1-3-5- پیلی……………………………………………………………………………………………………………………28

1-4-5- ایمونوگلوبولین A₁پروتئاز……………………………………………………………………………….30

1-5-5- لیپوپلی ساکارید (LPS) …………………………………………………………………………………………………………………………………..31

1-6-5- نقش LPS در بیماری زایی……………………………………………………………………………………………………………………………..32

1-1-6 کپسول…………………………………………………………………………………………………………………34

1-2-6- دخالت کپسول در بیماری زایی………………………………………………………36

1-3-6- ژنتیک بیان کپسول………………………………………………………….36

1-1-8 روش­ها و آزمون­های تشخیص آزمایشگاهی………………………………………………………38

1-2-8 روش­های تشخیص کلاسیک……………………………………………………………………………………….38

1-3-8- معایب تشخیص کلاسیک……………………………………………………………………………………39

1-4-8- برتری روش­های تشخیص مولکولی………………………………………………………………………………..40

1-1-9- اپیدمیولوژی …………………………………………………………………………..40

1-1-10- پیشگیری …………………………………………………………………………………………….44

1-1-11- درمان……………………………………………………………………………………………………………45

2-1 واکسن های کونژوگه…………………………………………………………………….48

2-2- واکسن های Hib………………………………………………………………………………………..49

2-3- پاسخ های واکسن کونژوگه…………………………………………..50

2-4- پاسخ های واکسن پلی ساکاریدی…………………….51

2-5- عوامل دخیل در ایمونوژنسیتی واکسن های کونژوگه پلی ساکاریدی – پروتئینی………………………………………………………………..51

2-5-1- طول زنجیره پلی ساکاریدی ………………………………..51

2-5-2- نوع اتصال…………………………………………………………………………………………………52

2-5-3- مولکول های حامل ……………………………………………………52

2-6-EDC یا EDAC…………………………………………………………………………………………52

2-7- کونژوگاسیون به روش آمیداسیون ………………………………………………………53

2-8- تهیه کونژوگه ایمونوژن هاپتن¹– حامل……………………………………………………….54

2-9- پروتئین های حامل مناسب برای ایجاد کونژوگه های آنتی ژنیک…………………………………………………..55

2-10- ادجوانت های مناسب در طراحی واکسن کونژوگه………………………………………………………………………………….56

2-11- سنجش فعالیت باكتری كشی……………………………………………………………………56

فصل سوم- مواد و روش ها

3-1-1 مواد و وسایل لازم ……………………………………………………………………60

3-2-1- تهیه میكروارگانیسم های به كار گرفته شده در این مطالعه……………………………………………………………………………………………………66

3-2-2-باز كردن سویه باکتری همو فیلوس آنفولانزای تیپ b لیوفیلیزه و کشت آن……………………………………………………………66

