……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 49

4-4 معین کردن اندازه مینیمال مجموعه……………………………………………………………………………………………………………………. 57

4-5 کارایی بهتر……………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 58

4-6 مقایسه نوع دیگری از دنباله ها…………………………………………………………………………………………………………………………… 60

مراجع

واژه نامه فارسی به انگلیسی………………………………………………………………………………………………………………………………….. 65

واژه نامه انگلیسی به فارسی……………………………………………………………………………………………………………………………………… 67

فهرست جدول ها

3-1 TNest(n, k)تعدادی از توپولوژی ه ای روی یک مجموعه−n نقطه ای ترتیب کلی شامل مجموعه محدب آشیانه ای است 33

3-2 تعدادTcvx(n) وTnest(n) از توپولوژی محدب آشیانه ای و توپولوژی محدب روی یک مجموعه ی ترکیب کلی–nنقطه ای، و تعدادT(n) از توپولوژی روی یک مجموعه ی–nنقطه است……………………………………………………………………………………. 40

4-1 تعدادی از اعدادمینیمال از نقاطm(k) هستند که برای ساختن یک توپولوژی دارایkمجموعه باز در محاسباتی در (27) به ازای]٢,٢۵k∈[ نیاز داریم………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 44

4-2 مقادیرf(n)را به ازای 10n≤بدست می آوریم ، در سطر پایین اندازه اندازه کوچکترین توپولوژی که بیشتر از 1 است، با استفاده از قضیه بالا بدست نمی آید، در این صورت^4/(2–(n2³از قضیه بالا بدست می آید، واعداد بدست امده را برای اینکه به اعداد صحیح تبدیل شوند، به سمت پایین روند می کنیم………………………………………………………………………………………………………………………………………… 44

فهرست شکل ها

• گراف جهتدار رابطهR……………. …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..8

2-1 شبکه ای از مقسوم علیه های عدد صحیح 60 است که به صورت مرتب تقسیم شده است…………………………………………………………. 14

2-2 شبکه ای از ریز مجموعه های{x, y, z}……………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 15

• …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 19

• …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 20

• شکل های توپولوژی برای) ,16 T(n …………………………………………………………………………………………………………………………………………. 21

• شکل های توپولوژی برای) ,16 T(n …… …………………………………………………………………………………………………………………………………….22

• …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 26

• …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 28

• ……………………………………………………………………………………………. ……………………………………………………………………………………………………………………28

3-1 یک نمونه از توپولوژی روی(8و1) است………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 37

3-2 در مثال ممکن است نقطه اضافه شده به خارج همسایگی ها شامل هیچ یک از همسایگی ها نباشد یا خارج دوتا همسایگی باشد و شامل یک همسایگی و همچنین امکان دارد شامل سه همسایگی باشد.. ……………………………………………………………………………………………………….38

3-3 امکان انتخاب برای MN(9) وجود دارد اگر همسایگی مینیمال MN(J) بسطی برای

(8و1)j∈ نباشد………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 38

3-4 امکان انتخاب برایMN(9)وجود دارد اگرMN(2)وMN(6)بسطی شامل 9 باشند………………………………………………………………………… 39

4-1 مجموعه ترتیب جزئی) P(T مربوط به توپولوژی القاء شده T به وسیله توپولوژیT در مثال2.4 اس

4-2 شیوه قضیه 3.3 به ازای K=105که در آن K₂=1101001 است…………………………………………………………………………………………………………… 51

4-3 شیوه قضیه 7.3 به ازای K=5550 که در آن K2=1010110101110 دوگان ایده آل مرتب یکریخت به• ⊕•است، که به وسیله روش دایره ای تعریف می کنیم. ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 54

4-4 یک روش کارا برای ساختن یک مجموعه ترتیب جزئی با 65535 پادزنجیر با استفاده از 19 عنصر است 59

4-5 شیوه قضیه 3.3 را برایK=4681بکار می بریم……………………………………………………………………………………………………………………………………… 60

1-3-5- پیلی……………………………………………………………………………………………………………………28

1-4-5- ایمونوگلوبولین A₁پروتئاز……………………………………………………………………………….30

1-5-5- لیپوپلی ساکارید (LPS) …………………………………………………………………………………………………………………………………..31

