2 مواد و روش­ها…………………..25

2-1 حیوان.25

2-2 تولید رویان آزمایشگاهی26

2-2-1 استحصال اسپرم. 26

2-2-1-1 آماده­سازی محیط و قطره­ها 26

2-2-1-2 جابجایی مهره­ی گردنی.. 27

2-2-1-3 تشریح موش نر و جداسازی اپیدیدیم. 28

2-2-1-4 جمع­آوری و ظرفیت­پذیری اسپرم. 29

2-2-2 استحصال تخمک… 31

2-2-2-1 تحریک تخمک­گذاری.. 31

2-2-2-1-1 تزریق داخل صفاقی.. 31

2-2-2-2 آماده­سازی محیط و قطره­ها 32

2-2-2-3 جابجایی مهره­ی گردنی.. 32

2-2-2-4 تشریح موش ماده و جداسازی لوله­ی تخم­بر. 32

2-2-2-5 جداسازی توده­ی تخمک-کومولوس… 33

2-2-3 لقاح آزمایشگاهی.. 34

2-2-3-1 آماده­سازی محیط و قطره­ها 34

2-2-3-2 لقاح.. 35

2-2-4 کشت آزمایشگاهی.. 35

2-2-4-1 آماده­سازی محیط و قطره­ها 35

2-2-4-2 کشت رویان. 36

2-3 تولید رویان درون­تنی37

2-3-1 تحریک تخمک­گذاری و جفت اندازی موش­ها 37

2-3-2 آماده­سازی محیط و قطره­ها 37

2-3-3 جابجایی مهره­ی گردنی.. 37

2-3-4 تشریح موش ماده و جداسازی لوله­های رحمی.. 37

2-3-5 استحصال بلاستوسیست… 38

2-4 سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست39

2-4-1 آماده­سازی محیط و قطره­ها 39

2-4-2 آماده­سازی و تنظیم دستگاه ریز­دستکاری.. 40

2-4-3 روش کار. 40

2-5 انجماد رویان41

2-5-1 انجماد شیشه­ای.. 41

2-5-1-1 آماده­سازی محیط و قطره­ها 41

2-5-1-2 روش کار. 42

2-5-2 یخ­گشایی.. 43

2-5-2-1 آماده­سازی محیط و قطرات… 43

2-5-2-2 روش کار. 44

2-6 بررسی بیان ژن.45

2-6-1 استخراج RNA از بلاستوسیست… 45

2-6-2 ساخت cDNA.. 46

2-6-3 طراحی پرایمر. 47

2-6-4 رقیق­سازی پرایمرها 47

2-6-5 واکنش زنجیرهای پلیمراز. 48

2-6-6 ژل الکتروفورز محصولات PCR.. 49

2-6-7 واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی.. 49

2-7 طراحی آزمایش52

2-7-1 کاهش مایع بلاستوسل رویان­های درون­تنی موش، قبل از انجماد شیشه­ای52

2-7-2 کاهش مایع بلاستوسل رویان­های برون­تنی موش، قبل از انجماد شیشه­ای..52

2-7-3 آنالیز آماری.. 52

3 نتایج.54

3-1 کاهش مایع بلاستوسل رویان­های درون­تنی موش قبل از انجماد شیشه­ای……………54

3-1-1 نرخ زنده­مانی و خروج از زونا 54

. 56

3-1-2-1 واکنش زنجیرهای پلیمراز. 56

3-1-2-2 واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی.. 57

3-2 کاهش مایع بلاستوسل رویان­های برون­تنی موش قبل از انجماد شیشه­ای.62

3-2-1 نرخ زنده­مانی و خروج از زونا 62

. 64

4 بحث و نتیجه­گیری67

5 فهرست منابع..76

6 پیوست­ها83

فهرست جداول

