……………………………………………………………………………………………………………………. 25

1-9-تشخیص توکسوپلاسموز………………………………………………………………………………………………………. 29

1-9-1- تشخیص مستقیم…………………………………………………………………………………………………………… 29

1-9-1-1-تشخیص هیستولوژی (بافت شناسی…………………………………………………………………………. 29

1-9-1-2- جداسازی توکسوپلاسما گوندی……………………………………………………………………………….. 30

1-9-1-3-تکنیک واکنش زنجیری پلیمراز (PCR1-15-2-تشخیص غیر مستقیم……………… 30

1-9-2-تشخیص غیر مستقیم ……………………………………………………………………………………………………… 31

1-9-2-1- تست رنگی سابین – فلدمن……………………………………………………………………………………. 34

1-9-2-2- سنجش آنتی بادی فلوئورسنت غیر مستقیم………………………………………………………….. 34

1-9-2-3- تست سنجش آگلوتیناسین ایمنوسوربنت………………………………………………………………. 35

1-10-الایزا (ELISA)…………………………………………………………………………………………………………………. 35

1-10-1- الایزای مستقیم ………………………………………………………………………………………………………….. 36

1-10-2- الایزای غیر مستقیم……………………………………………………………………………………………………. 36

1-10-3- الایزای ساندویچ…………………………………………………………………………………………………………… 37

1-10-3-1-الایزای ساندویچ مستقیم………………………………………………………………………………………… 37

1-10-3-2-الایزای ساندویچ غیر مستقیم…………………………………………………………………………………. 37

1-10-4- الایزای رقابتی یا مهاری………………………………………………………………………………………………. 37

1-11-کاربرد پروتئین های نوترکیب در تشخیص توکسوپلاسماَ………………………………………………. 38

1-12-تولید پروتئین نوترکیب…………………………………………………………………………………………………….. 39

1-13-تشخیص سرولوژی توکسوپلاسموزیس در دوران حاملگی……………………………………………… 39

1-14-ارزش تشخیصی ایزوتایپ های مختلف ایمونوگلوبولین

اختصاصی توکسوپلاسما در تشخیص عفونت……………………………………………………………………………….. 40

1-15-کاربرد IgGAvidity در افتراق عفونت حاد از مزمن توکسوپلاسموزیس……………………… 42

1-16-درمان 44

1-17-پیشگیری 47

1-18- بیان مسئله و اهمیت آن………………………………………………………………………………………………….. 48

1-19- دلایل انتخاب موضوع ……………………………………………………………………………………………………… 50

1-20-اهداف و فرضیا ت ……………………………………………………………………………………………………………. 51

فصل دوم: مروری بر تحقیقات گذشته

2-1- مروری بر تحقیقات گذشته …………………………………………………………………………………………………………….. 53

فصل سوم: مواد و روشها

3-1- تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی ……………………………………………………………….. 59

3-1-1-مکانیسم تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی……………………………………………… 59

3-1-2- تهیه و تخلیص پروتئین های نو تركیب rGRA7 (pUET-GRA7) و

rGRA6(PUET-GRA6 ……………………………………………………………………………………………………………… 60

3-2- بررسی و تائید پروتئین های تخلیص شده……………………………………………………………………….. 62

3-2-1- بررسی و تائید پروتئین های نوترکیب GRA7 و GRA6 بوسیله آنالیز SDS-PAGE 62

3-2-2- تائید هویت پروتئین بیان شده با روش وسترن بلات………………………………………………….. 66

3-3- دیالیز نمونه های تخلیص شده…………………………………………………………………………………………… 71

3-4- تعیین غلظت پروتئین………………………………………………………………………………………………………… 71

3-5- سیستم های الایزا(اصول کار) …………………………………………………………………………………………… 71

3-5-1- طراحی سیستم های الایزا…………………………………………………………………………………………….. 72

3-5-1-1- نکات تکنیکی در الایزا……………………………………………………………………………………………… 72

3-5-1-2- برخی مشکلات در الایزا…………………………………………………………………………………………… 74

3-6- بررسی پتانسیل PUET-GRA7 و PUET-GRA6 در تشخیص عفونت حاد و مزمن …

توکسوپلاسموز با روش الایزا………………………………………………………………………………………………………….. 76

3-6-1-برقراری شرایط الایزا……………………………………………………………………………………………………….. 76

3-6-2- استفاده از لیزات باکتری در الایزا ………………………………………………………………………… 76

3-7- اندازه گیری میزان آنتی بادی به روش الایزای غیر مستقیم …………………………………… 77

3-8-تعیین Cut off در روش الایزا ………………………………………………………………………………………….. 80

3-9- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgG با کیت تجاری Euroimmun ………………………………… 81

3-10- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgM با کیت تجاری Euroimmun ……………………………… 82