3-2-3-فرآوردن و تخلیص PRP………………………………………………………………………………………………………..66

3-2-4- تهیه بذر محیط کشت …………………………………………………..66

3-2-5-تیمار عصاره مخمر…………………………………………………………………..67

3-2-6-آماده کردن فرمانتور و تلقیح بذر ………………………………………………………………………………………………..70

3-2-7-نمونه گیری از فرمانتور…………………………………………………..72

3-2-8- مرحله رسوب دهی الکلی………………………………………..73

3-2-9- مرحله الکل زنی ……………………………………………………………………….73

3-2-10- مرحله شست و شو با کلریدمنیزیم………………………………………………………………………………………….74

3-2-11- تیمار با ستاولن…………………………………………………………………………74

3-2-12- افزودن فسفات سدیم………………………………………………….75

3-2-13- مرحله الکل زنی مجدد…………………………………………..75

3-2-14- تیمار با هیدروکسیل آپاتیت………………………………75

3-2-15- فیلتراسیون سوپرناتانت …………………………………………76

3-2-16- لیوفلیزاسیون ……………………………………………………………………………….76

3-2-17- تعیین خلوص PRP تخلیص شده ………………………………………………………………………………………………………….76

3-2-18- تست ریبوز …………………………………………………………………………………76

3-2-18- 1- اساس تست بیال …………………………………………..77

3-2-18- 2- معرف های تست بیال ……………………………….77

3-2-18- 3-محلولها و ترکیبات ………………………………………….77

3-2-18- 4-تهیه ی محلول های استاندارد ریبوز ………………………………………………………………………..77

3-2-18- 5- آماده سازی PRP تخلیص شده ……………………………………………………………………………….79

3-3-1- آزمون های پروتئین سنجی ……………………………………………………………………………………………….79

3-3-2روش برادفورد …………………………………………………………………………………..81

3-3-3- روش پروتئین سنجی Lowry ………………………………………………………………81

3-4-1- آزمون ایمونو ژل دیفیوژن ………………………………………………………………….83

3-5- سنجش نوکلئیک اسید …………………………………………………………………………………………………….83

3-6-تخلیص اگزوتوسین A سودوموناس آئروژینوزا PA103 …………………………………………………………………….84

3-6-1- طرز باز كردن سوش لیوفیلیزه جدید …………………………………………………………………………..84

3-6-2-تهیه لوله بذر ……………………………………………………………………………………….84

3-6-3- اطمینان از خالص بودن سوش …………………………………………………………………………..85

3-6-4- تست سوش برای تولید اگزوتوکسین A ………………………………………………………………………………………………..85

3-6-5-تهیه محیط کشت ………………………………………………………………………85

3-6-7- رسوب با استات روی 1 مولار ………………………………………………………….87

3-6-8- رسوب با سولفات آمونیوم …………………………………………………………………………………………..87

3-6-9- دیالیز اگزوتوكسین A …………………………………………………………………………….88

3-6-10- کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل اگزوتوكسین A ………………………………………………………………………………..89

3-16-2-1مواد مورد نیاز: ………………………………………………………………………89

3-6-11سنجش تولید اگزوتوكسین ………………………………………………………..89

3-6-11-1-سنجش توکسیسیتی ……………………………………………………………………………….90

3-6-12- دتوكسیفای كردن اگزوتوكسین A به روش فرمآلدیئد ……………………………………………………………………………91

3-7- ژل فیلتراسیون جهت تخلیص كونژوگه PRP هموفیلوس آنفولانزای تیپb (Hib) با اگزو توکسین A سودوموناس آئروژینوزا …………………..92

3-8- آزمون های کنترل و کیفی کونژوگه …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….92

3-9- سنجش پروتئین …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………92

3-11- تعیین میزان اسید نوکلئیک …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..93

3-12- كنترل توكسیسیته غیرعادی((Abnormal toxicity ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………94

3-13- آزمون پیروژنی ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….94

3-14- ایمیونیزاسیون خرگوشها و خونگیری …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………94

3-15تهیه بافر باربیتال : ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..94

3-16- تهیه محلول کوماسی بلو و رنگ بر : ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….94

3-16- پلی آكریل آمید ژل الكتروفورز درحضور سدیم دو دسیل سولفات(SDS-PAGE) ………………………………………………………..96

3-16-1- اصول روش SDS-PAGE …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….96

3-16-3- محلول­های مورد نیاز ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….97

3-16-4- تهیه ژل پایین SDS-PAGE ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….97

3-16-5- تهیه ژل بالا با SDS-PAGE …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………98

3-16-6-رنگ آمیزی ژل پلی آكریل آمید ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………99

3-16-7- محلول­های مورد نیاز ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………100

3-16-8- روش رنگ آمیزی …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………101

3-17- آزمون بررسی فعالیت باکتریسیدالی سرم حیوان ایمیون (SBA) ………………………………………………………………………………………………………………………………….101

3-17-1- اصول آزمون SBA ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….101

3-17-2- مواد مورد نیاز برای آزمون SBA Serum Bactericidal Assay)) …………………………..101

3-17-3-روش انجام آزمون ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………102

فصل چهارم: نتایج

4-1-کشت سویه باکتری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….107

4-2- شرایط کشت در فرمانتور……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..108

4-3- تعیین خلوص PRP ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..109

4-4- اندازه گیری میزان ریبوز ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….111

