………………………………………………………………………………………………………………………. 9

گوش داخلی …………………………………………………………………………………………………………………….. 9

طبقه بندی ناشنوایی …………………………………………………………………………………………………………. 11

طبقه بندی بر اساس سن شروع ……………………………………………………………………………………….. 11

طبقه بندی بر اساس شدت ………………………………………………………………………………………………. 12

طبقه بندی بر اساس علت فیزیولوژیکی ……………………………………………………………………………. 12

ژن های شناخته شده مرتبط با ناشنوایی …………………………………………………………………………….. 13

بررسی ژن ها ……………………………………………………………………………………………………………………. 22

ژنGJB4 ……………………………………………………………………………………………………………. 22

ژنGJC3 ……………………………………………………………………………………………………………… 25

ژنSLITRK6………………………………………………………………………………………………………. 26

ژنSERPINB6 ……………………………………………………………………………………………………. 28

ژنNESP4 ……………………………………………………………………………………………………………. 29

ژنCABP2 …………………………………………………………………………………………………………. 30

ژنOTOGL …………………………………………………………………………………………………………. 31

فصل سوم روش شناسی تحقیق

نوع مطالعه ………………………………………………………………………………………………………………………… 34

جامعه، نمونه آماری و روش نمونه گیری ………………………………………………………………………………. 34

روش جمع آوری داده ها …………………………………………………………………………………………………….. 34

متغیره ها …………………………………………………………………………………………………………………………..34

روش شناسی تحقیق …………………………………………………………………………………………………………. 35

ملاحظات اخلاقی ………………………………………………………………………………………………………………. 36

مواد و روش ها ………………………………………………………………………………………………………………… 37

استخراج DNA …………………………………………………………………………………………………….. 37 چگونگی استخراج DNA ……………………………………………………………………………………….. 38

لیز سلول ……………………………………………………………………………………………………………….. 39

هیدراسیون DNA………………………………………………………………………………………………. 40

تعیین غلظت DNA استخراج شده ……………………………………………………………………………….. 41

روش تعیینغلظت …………………………………………………………………………………………………………. 42

نحوه خالص سازی نمونه های آلوده به پروتئین .……………………………………………………………… 42

آنالیز پیوستگی برای بررسی 7 جایگاه ژنی مرتبط با ناشنوایی اتوزومی مغلوب غیرسندرومی .. 43

