 4

شکل3- 1انکوباتور ساخت شرکت پارس طب نوین ………………………………………………………………. 26

شکل 3-2.شیکر انکوباتور……………………………………………………………………………………… 27

شکل 3-3. تانک الکتروفوز افقی………………………………………………………………………………………….. 27

شکل 3-4…. تانک الکتروفورز و دستگاه مولد ولتاژ………………………………….. 28

شکل3-5. سانتریفیوژ اپندورف المان………………………………………………………………………………………… 29

شکل 3-6… بن ماری…………………………………………………………………………………………………………………………………. 29

شکل 3-7… انکوباتور………………………………………………………………………………………………………………… 30

شکل 3-8 دستگاه تصویرساز ژل……………………………………………………………………………………………………. 30

شکل 3-9 کیت استخراج پلاسمید فرمنتاز……………………………………………………… 36

شکل3-10 کیت استخراج DNAاز ژل فرمنتاز………………………………………… 41

شکل 4-1 شاخص سازگاری کدون. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی…….. 57

شکل4-2 … میزان فراوانی کدون های بهینه. سمت چپ: قبل از بهینه سازی، سمت راست: بعد ازبهینه سازی…………………………………………. 57

شکل 4-3 . . شاخص محتوای G-C. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی………………………………………………….. 57

شکل 4-4. ترادف احیه ژنی مورد نظر پس از بهینه سازی کدون های مربوطه جهت بیان در میزبان E.coli…………………………………………58

شکل 4-5. مقایسه نوکلئوتید بصورت نظیر به نظیر در توالی های اولیه و بهینه سازی……………………………………………………………………. 60

شکل 4-6. تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم انزیمی ……………………………………………………………………………………………….62

شکل 4-7. نقشه ی ژنی پلاسمید حاوی DNA…………………………………………………………………………………………. 63

شکل4-8تایید حضور پلاسمید حاوی پروتئینALCAM. ……………………………………………………………………………………… 64

شکل 4-9. هضم دوگانه انزیمی پلاسمید تکثیر یافته pBSK…………………………………………………………………………………………. 64

شکل 4-10. نقشه ژنی پلاسمید pet-28a……………………………………………………………………………………………. 63

شکل 4-11باکتری های BL21(DE3)ترانسفورم شده با pet-28a حاوی ژن………………………………………………………………….. 66

شکل 4-12. تائید حضور پلاسمید pet-28aحاوی ژن در باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3)………………………………… 66

شکل 4-13نتیجه حاصل از هضم انزیمی دو گانه پلاسمید pet-28aحاوی ژن ناحیه………………………………………………………………………… 67

شکل4-14 بررسی بیان پروتیئن ناحیه.ؤ……………………………………………………………………….. 68

چکیده

مقدمه :

سرطان کولورکتال به عنوان چهارمین سرطان شایع در دنیا با برآورد 2/1میلیون مورد جدید در سال می باشد. این سرطان با توجه به متاستاز به نواحی مختلف بدن به خصوص کبد و ریه در مراحل پیشرفت بیماری یکی از کشنده ترین نوع از سرطان های بدخیم می باشد.هم چنین این سرطان رتبه سومین نوع از سرطان های شایع در زنان و پنجمین نوع در میان مردان در ایران درارا می باشد.

CD166 یکی از پروتئین های سطحی سلولهای سرطانی در سرطان کولورکتال است که با سرطانی شدن سلول ها میزان بیان سطحی آن بیشتر می شود. از این جهت می توان از آن به عنوان مارکر مناسب جهت درمان سرطان استفاده کرد. در این مطالعه ما برآن شدیم که تا با استفاده از کلون کردن و بیان پروتئین سطحی CD166 زمینه برای استفاده از آن جهت تولید واکسن و یا کیت تشخیص سرطان کولورکتال فراهم شود.

روش کار :

در این مطالعه ابتدا توالی ژن موردنظر به کمک بانک های اطلاعات ژنی انتخاب شد. سپس توالی موردنظر را آنالیز بیوانفورماتیکی قرار گرفت. ژن آنالیز شدن به روش شیمیایی سنتز شد و سپس با استفاده از فرآیند کلوینگ ، قطعه ژنی سنتز شده را به کمک پلاسمید بیانی pet-28a درون سیستمپروکاریوتیانتقال و تکثیریافت.

در انتها نیز بیان ژن موردنظر را در باکتریهای نوترکیب با القاگر مناسب القا کرده و وجود پروتئین موردنظر به کمک تکنیک sDs-page مورد بررسی قرار گرفت.

بحث و نتیجه گیری :

ژن موردنظر توانایی کلون شدن در میزبان پروکاریوتی را دارا بوده و باکتری قادر است به کمک القاگر مناسب به میزان فراوانی پروتئین موردنظر را تولید کند.

از این جهت می توان از این پروتئین نوترکیب برای تهیه کیت تشخیص سرطان کولورکتال به واسطه ی تکنیک الایزا استفاده برد. همچنین می توان با تزریق این پروتئین نوترکیب به عنوان واکسن ، سیستم ایمنی فرد را جهت پیشگیری از ابتلا به سرطان کولورکتال تقویت نمود.

واژه های کلیدی : سرطان کولورکتال ، CD166 ، کلونینگ

فصل اول : مقدمه