1-6-5- نقش LPS در بیماری زایی……………………………………………………………………………………………………………………………..32

1-1-6 کپسول…………………………………………………………………………………………………………………34

1-2-6- دخالت کپسول در بیماری زایی………………………………………………………36

1-3-6- ژنتیک بیان کپسول………………………………………………………….36

1-1-8 روش­ها و آزمون­های تشخیص آزمایشگاهی………………………………………………………38

1-2-8 روش­های تشخیص کلاسیک……………………………………………………………………………………….38

1-3-8- معایب تشخیص کلاسیک……………………………………………………………………………………39

1-4-8- برتری روش­های تشخیص مولکولی………………………………………………………………………………..40

1-1-9- اپیدمیولوژی …………………………………………………………………………..40

1-1-10- پیشگیری …………………………………………………………………………………………….44

1-1-11- درمان……………………………………………………………………………………………………………45

2-1 واکسن های کونژوگه…………………………………………………………………….48

2-2- واکسن های Hib………………………………………………………………………………………..49

2-3- پاسخ های واکسن کونژوگه…………………………………………..50

2-4- پاسخ های واکسن پلی ساکاریدی…………………….51

2-5- عوامل دخیل در ایمونوژنسیتی واکسن های کونژوگه پلی ساکاریدی – پروتئینی………………………………………………………………..51

2-5-1- طول زنجیره پلی ساکاریدی ………………………………..51

2-5-2- نوع اتصال…………………………………………………………………………………………………52

2-5-3- مولکول های حامل ……………………………………………………52

2-6-EDC یا EDAC…………………………………………………………………………………………52

2-7- کونژوگاسیون به روش آمیداسیون ………………………………………………………53

2-8- تهیه کونژوگه ایمونوژن هاپتن¹– حامل……………………………………………………….54

2-9- پروتئین های حامل مناسب برای ایجاد کونژوگه های آنتی ژنیک…………………………………………………..55

2-10- ادجوانت های مناسب در طراحی واکسن کونژوگه………………………………………………………………………………….56

2-11- سنجش فعالیت باكتری كشی……………………………………………………………………56

فصل سوم- مواد و روش ها

3-1-1 مواد و وسایل لازم ……………………………………………………………………60

3-2-1- تهیه میكروارگانیسم های به كار گرفته شده در این مطالعه……………………………………………………………………………………………………66

3-2-2-باز كردن سویه باکتری همو فیلوس آنفولانزای تیپ b لیوفیلیزه و کشت آن……………………………………………………………66