انتخاب مارکرهای STR……………………………………………………………………………………….44

ژنGJB4 ……………………………………………………………………………………………………….. 45

ژنGJC3 …………………………………………………………………………………………………………. 46

ژنSLITRK6 ………………………………………………………………………………………………….. 47

ژنSERPINB6 ………………………………………………………………………………………………. 48

ژنNESP4 ………………………………………………………………………………………………………. 49

ژنCABP2 …………………………………………………………………………………………………….. 50

ژنOTOGL ……………………………………………………………………………………………………. 51

تعیین هتروزیگوسیتی مارکرهای STR در جمعیت ایران ……………………………………….. 52

واکنش زنجیره ای پلیمراز ………………………………………………………………………………………………..53

مواد لازم برای واکنشPCR……………………………………………………………………………………………54

روش انجامPCR ………………………………………………………………………………………….57

الکتروفورز …………………………………………………………………………………………………………….60

الکتروفورز با ژل پلی آکریل آمید ………………………………………………………………..61

مواد لازم جهت الكتروفورز ژل پلی آكریل امید …………………………………………….62

طرز تهیه ژل اكریل امید 8 درصد ………………………………………………………………..63

رنگ آمیزی ژل به روش نیترات نقره ……………………………………………………………65

مواد لازم جهت رنگ آمیزی نقره ……………………………………………………..65

روش رنگ آمیزی نیترات نقره …………………………………………………………66

بررسی ژل های پلی آکریل آمید ……………………………………………………..67

پیدا کردن جهش به روش مستقیم تعیین توالی ………………………………………………………68

الکتروفورز محصولاتPCRبر روی ژل آگارز ……………………………………………..70

مواد لازم جهت انجام الكتروفورزDNAبرروی ژل آگارز …………………70

روش كار ………………………………………………………………………………………..71

توالی پرایمرهای مورد استفاده برای تکثیر …………………………………………………..72

روش آنالیز نتایج حاصل ازSequencing ……………………………………………………74

فصل چهارمتجزیه و تحلیل و بیان نتایج حاصل از تحقیق

نتایج حاصل از مطالعات آنالیز پیوستگی …………………………………………………………………………..75

مارکرهای دارای فركانس آللی بالاتر ……………………………………………………………………….75

نتایج آنالیز پیوستگی در خانوادهای ناشنوا با توارث مغلوب ……………………………………..77

خانواده L-3082 و ژن GJB4 ………………………………………………………………………………. 78

خانواده L-1902 و ژن GJC3 ……………………………………………………………………………… 81

خانواده L-346 و ژن SLITRK6 …………………………………………………………………………. 84

خانواده L-346 و ژن NESP4 ……………………………………………………………………………… 86

خانواده L-1731 و ژن SERPINB6 …………………………………………………………………….. 88

خانواده L-346 و ژن CABP2 ……………………………………………………………………………… 91

خانواده L-346 و ژن OTOGL ……………………………………………………………………………. 94

فصل پنجم­بحث ونتیجه گیری وپیشنهادات

بحث ونتیجه گیری ……………………………………………………………………………………………………………97

تحقیقیات اضافه ……………………………………………………………………………………………………………..101

پیشنهادات …………………………………………………………………………………………………………………….103

منابع …………………………………………………………………………………………………………………………….. 105

 

فهرست جداول

 

 

جدول 1-1 نام ژن ها و جایگاه ژن هایی که تاکنون به عنوان عامل بیماری ناشنوایی اتوزومی مغلوب در جمعیت ایران شناسایی شده است …………………………………………………………………………………. 4

جدول 2-1 ناشنوایی بر اساس شدت …………………………………………………………………………………. 12

جدول 2-2 جایگاه ها و ژن های شناسایی شده در ناشنوایی غیر سندرمی با توارث مغلوب اتوزومی به همراه خصوصیات خاص فنوتیپی برای هر کدام ……………………………………………………………….. 14

جدول 2-3 جزِِِییات جهش های ژن های Cx ………………………………………………………………………. 24

جدول 3-1 متغیره ها ……………………………………………………………………………………………………….. 34

جدول 3-2 مواد لازم جهت استخراج DNA به روش نمک اشباع …………………………………………. 36

جدول 3-3 مارکر های ژنGJB4 ………………………………………………………………………………………. 45

جدول 3-4 مارکر های ژنGJC3 ………………………………………………………………………………………. 46

جدول 3-5 مارکر های ژنSLITRK6 …………………………………………………………………………………. 47

جدول 3-6 مارکر های ژنSERPINB6 ……………………………………………………………………………… 48

جدول 3-7 مارکر های ژنNESP4…………………………………………………………………………………… 49

جدول 3-8 مارکر های ژنCABP2…………………………………………………………………………………… 50

جدول 3-9 مارکر های ژنOTOGL…………………………………………………………………………………. 51

جدول 3-10 مواد لازم برای ساخت Master Mix ………………………………………………………………. 57

جدول 3-11مواد لازم برای انجام واکنشPCR ………………………………………………………………….58

جدول 3-12 لیست پرایمر های مورداستفاده در این تحقیق ……………………………………………….. 59

جدول 3-13 برنامه PCR استفاده شده ……………………………………………………………………………. 60

جدول 3-14 مواد سازنده بافر بارگذاری …………………………………………………………………………….. 70

جدول 3-15 توالی پرایمرهای مورد استفاده برای تکثیر اگزون های ژن GJB4, GJC3,SLITRK6, NESP4 …………………………………………………………………………………………………………………………. 73