4-5- کنترل میزان پروتئین در پلی ساکارید PRP و ETA و PRP- ETA……………………………………………………………………………………………………………..113

4-6- کنترل میزان اسید نوکلئیک در پلی ساکارید PRP و PRP- ETA………………………………………………………………………………………………………………………..113

4-7- کونژوگاسیون PRP با اگزوتوکسینA سودوموناس آئروژینوزا……………………………………………………………………………………………………………………………………………………114

4-8- بازده کونژوگاسیون PRP-ETA ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………115

4-9- کنترل پیروژنی …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..115

4-10- کنترل توکسیسیتی غیر عادی در موش سوری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….116

4-11- آزمون ایمونوژل دیفیوژن…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………116

4-12- الکتروفورز (SDS-PAGE) برای بررسی وزن مولکولی …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….117

4-13- ارزیابی فعالیت باکتری كشی سرم حیوان واکسینه شده ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….117

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1- واکسن های کونژوگه ی (Hboc) PRP-CRM197………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….124

5-2- واکسن کونژوگه ی PRP-TT ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..125

5-3- واکسن کونژوگه ی PRP-OMP ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..125

5-4- تولید کپسول هموفیلوس آنفولانزای تیپ b(PRP) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..126

5-5- کونژوگاسیون PRP با اگزوتوکسین A…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….127

5-6- سرم باکتریسیدال اسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….128

نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. ……………………………………………………………….129

پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. ………… …………………………………………………………129

منابع…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 130

فهرست شکل ها

شکل 1-1 کلونی هموفیلوس آنفلوانزا در محیط شکلات آگار……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..19

شکل1-2 هموفیلوس آنفلوانزا………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….20

شکل1-3 تیپ های مختلف کپسول هموفیلوس آنفلوآنزا…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………35

شکل 1-4 پراکندگی سنی عفونت Hib از اکتبر 1990 تا سپتامبر 1991 در شش منطقه در انگلستان و والس. از 433 مورد گزارش شده (84%) 362 مورد به علت hib ، (13%) 54 مورد به علت غیر سروتیپی و 13 مورد سروتیپ نشده بودند…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….41

شکال3-1- باز کردن سویه PTCC هموفیلوس آنفلوانزا……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..67

شکال3-2- تیمار عصاره مخمر . چپ: تغییر رنگ آب در روز اول دیالیز عصاره مخمر.راست: روز سوم دیالیز عصاره مخمر بدون تغییر رنگ آب……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………70

شکال3-3- فرمانتور Novo-Paljas کشور هلند………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………71

شکال3-4 راست: اضافه کردن عصاره مخمر و فاکتور رشد – چپ : اضافه کردن بذر به محیط کشت…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..72

شکال3-5رسوب حاصل از الکل زنی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..74

شکل3-6 تهیه استانداردهای ریبوز(الف -قبل از حرارت ، ب – بعد از حرارت) …………………………………………………………………………………………………………….78

شکل 3-7 رسوب با سولفات آمونیوم…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….88

شکل 3-8 دیالیز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………89

شکل 4-1کلونی هموفیلوس آنفلانزا روی محیط شکلات آگار………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………107

شکل 4-2 تست آکروفلاوین…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….107

شکل 4-3 طیف سنجی NMR ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….110

شکل 4-4 منحنی FTIR……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..111

شکل 5-5 آزمون ایمونوژل دیفیوژن…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….116

شکل 4-6- الکتروفورز (SDS-PAGE) برای PRP-ETA و ETA…………………………………………………………………………………………………………………………………..117

فهرست جدول ها و نمودارها

نمودار 3-1نمودار استاندارد لوری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..83

جدول 4-1 شاخص های فرمانتاسیون Hib جدول…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..108

نمودار 4-1 تغییرات جذب نوری برای رشد Hib…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….109

نمودار 4-2 تغییرات PH در رشد Hib…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….109

نمودار 4-3 تغییرات گلوکز در رشد Hib……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………110

جدول 4-2 تهیه استاندارد برای غلظت ریبوز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………112

نمودار 4-4- منحنی استاندارد ریبوز……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………112