3-2-3-فرآوردن و تخلیص PRP………………………………………………………………………………………………………..66

3-2-4- تهیه بذر محیط کشت …………………………………………………..66

3-2-5-تیمار عصاره مخمر…………………………………………………………………..67

3-2-6-آماده کردن فرمانتور و تلقیح بذر ………………………………………………………………………………………………..70

3-2-7-نمونه گیری از فرمانتور…………………………………………………..72

3-2-8- مرحله رسوب دهی الکلی………………………………………..73

3-2-9- مرحله الکل زنی ……………………………………………………………………….73

3-2-10- مرحله شست و شو با کلریدمنیزیم………………………………………………………………………………………….74

3-2-11- تیمار با ستاولن…………………………………………………………………………74

3-2-12- افزودن فسفات سدیم………………………………………………….75

3-2-13- مرحله الکل زنی مجدد…………………………………………..75

3-2-14- تیمار با هیدروکسیل آپاتیت………………………………75

3-2-15- فیلتراسیون سوپرناتانت …………………………………………76

3-2-16- لیوفلیزاسیون ……………………………………………………………………………….76

3-2-17- تعیین خلوص PRP تخلیص شده ………………………………………………………………………………………………………….76

3-2-18- تست ریبوز …………………………………………………………………………………76

3-2-18- 1- اساس تست بیال …………………………………………..77

3-2-18- 2- معرف های تست بیال ……………………………….77

3-2-18- 3-محلولها و ترکیبات ………………………………………….77

3-2-18- 4-تهیه ی محلول های استاندارد ریبوز ………………………………………………………………………..77

3-2-18- 5- آماده سازی PRP تخلیص شده ……………………………………………………………………………….79

3-3-1- آزمون های پروتئین سنجی ……………………………………………………………………………………………….79

3-3-2روش برادفورد …………………………………………………………………………………..81

3-3-3- روش پروتئین سنجی Lowry ………………………………………………………………81

3-4-1- آزمون ایمونو ژل دیفیوژن ………………………………………………………………….83

3-5- سنجش نوکلئیک اسید …………………………………………………………………………………………………….83

3-6-تخلیص اگزوتوسین A سودوموناس آئروژینوزا PA103 …………………………………………………………………….84

3-6-1- طرز باز كردن سوش لیوفیلیزه جدید …………………………………………………………………………..84

3-6-2-تهیه لوله بذر ……………………………………………………………………………………….84

3-6-3- اطمینان از خالص بودن سوش …………………………………………………………………………..85

3-6-4- تست سوش برای تولید اگزوتوکسین A ………………………………………………………………………………………………..85

3-6-5-تهیه محیط کشت ………………………………………………………………………85

3-6-7- رسوب با استات روی 1 مولار ………………………………………………………….87

3-6-8- رسوب با سولفات آمونیوم …………………………………………………………………………………………..87

3-6-9- دیالیز اگزوتوكسین A …………………………………………………………………………….88

3-6-10- کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل اگزوتوكسین A ………………………………………………………………………………..89

3-16-2-1مواد مورد نیاز: ………………………………………………………………………89

3-6-11سنجش تولید اگزوتوكسین ………………………………………………………..89

3-6-11-1-سنجش توکسیسیتی ……………………………………………………………………………….90

3-6-12- دتوكسیفای كردن اگزوتوكسین A به روش فرمآلدیئد ……………………………………………………………………………91

3-7- ژل فیلتراسیون جهت تخلیص كونژوگه PRP هموفیلوس آنفولانزای تیپb (Hib) با اگزو توکسین A سودوموناس آئروژینوزا …………………..92

3-8- آزمون های کنترل و کیفی کونژوگه …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….92

3-9- سنجش پروتئین …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………92

3-11- تعیین میزان اسید نوکلئیک …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..93

3-12- كنترل توكسیسیته غیرعادی((Abnormal toxicity ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………94

3-13- آزمون پیروژنی ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….94

3-14- ایمیونیزاسیون خرگوشها و خونگیری …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………94

3-15تهیه بافر باربیتال : ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..94

3-16- تهیه محلول کوماسی بلو و رنگ بر : ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….94

3-16- پلی آكریل آمید ژل الكتروفورز درحضور سدیم دو دسیل سولفات(SDS-PAGE) ………………………………………………………..96

3-16-1- اصول روش SDS-PAGE …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….96

3-16-3- محلول­های مورد نیاز ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….97

3-16-4- تهیه ژل پایین SDS-PAGE ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….97

3-16-5- تهیه ژل بالا با SDS-PAGE …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………98

3-16-6-رنگ آمیزی ژل پلی آكریل آمید ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………99

3-16-7- محلول­های مورد نیاز ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………100

3-16-8- روش رنگ آمیزی …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………101

3-17- آزمون بررسی فعالیت باکتریسیدالی سرم حیوان ایمیون (SBA) ………………………………………………………………………………………………………………………………….101

3-17-1- اصول آزمون SBA ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….101

3-17-2- مواد مورد نیاز برای آزمون SBA Serum Bactericidal Assay)) …………………………..101

3-17-3-روش انجام آزمون ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………102

فصل چهارم: نتایج

4-1-کشت سویه باکتری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….107

4-2- شرایط کشت در فرمانتور……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..108

4-3- تعیین خلوص PRP ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..109

4-4- اندازه گیری میزان ریبوز ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….111

4-5- کنترل میزان پروتئین در پلی ساکارید PRP و ETA و PRP- ETA……………………………………………………………………………………………………………..113

4-6- کنترل میزان اسید نوکلئیک در پلی ساکارید PRP و PRP- ETA………………………………………………………………………………………………………………………..113

4-7- کونژوگاسیون PRP با اگزوتوکسینA سودوموناس آئروژینوزا……………………………………………………………………………………………………………………………………………………114

4-8- بازده کونژوگاسیون PRP-ETA ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………115

4-9- کنترل پیروژنی …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..115

4-10- کنترل توکسیسیتی غیر عادی در موش سوری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….116

4-11- آزمون ایمونوژل دیفیوژن…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………116

4-12- الکتروفورز (SDS-PAGE) برای بررسی وزن مولکولی …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….117

4-13- ارزیابی فعالیت باکتری كشی سرم حیوان واکسینه شده ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….117

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1- واکسن های کونژوگه ی (Hboc) PRP-CRM197………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….124

5-2- واکسن کونژوگه ی PRP-TT ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..125

5-3- واکسن کونژوگه ی PRP-OMP ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..125