جدول5-1 مقایسه چگونگی توزیع علل ژنتیکی ناشنوایی در آمریکا و ترکیه …………………………. 98

جدول5-2لیست ژن های جهش یافته در خانواده ها …………………………………………………………..101

فهرست تصاویر

شکل 2-1 سه بخش گوش …………………………………………………………………………………………………. 9

شکل 2-2 گوش داخلی ……………………………………………………………………………………………………. 11

شکل 2-3 تفاوت بیان ژن OTOGL در دوران نوزادی و بزرگسالی ……………………………………….. 33

شکل 3-1 موقعیت مارکرهای ژنGJB4 ……………………………………………………………………………. 46

شکل 3-2 موقعیت مارکرهای ژنGJC3 …………………………………………………………………………… 47

شکل 3-3 موقعیت مارکرهای ژنSLITRK6 ……………………………………………………………………… 48

شکل 3-4 موقعیت مارکرهای ژنSERPINB6 ………………………………………………………………….. 49

شکل 3-5 موقعیت مارکرهای ژنNESP4 ………………………………………………………………………… 50

شکل 3-6 موقعیت مارکرهای ژنCABP2 ……………………………………………………………………….. 51

شکل 3-7 موقعیت مارکرهای ژنOTOGL ……………………………………………………………………….. 52

شکل 4-1 ژل پلی آکریل آمید مربوط به تعیین هتروزیگوسیتی مارکرD1S1570 ……………….. 76

شکل 4-2 شجره خانواده L-3082 ……………………………………………………………………………………. 79

شکل 4-3 مارکرD1S1570 که به این ژن پیوستگی نشان داد ………………………………………….. 79

شکل 4-4 مارکرD1S496 که به این ژن پیوستگی نشان داد ……………………………………………. 80

شکل 4-5 مارکرD1S195 که به این ژن پیوستگی حاوی اطلاعات مفید نشان نداد …………….. 80

شکل 4-6 موقعیت مارکرهایی که پیوستگی نشان دادند، خانواده L-3082 ………………………… 81

شکل 4-7 شجره خانواده L-1902 …………………………………………………………………………………… 81

شکل 4-8 مارکرD7S2498 که به این ژن پیوستگی نشان داد. ………………………………………… 82

شکل 4-9 مارکرD7S477 که به این ژن پیوستگی نشان داد. …………………………………………… 82

شکل 4-10 مارکرD7S2480 که به این ژن پیوستگی نشان داد. ……………………………………….. 83

شکل 4-11 موقعیت مارکرهایی که پیوستگی نشان دادند، خانواده L-3082 ………………………. 83

شکل 4-12 شجره خانواده L-346 ………….………..………………………………………………… 84 شکل 4-13 مارکرD13S251 که به این ژن پیوستگی نشان داد. ………………………………………. 84