3-11- برقراری شرایط بهینه به منظور محاسبه Avidity Index IgG ………………………………… 82

3-12- اندازه گیری IgG Avidity Index با استفاده از پروتئین های نوترکیب PUET-GRA7 و

PUET-GRA6 83

3-13- اندازه گیری IgG Avidity Index با استفاده از کیت تجاری EUROIMMUN ….. 83

3-14- اندازه گیری IgG Avidity Index با استفاده از کیت تجاری Microgen………………… 85

3-15- محاسبه اندکس اویدیته نسبی (RAI) Relative avidity Index ……………………………… 88

3-16- کنترل کیفی ……………………………………………………………………………………………………………………. 88

3-16-1- حساسیت ……………………………………………………………………………………………………………………. 88

3-17-طراحی تحقیق ……………………………………………………………………………………………………………. 88

3-18- تعداد نمونه و روش نمونه گیری ………………………………………………………………………………….. 89

3-18-1- تعداد نمونه …………………………………………………………………………………………………………………. 89

3-18-2- روش نمونه گیری………………………………………………………………………………………………………… 89

فصل چهارم: نتایج آزمایشات

4-1 :تهیه و تخلیص پروتئین های نو تركیب rGRA7 (pUET-GRA7 و rGRA6

(PUET-GRA6 92

4-2- تایید هویت پروتئین های تخلیص شده با روش وسترن بلات ……………………………………….. 93

4-3- بررسیIgG,IgM,IgG Avidity نمونه های سرمی با کیت استاندارد Euroimmun 94

4-3-1- نتیجه آزمایشات IgG ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرمهای

ایرانی با کیت Euroimmun…………………………………………………………………………………………………………… . 95

4-3-2- نتیجه آزمایشات IgM ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرمهای با کیت Euroimmun 95

4-3-3-نتیجه آزمایشات IgG Avidity ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرم ها

با کیت Euroimmun …………………………………………………………………………………………………………………… 96

4-4- برقراری شرایط ELISA Avidity با پروتئین های نوترکیب ………………………………………. 100

4-5- نتایج آزمایش Avidity ELISA با استفاده از پروتئین نوترکیب GRA6 برای تمایز

عفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار……………………………………………………………………………….. 103

4-6- نتایج آزمایش Avidity ELISA با استفاده از پروتئین نوترکیب GRA7 برای تمایز

عفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار ایران …………………………………………………………………….. 103

4-7- بررسی نتایج ناهمخوان بین الایزا اویدیته با پروتئین های GRA6 وGRA7 و کیت

Euroimmun با استفاده از کیت Microgen………………………………………………………………………………. 104

فصل پنجم:بحث، پیشنهادات

منابع 121

خلاصه انگلیسی ………………………………………………………………………………………… 127

ضمائم 129

فهرستجداول

عنوان صفحه

جدول3-1: جدول ارزیابی اویدیتی در کیت میکروژن……………………………………………………………….. 87

جدول 4-1: نتایج آزمایشات Avidity ELISA,IgG,IgM سرم ها با کیت Euroimmon……… 97

جدول 4-2: بررسی نتایج ناهم خوان با کیت های Microgen,Euroimmun و پروتئین های

GRA6 وGRA7 ……………………………………………………………………………………………………………………. 106

جدول شماره 4-3: نتایج آزمایش IgG وIgG Avidity با پروتئین های GRA6 و GRA7

بر روی سرم های زنان باردار ………………………………………………………………………………………………… ….. 108

فهرست شکل ها

عنوان صفحه

شکل1-1- شكل شماتیك یك تاكی زوایت و یك برادی زوایت توكسوپلاسما گوندی ………….. 4

شکل1-2- عكس میكروسكوپ الكترونی یك تاكی زوایت، سوش VEGكه در حال

نفوذ به یك نوتروفیل صفاق موش می باشد…………………………………………………………………………………. 7

شکل1-3- عکس میکروسکوپ الکترونی از تاکی زوایت سوش VEG در حال تقسیم

اندودیوژنی داخل ماکروفاژ صفاق موش………………………………………………………………………………………… 8

شکل1-4- یك كیست بافتی توكسوپلاسما كه حاوی بیش از هزار برادی زوایت می باشد……. 9

شکل 1-5- راه های انتقال انگل توکسوپلاسما گوندی در میزبان اصلی و حد واسط……………… 16

شکل 1-6- دختری با هیدروانسفالی بعلت توکسوپلاسموز مادرزادی……………………………………….. 25

شکل 1-7- شکل شماتیک انواع الایزا…………………………………………………………………………………………. 38

شکل3-1:نوارهای کیت میکروژن…………………………………………………………………………………………………. 87

شکل 4-1 : تخلیص پروتئین GRA6 به روش کروماتوگرافی تمایلی …………………………………….. 92

شکل 4-2: تخلیص پروتئین GRA7 به روش کروماتوگرافی تمایلی ……………………………………….. 93

شکل 4-3: بررسی هویت آنتی ژنیسته پروتئین های GRA6 وGRA7

تخلیص شده باروش وسترن بلات ……………………………………………………………………………………………….. 94

شکل 4-4 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما

در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA6 ………………………………………………………………………… 101