5-4- تولید کپسول هموفیلوس آنفولانزای تیپ b(PRP) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..126

5-5- کونژوگاسیون PRP با اگزوتوکسین A…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….127

5-6- سرم باکتریسیدال اسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….128

نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. ……………………………………………………………….129

پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. ………… …………………………………………………………129

منابع…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 130

فهرست شکل ها

شکل 1-1 کلونی هموفیلوس آنفلوانزا در محیط شکلات آگار……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..19

شکل1-2 هموفیلوس آنفلوانزا………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….20

شکل1-3 تیپ های مختلف کپسول هموفیلوس آنفلوآنزا…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………35

شکل 1-4 پراکندگی سنی عفونت Hib از اکتبر 1990 تا سپتامبر 1991 در شش منطقه در انگلستان و والس. از 433 مورد گزارش شده (84%) 362 مورد به علت hib ، (13%) 54 مورد به علت غیر سروتیپی و 13 مورد سروتیپ نشده بودند…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….41

شکال3-1- باز کردن سویه PTCC هموفیلوس آنفلوانزا……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..67

شکال3-2- تیمار عصاره مخمر . چپ: تغییر رنگ آب در روز اول دیالیز عصاره مخمر.راست: روز سوم دیالیز عصاره مخمر بدون تغییر رنگ آب……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………70

شکال3-3- فرمانتور Novo-Paljas کشور هلند………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………71

شکال3-4 راست: اضافه کردن عصاره مخمر و فاکتور رشد – چپ : اضافه کردن بذر به محیط کشت…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..72

شکال3-5رسوب حاصل از الکل زنی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..74

شکل3-6 تهیه استانداردهای ریبوز(الف -قبل از حرارت ، ب – بعد از حرارت) …………………………………………………………………………………………………………….78

شکل 3-7 رسوب با سولفات آمونیوم…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….88

شکل 3-8 دیالیز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………89

شکل 4-1کلونی هموفیلوس آنفلانزا روی محیط شکلات آگار………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………107

شکل 4-2 تست آکروفلاوین…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….107

شکل 4-3 طیف سنجی NMR ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….110

شکل 4-4 منحنی FTIR……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..111

شکل 5-5 آزمون ایمونوژل دیفیوژن…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….116

شکل 4-6- الکتروفورز (SDS-PAGE) برای PRP-ETA و ETA…………………………………………………………………………………………………………………………………..117

فهرست جدول ها و نمودارها

نمودار 3-1نمودار استاندارد لوری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..83

جدول 4-1 شاخص های فرمانتاسیون Hib جدول…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..108

نمودار 4-1 تغییرات جذب نوری برای رشد Hib…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….109

نمودار 4-2 تغییرات PH در رشد Hib…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….109

نمودار 4-3 تغییرات گلوکز در رشد Hib……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………110

جدول 4-2 تهیه استاندارد برای غلظت ریبوز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………112

نمودار 4-4- منحنی استاندارد ریبوز……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………112