شکل 4-14 مارکرD13S253 که به این ژن پیوستگی حاوی اطلاعات مفید نشان نداد. ……….. 85

شکل 4-15 مارکرD13S282 که به این ژن پیوستگی حاوی اطلاعات مفید نشان نداد. ……….. 85

شکل 4-16 موقعیت مارکری که پیوستگی نشان داد، خانواده L-346 …………………………………. 86

شکل 4-17 شجره خانواده L-346 ……………………………………………………………………………………. 86

شکل 4-18 مارکرD19S909 که به این ژن پیوستگی نشان داد. ………………………………………. 87

شکل 4-19 مارکرD19S876 که به این ژن پیوستگی نشان داد. ………………………………………… 87

شکل 4-20 مارکرATA57C01 که به این ژن پیوستگی حاوی اطلاعات مفید نشان نداد. …… 88

شکل 4-21 موقعیت مارکری که پیوستگی نشان داد، خانواده L-346 …………………………………. 88

شکل 4-22 شجره خانواده L-1731 ………………………………………………………………………………….. 89

شکل 4-23 مارکرD6S1617 که به این ژن پیوستگی نشان داد. ………………………………………. 89

شکل 4-24 مارکرD6S1713 که به این ژن پیوستگی نشان داد. ……………………………………….. 90

شکل 4-25 مارکرD6S344 که به این ژن پیوستگی نشان داد. …………………………………………. 90

شکل 4-26 موقعیت مارکری که پیوستگی نشان داد، خانواده L-1731 ………………………………. 91

شکل 4-27 شجره خانواده L-3163 …………………………………………………………………………………. 91

شکل 4-28 مارکرD11S1889 که به این ژن پیوستگی نشان داد. ……………………………………. 92

شکل 4-29 مارکرD11S1296 که به این ژن پیوستگی حاوی اطلاعات مفید نشان نداد. …….. 92

شکل 4-30 مارکرD11S4155 که به این ژن پیوستگی حاوی اطلاعات مفید نشان نداد. …….. 93

شکل 4- 31 موقعیت مارکری که پیوستگی نشان داد، خانواده L-3163 ……………………………… 93

شکل 4-32 شجره خانواده L-8700187 ………………………………………………………………………….. 94

شکل 4-33 مارکرD12S1297 که به این ژن پیوستگی نشان داد . ………………………………… 94

شکل 4- 34مارکرD12S824 که به این ژن پیوستگی حاوی اطلاعات مفید نشان نداد. ……… 95

شکل 4-35 مارکرD12S64 که به این ژن پیوستگی نشان داد. ………………………………………… 95

شکل 4-36 موقعیت مارکری که پیوستگی نشان داد، خانواده L-8700187 ………………………. 96

• مقدمه

ناشنوایی یکی از ناتوانایی های حسی می باشد که تعداد زیادی در دنیا به آن مبتلا هستند. خطر خاصی مبتلایان ناشنوایی را تهدید نمی کند ولی زندگی روزمره آن ها را تحت تاثیر قرار می دهد. در کشورهای پیشرفته یک در هر هزار کودک، دچار ناشنوایی شدید در زمان بدو تولد و یا دوران پیش زبانی می شوند. ناشنوایی که قبل از حرف زدن اتفاق می افتد راناشنوایی پیش زبانی[1] و ناشنوایی بعد از صحبت کردن کودک راناشنوایی پس زبانی [2]می گویند. ناشنوایی پس کلامی، بسیار رایج تر از ناشنوایی پیش کلامی بوده و4 در صد از جمعیت زیر 45 سال، 10 درصد از جمعیت بالای 65 سال و 50 در صد از جمعیت بالای 80 سال را در بر می گیرد. اغلب بیماران با ناشنوا یی پس کلامی، توارث چند عاملی دارند ولی در موارد تک ژنی به طور عمده از توارث اتوزومی غالب پیروی می کنند[1].

درحدود 60 در صد علل ناشنوایی ژنتیکی، 30 در صد اکتسابی و 10 در صد آن ادیوپاتیک است.[1] ناشنوایی می تواند به روش های مختلفی طبقه بندی شود: پیش زبانی یا پس زبانی، سندرمی (%30-20) یا غیرسندرمی (%80-70) و بر اساس وجود یا عدم وجود علایم بالینی یا آزمایشگاهی مشخص شده، طبقه بندی شود. انواع ناشنوایی سندرمی همراه با علائم بالینی دیگری می باشد، در حالیکه در ناشنوایی غیر سندرمی تنها علامت بالینی بیمار، همان ناشنوایی وی می باشد .[2] ناشنوایی سندرمی در مقایسه با نوع غیر سندرمی از هتروژنیتی کمتری برخوردار می باشد.همچنین ناشنوایی می تواند به صورت تعادلی در گوش میانی و خارجی یا به صورت عصبی در گوش درونی ایجاد شود.