شکل 4-5 : تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمن

عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA6………………………………………. 101

شکل 4-6 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما

در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA7………………………………………………………………………….. 102

شکل 4-7 : تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمن

عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA7……………………………………….. 102

شکل4-8: مدلی از بلوغ آنتی بادی های IgG به آنتی ژن های توکسوپلاسمای………………………. 105

شکل 4-9: نتایج کیت میکروژن………………………………………………………………………………………………………………… 106

شکل4-10: مقایسه اجرای تست Avidity با کیت Euroimmun و پروتئین GRA6 برای افتراق

عفونت حاد و مزمن و تحت حاد………………………………………………………………………………………………….. 107

چکیده فارسی

توکسوپلاسموزیس که توسط انگل اجباری درون سلولی توکسوپلاسما گوندی، ایجاد می شود. در افرادی که از سیستم ایمنی سالمی برخوردارند، عفونت اولیه معمولاً بدون علائم ویا با عوارض خفیفی همراه است، ولی در نوزادانی که عفونت را به طور مادرزادی دریافت کرده اند، ممکن است منجر به عوارض خطرناکی مثل عقب ماندگی ذهنی، کوری و یا حتی مرگ شود. بنابراین تشخیص صحیح عفونت اخیر (recent) توكسوپلاسما و تمایز آن از عفونت مزمن در زنان باردار، اهمیت حیاتی در مراقبتهای درمانی مادر و جلوگیری از بروز عوارض عصبی- مغزی در جنین دارد. از آنجایی که پاسخ آنتی بادی های IgM در درصد قابل ملاحظه ای از افراد، ماه ها یا حتی سال ها پس از کسب عفونت، مثبت باقی می ماند، تمایز صحیح میان عفونت حاد و مزمن به ویژه در زنان باردار، اهمیت فوق العاده ای دارد. در حال حاضر، بنظر می رسد تركیب دو روش الایزای IgM و الایزای آویدیته IgG بهترین و مطمئن ترین نتایج را برای تشخیص عفونت حاد و تمایز آن از عفونت مزمن می دهند. شرایط بهینه روش IgG avidity ELISA برای تمایز سرم ها از عفونت حاد ومزمن با استفاده از دو پروتئین GRA7 وGRA6 برقرار (develop) شد. در نهایت ،كارایی روش avidity ELISA با استفاده از دو پروتئین فوق برای تشخیص عفونت حاد و مزمن در زنان باردار بررسی شد. در این تحقیق از کیت استاندارد Microgen جهت مقایسه نتایج ناهمخوان مابین کیت Euroimmun و پروتئین های نوترکیب GRA6 وGRA7 استفاده شد، نتایج بدست آمده از کیت Microgen دقیقا شبیه با پروتئین های نوترکیب بود. دراین تحقیق از 21 سرم حاد و 28 سرم مزمن و 29 سرم تحت حاد زنان مبتلا به توکسوپلاسما كه حاد و مزمن وتحت حاد بودن آن با استفاده از تست های استاندارد سرولوژیك برای ما مشخص شده بود استفاده شد . از21 سرم حاد در آویدیته الایزا با پروتئین GRA6 ، تنها 1 سرم آویدیته بالا داشت و از 28 سرم مزمن ، 2سرم آویدیته پایین داشت و از 29 سرم تحت حاد 5 سرم آویدیته پایین داشتند. در آزمایش با پروتئین GRA7 از 21 سرم حاد، 1 سرم آویدیته بالا داشتند و از 28سرم مزمن همه سرم ها آویدیته بالا داشتند و از 29 سرم تحت حاد ، 6 سرم آویدیته پایین داشتند.همچنین در این تحقیق تعدادی از سرم ها که نتایج ناهمخوانی ما بین کیت Euroimmun و پروتئین های نوترکیب GRA6 و GRA7داشتند را با استفاده از کیت استاندارد Microgen بررسی کردیم که نتایج این کیت استاندارد شبیه پروتئین های نوترکیب GRA6 و GRA7بخصوص پروتئین GRA6 بود که این یافته ها کارایی بهتر GRA6 را نشان می دهد. استفاده از آنتی ژنهای نوترکیب به جای آنتی ژنهای توتال انگل در کیت تشخیصی آویدیته الایزا ممکن است منجر به افزایش کارایی آنها شده و استانداردسازی کیتها را نیز تسهیل کند.