……………………………………………………………………………………………………………………. 25

1-9-تشخیص توکسوپلاسموز………………………………………………………………………………………………………. 29

1-9-1- تشخیص مستقیم…………………………………………………………………………………………………………… 29

1-9-1-1-تشخیص هیستولوژی (بافت شناسی…………………………………………………………………………. 29

1-9-1-2- جداسازی توکسوپلاسما گوندی……………………………………………………………………………….. 30

1-9-1-3-تکنیک واکنش زنجیری پلیمراز (PCR1-15-2-تشخیص غیر مستقیم……………… 30

1-9-2-تشخیص غیر مستقیم ……………………………………………………………………………………………………… 31

1-9-2-1- تست رنگی سابین – فلدمن……………………………………………………………………………………. 34

1-9-2-2- سنجش آنتی بادی فلوئورسنت غیر مستقیم………………………………………………………….. 34

1-9-2-3- تست سنجش آگلوتیناسین ایمنوسوربنت………………………………………………………………. 35

1-10-الایزا (ELISA)…………………………………………………………………………………………………………………. 35

1-10-1- الایزای مستقیم ………………………………………………………………………………………………………….. 36

1-10-2- الایزای غیر مستقیم……………………………………………………………………………………………………. 36

1-10-3- الایزای ساندویچ…………………………………………………………………………………………………………… 37

1-10-3-1-الایزای ساندویچ مستقیم………………………………………………………………………………………… 37

1-10-3-2-الایزای ساندویچ غیر مستقیم…………………………………………………………………………………. 37

1-10-4- الایزای رقابتی یا مهاری………………………………………………………………………………………………. 37

1-11-کاربرد پروتئین های نوترکیب در تشخیص توکسوپلاسماَ………………………………………………. 38

1-12-تولید پروتئین نوترکیب…………………………………………………………………………………………………….. 39

1-13-تشخیص سرولوژی توکسوپلاسموزیس در دوران حاملگی……………………………………………… 39

1-14-ارزش تشخیصی ایزوتایپ های مختلف ایمونوگلوبولین

اختصاصی توکسوپلاسما در تشخیص عفونت……………………………………………………………………………….. 40

1-15-کاربرد IgGAvidity در افتراق عفونت حاد از مزمن توکسوپلاسموزیس……………………… 42

1-16-درمان 44

1-17-پیشگیری 47

1-18- بیان مسئله و اهمیت آن………………………………………………………………………………………………….. 48

1-19- دلایل انتخاب موضوع ……………………………………………………………………………………………………… 50

1-20-اهداف و فرضیا ت ……………………………………………………………………………………………………………. 51

فصل دوم: مروری بر تحقیقات گذشته

2-1- مروری بر تحقیقات گذشته …………………………………………………………………………………………………………….. 53

فصل سوم: مواد و روشها

3-1- تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی ……………………………………………………………….. 59

3-1-1-مکانیسم تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی……………………………………………… 59

3-1-2- تهیه و تخلیص پروتئین های نو تركیب rGRA7 (pUET-GRA7) و

rGRA6(PUET-GRA6 ……………………………………………………………………………………………………………… 60

3-2- بررسی و تائید پروتئین های تخلیص شده……………………………………………………………………….. 62

3-2-1- بررسی و تائید پروتئین های نوترکیب GRA7 و GRA6 بوسیله آنالیز SDS-PAGE 62

3-2-2- تائید هویت پروتئین بیان شده با روش وسترن بلات………………………………………………….. 66

3-3- دیالیز نمونه های تخلیص شده…………………………………………………………………………………………… 71

3-4- تعیین غلظت پروتئین………………………………………………………………………………………………………… 71

3-5- سیستم های الایزا(اصول کار) …………………………………………………………………………………………… 71

3-5-1- طراحی سیستم های الایزا…………………………………………………………………………………………….. 72

3-5-1-1- نکات تکنیکی در الایزا……………………………………………………………………………………………… 72

3-5-1-2- برخی مشکلات در الایزا…………………………………………………………………………………………… 74

3-6- بررسی پتانسیل PUET-GRA7 و PUET-GRA6 در تشخیص عفونت حاد و مزمن …

توکسوپلاسموز با روش الایزا………………………………………………………………………………………………………….. 76

3-6-1-برقراری شرایط الایزا……………………………………………………………………………………………………….. 76

3-6-2- استفاده از لیزات باکتری در الایزا ………………………………………………………………………… 76

3-7- اندازه گیری میزان آنتی بادی به روش الایزای غیر مستقیم …………………………………… 77

3-8-تعیین Cut off در روش الایزا ………………………………………………………………………………………….. 80

3-9- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgG با کیت تجاری Euroimmun ………………………………… 81

3-10- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgM با کیت تجاری Euroimmun ……………………………… 82

3-11- برقراری شرایط بهینه به منظور محاسبه Avidity Index IgG ………………………………… 82

3-12- اندازه گیری IgG Avidity Index با استفاده از پروتئین های نوترکیب PUET-GRA7 و

PUET-GRA6 83

3-13- اندازه گیری IgG Avidity Index با استفاده از کیت تجاری EUROIMMUN ….. 83

3-14- اندازه گیری IgG Avidity Index با استفاده از کیت تجاری Microgen………………… 85

3-15- محاسبه اندکس اویدیته نسبی (RAI) Relative avidity Index ……………………………… 88

3-16- کنترل کیفی ……………………………………………………………………………………………………………………. 88

3-16-1- حساسیت ……………………………………………………………………………………………………………………. 88

3-17-طراحی تحقیق ……………………………………………………………………………………………………………. 88

3-18- تعداد نمونه و روش نمونه گیری ………………………………………………………………………………….. 89

3-18-1- تعداد نمونه …………………………………………………………………………………………………………………. 89

3-18-2- روش نمونه گیری………………………………………………………………………………………………………… 89

فصل چهارم: نتایج آزمایشات

4-1 :تهیه و تخلیص پروتئین های نو تركیب rGRA7 (pUET-GRA7 و rGRA6

(PUET-GRA6 92

4-2- تایید هویت پروتئین های تخلیص شده با روش وسترن بلات ……………………………………….. 93

4-3- بررسیIgG,IgM,IgG Avidity نمونه های سرمی با کیت استاندارد Euroimmun 94

4-3-1- نتیجه آزمایشات IgG ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرمهای

ایرانی با کیت Euroimmun…………………………………………………………………………………………………………… . 95

4-3-2- نتیجه آزمایشات IgM ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرمهای با کیت Euroimmun 95

4-3-3-نتیجه آزمایشات IgG Avidity ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرم ها

با کیت Euroimmun …………………………………………………………………………………………………………………… 96

4-4- برقراری شرایط ELISA Avidity با پروتئین های نوترکیب ………………………………………. 100

4-5- نتایج آزمایش Avidity ELISA با استفاده از پروتئین نوترکیب GRA6 برای تمایز

عفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار……………………………………………………………………………….. 103

4-6- نتایج آزمایش Avidity ELISA با استفاده از پروتئین نوترکیب GRA7 برای تمایز

عفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار ایران …………………………………………………………………….. 103

4-7- بررسی نتایج ناهمخوان بین الایزا اویدیته با پروتئین های GRA6 وGRA7 و کیت

Euroimmun با استفاده از کیت Microgen………………………………………………………………………………. 104

فصل پنجم:بحث، پیشنهادات

منابع 121

خلاصه انگلیسی ………………………………………………………………………………………… 127

ضمائم 129

فهرستجداول

عنوان صفحه

جدول3-1: جدول ارزیابی اویدیتی در کیت میکروژن……………………………………………………………….. 87

جدول 4-1: نتایج آزمایشات Avidity ELISA,IgG,IgM سرم ها با کیت Euroimmon……… 97

جدول 4-2: بررسی نتایج ناهم خوان با کیت های Microgen,Euroimmun و پروتئین های

GRA6 وGRA7 ……………………………………………………………………………………………………………………. 106

جدول شماره 4-3: نتایج آزمایش IgG وIgG Avidity با پروتئین های GRA6 و GRA7

بر روی سرم های زنان باردار ………………………………………………………………………………………………… ….. 108

فهرست شکل ها

عنوان صفحه

شکل1-1- شكل شماتیك یك تاكی زوایت و یك برادی زوایت توكسوپلاسما گوندی ………….. 4

شکل1-2- عكس میكروسكوپ الكترونی یك تاكی زوایت، سوش VEGكه در حال

نفوذ به یك نوتروفیل صفاق موش می باشد…………………………………………………………………………………. 7

شکل1-3- عکس میکروسکوپ الکترونی از تاکی زوایت سوش VEG در حال تقسیم

اندودیوژنی داخل ماکروفاژ صفاق موش………………………………………………………………………………………… 8

شکل1-4- یك كیست بافتی توكسوپلاسما كه حاوی بیش از هزار برادی زوایت می باشد……. 9

شکل 1-5- راه های انتقال انگل توکسوپلاسما گوندی در میزبان اصلی و حد واسط……………… 16

شکل 1-6- دختری با هیدروانسفالی بعلت توکسوپلاسموز مادرزادی……………………………………….. 25

شکل 1-7- شکل شماتیک انواع الایزا…………………………………………………………………………………………. 38

شکل3-1:نوارهای کیت میکروژن…………………………………………………………………………………………………. 87

شکل 4-1 : تخلیص پروتئین GRA6 به روش کروماتوگرافی تمایلی …………………………………….. 92

شکل 4-2: تخلیص پروتئین GRA7 به روش کروماتوگرافی تمایلی ……………………………………….. 93

شکل 4-3: بررسی هویت آنتی ژنیسته پروتئین های GRA6 وGRA7

تخلیص شده باروش وسترن بلات ……………………………………………………………………………………………….. 94

شکل 4-4 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما

در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA6 ………………………………………………………………………… 101

شکل 4-5 : تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمن

عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA6………………………………………. 101

شکل 4-6 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما

در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA7………………………………………………………………………….. 102