جدول ‏1‑1: ترکیبات محیط HTF. 14

جدول ‏1‑2: ترکیبات محیط KSOM.. 16

جدول ‏2‑1: محلول­های مورد نیاز برای انجماد شیشه­ای بلاستوسیست موش.. 42

جدول ‏2‑2: محلول­های مورد نیاز برای یخ­گشایی بلاستوسیست موش.. 44

جدول ‏2‑3: مواد مورد استفاده جهت ساخت cDNA. 46

جدول ‏2‑4: چرخه­های حرارتی ساخت cDNA. 46

جدول ‏2‑5: مشخصات پرایمرهای طراحی شده 47

جدول ‏2‑6: مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز 48

جدول ‏2‑7: چرخه­های حرارتی مراحلPCR 48

جدول ‏2‑8: مواد مورد نیاز جهت انجام Real Time PCR. 50

جدول ‏2‑9: چرخه­های حرارتی Real Time PCR. 50

جدول ‏3‑1: میزان زنده­مانی و میزان خروج از زونای بلاستوسیست درون­تنی موش.. 55

جدول ‏3‑2: میزان زنده­مانی و میزان خروج از زونای بلاستوسیست برون­تنی موش. 63

فهرست اشکال

شکل ‏1‑1: مراحل مختلف تکوین پیش از لانه­گزینی در موش.. 2

شکل ‏1‑2: بخش­های مختلف لوله­ی تخم­بر. 3

شکل ‏1‑3: فرایند گامت­زایی. 4

شکل ‏1‑4: اسپرم و تخمک پستانداران. 5

شکل ‏1‑5: قطبیت رویان موش. 6

شکل ‏1‑6: تقسیم مرحله­ی 8 به 16 سلولی. 7

شکل ‏1‑7: تشکیل حفره­ی بلاستوسل. 7

شکل ‏1‑8: آرایش سیستم­های انتقالی در سلول­های تروفواکتودرم 8

شکل ‏1‑9: بلاستوسیست در حال خروج از زونا 9

شکل ‏1‑10: مسیر تمایز رده تروفواکتودرم در موش. 10

شکل ‏1‑11: جدایی دو رده سلولی اندودرم اولیه و اپی­بلاست در سه مرحله 11

شکل ‏1‑12: دخالت مسیر پیام­رسان FGF/MAPK 13

شکل ‏1‑13: فرایند شیشه­ای شدنمحیط انجماد. 21

شکل ‏1‑14: روش­های مختلف سوراخ کردن مصنوعی حفره­ی بلاستوسل. 24

شکل ‏2‑1: قفس­های دارای سیستم تهویه­ی مجزا 26

شکل ‏2‑2: پتری دیش استحصال اسپرم 27

شکل ‏2‑3: جابجایی مهره­های گردنی. 28

شکل ‏2‑4: تشریح موش نر 29

شکل ‏2‑5: جمع­آوری اسپرم 30

شکل ‏2‑6: نحوه­ی جمع­آوری اسپرم­های زنده از حاشیه­ی قطره­ی محیط کشت.. 30

شکل ‏2‑7: نحوه­ی ترزیق داخل صفاقی موش.. 31

شکل ‏2‑8: پتری دیش استحصال تخمک.. 32

شکل ‏2‑9: جداسازی لوله­ی تخم­بر. 33

شکل ‏2‑10: جداسازی توده­ی تخمک-کومولوس.. 34

شکل ‏2‑11: پتری دیش IVF. 34

شکل ‏2‑12: تخمک-کومولوس­های مجزا 35

شکل ‏2‑13: نحوه­ی قطره­گذاری محیط KSOM در پلیت کشت رویان. 36

شکل ‏2‑14: جداسازی لوله­های رحمی. 38

شکل ‏2‑15: استحصال بلاستوسیست از لوله­ی رحمی. 39

شکل ‏2‑16: پتری دیش ریز دستکاری. 40

شکل ‏2‑17: نحوه­ی سوراخ کردن حفره­ی بلاستوسیست.. 41

شکل ‏2‑18: نحوه­ی قطره­گذاری محلول­های انجماد شیشه­ای. 42