شکل 4-7 : تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمن

عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA7……………………………………….. 102

شکل4-8: مدلی از بلوغ آنتی بادی های IgG به آنتی ژن های توکسوپلاسمای………………………. 105

شکل 4-9: نتایج کیت میکروژن………………………………………………………………………………………………………………… 106

شکل4-10: مقایسه اجرای تست Avidity با کیت Euroimmun و پروتئین GRA6 برای افتراق

عفونت حاد و مزمن و تحت حاد………………………………………………………………………………………………….. 107

چکیده فارسی

توکسوپلاسموزیس که توسط انگل اجباری درون سلولی توکسوپلاسما گوندی، ایجاد می شود. در افرادی که از سیستم ایمنی سالمی برخوردارند، عفونت اولیه معمولاً بدون علائم ویا با عوارض خفیفی همراه است، ولی در نوزادانی که عفونت را به طور مادرزادی دریافت کرده اند، ممکن است منجر به عوارض خطرناکی مثل عقب ماندگی ذهنی، کوری و یا حتی مرگ شود. بنابراین تشخیص صحیح عفونت اخیر (recent) توكسوپلاسما و تمایز آن از عفونت مزمن در زنان باردار، اهمیت حیاتی در مراقبتهای درمانی مادر و جلوگیری از بروز عوارض عصبی- مغزی در جنین دارد. از آنجایی که پاسخ آنتی بادی های IgM در درصد قابل ملاحظه ای از افراد، ماه ها یا حتی سال ها پس از کسب عفونت، مثبت باقی می ماند، تمایز صحیح میان عفونت حاد و مزمن به ویژه در زنان باردار، اهمیت فوق العاده ای دارد. در حال حاضر، بنظر می رسد تركیب دو روش الایزای IgM و الایزای آویدیته IgG بهترین و مطمئن ترین نتایج را برای تشخیص عفونت حاد و تمایز آن از عفونت مزمن می دهند. شرایط بهینه روش IgG avidity ELISA برای تمایز سرم ها از عفونت حاد ومزمن با استفاده از دو پروتئین GRA7 وGRA6 برقرار (develop) شد. در نهایت ،كارایی روش avidity ELISA با استفاده از دو پروتئین فوق برای تشخیص عفونت حاد و مزمن در زنان باردار بررسی شد. در این تحقیق از کیت استاندارد Microgen جهت مقایسه نتایج ناهمخوان مابین کیت Euroimmun و پروتئین های نوترکیب GRA6 وGRA7 استفاده شد، نتایج بدست آمده از کیت Microgen دقیقا شبیه با پروتئین های نوترکیب بود. دراین تحقیق از 21 سرم حاد و 28 سرم مزمن و 29 سرم تحت حاد زنان مبتلا به توکسوپلاسما كه حاد و مزمن وتحت حاد بودن آن با استفاده از تست های استاندارد سرولوژیك برای ما مشخص شده بود استفاده شد . از21 سرم حاد در آویدیته الایزا با پروتئین GRA6 ، تنها 1 سرم آویدیته بالا داشت و از 28 سرم مزمن ، 2سرم آویدیته پایین داشت و از 29 سرم تحت حاد 5 سرم آویدیته پایین داشتند. در آزمایش با پروتئین GRA7 از 21 سرم حاد، 1 سرم آویدیته بالا داشتند و از 28سرم مزمن همه سرم ها آویدیته بالا داشتند و از 29 سرم تحت حاد ، 6 سرم آویدیته پایین داشتند.همچنین در این تحقیق تعدادی از سرم ها که نتایج ناهمخوانی ما بین کیت Euroimmun و پروتئین های نوترکیب GRA6 و GRA7داشتند را با استفاده از کیت استاندارد Microgen بررسی کردیم که نتایج این کیت استاندارد شبیه پروتئین های نوترکیب GRA6 و GRA7بخصوص پروتئین GRA6 بود که این یافته ها کارایی بهتر GRA6 را نشان می دهد. استفاده از آنتی ژنهای نوترکیب به جای آنتی ژنهای توتال انگل در کیت تشخیصی آویدیته الایزا ممکن است منجر به افزایش کارایی آنها شده و استانداردسازی کیتها را نیز تسهیل کند.

2-3-8-پروتئین سطحی انتروکوکی (ESP )……………………………………………………………………………………………………… 11

2-3-9-ادهسین کلاژن انتروکوکوس فکالیس (ACE )………………………………………………………………………………………. 12

2-4-بیماری زایی……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 12

2-4-1-باکتریمی……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 12

2-4-2-عفونت های مجاری ادراری…………………………………………………………………………………………………………………. 13

2-4-3-اندوکاردیت…………………………………………………………………………………………………………………………………………. 13

2-4-4-عفونت های داخل شکمی، لگنی وبافت های نرم………………………………………………………………………………….. 13

2-4-5-سایر عفونت های انتروکوکی……………………………………………………………………………………………………………….. 14

2-5-شناسایی انترکوک‏ها…………………………………………………………………………………………………………………………………… 14

2-6-درمان انترکوک‏ها………………………………………………………………………………………………………………………………………. 15

2-6-1-مقاومت آنتی بیوتیکی…………………………………………………………………………………………………………………………… 16

2-6-1-1-مقاومت به گلیکوپپتیدها………………………………………………………………………………………………………………….. 17

2-6-1-1-الف- عوامل زمینه ساز کلنیزاسیون انتروکوک های مقاوم به ونکومایسین(VRE)……………………………… 17

2-6-1-2-مقاومت به آنتی بیوتیک های بتالاکتام……………………………………………………………………………………………… 19

2-6-1-3-مقاومت به آنتی بیوتیک های تتراسایکلین……………………………………………………………………………………….. 20

2-6-1-4-مقاومت به لینکوزامیدها………………………………………………………………………………………………………………….. 20

2-6-1-5-مقاومت به استرپتوگرامین B وA……………………………………………………………………………………………………… 21

2-6-1-6-مقاومت به اگزازولیدون…………………………………………………………………………………………………………………… 21

2-6-1-7-مقاومت به اورنی مایسین………………………………………………………………………………………………………………… 22

2-6-1-8-مقاومت در برابر آنتی بیوتیک های ماکرولیدی…………………………………………………………………………………. 22

2-6-1-9-مقاومت به کلرامفنیکل…………………………………………………………………………………………………………………….. 23

2-6-1-10-مقاومت به آمینوگلیکوزیدها…………………………………………………………………………………………………………. 24

2-6-1-10-الف- تاریخچه روند گسترش مقاومت های آمینوگلیکوزیدی……………………………………………………….. 25

2-6-1-10-ب- انواع مقاومت به آمینوگلیکوزیدها…………………………………………………………………………………………. 25

2-6-1-10-پ- اهمیت مقاومت آمینوگلیکوزیدی………………………………………………………………………………………….. 27

2-6-1-10-ت-HLAR و و افزایش مرگ ومیر……………………………………………………………………………………………….. 28

2-6-2-مقاومت چنددارویی( MDR)……………………………………………………………………………………………………………….. 28

2-7- روش های شناسایی سویه های مقاوم به آنتی بیوتیک……………………………………………………………………………….. 29

2-7-1- روش های مبتنی بر فنوتیپ………………………………………………………………………………………………………………… 29

2-7-1-1- روش انتشار دیسک در آگار( دیسک دیفیوژن)……………………………………………………………………………….. 29

2-7-1-2- روش تهیه رقت در محیط مایع( براث دیلوشن )…………………………………………………………………………….. 30

2-7-1-3 – روش تهیه رقت در محیط آگار( آگار دیلوشن )…………………………………………………………………………….. 30

2-7-2- روش های مبتنی بر ژنوتیپ………………………………………………………………………………………………………………… 31

2-7-2-1-Triplex-PCR……………………………………………………………………………………………………………………………….. 31

2-7-2-1-الف-طراحی واجرایTriplex-PCR……………………………………………………………………………………………….. 32

2-7-2-1-ب-تیتراسیون اجزای واکنش………………………………………………………………………………………………………….. 33

2-7-2-1-3 -شرایط ترموسایکلر……………………………………………………………………………………………………………………. 33

2-8-اپیدمیولوژی عفونت های انتروکوکی…………………………………………………………………………………………………………. 33

2-9-مروری بر پیشینه پژوهش………………………………………………………………………………………………………………………….. 35

فصل سوم–مواد و روش‏ها

3-1-وسایل موردنیاز…………………………………………………………………………………………………………………………………………. 40

3-2-مواد موردنیاز……………………………………………………………………………………………………………………………………………. 41

3-3-طریقه ساخت محیط های کشت………………………………………………………………………………………………………………… 43

3-3-1-محیط بلادآگار…………………………………………………………………………………………………………………………………….. 43

3-3-2-محیط BHI براث…………………………………………………………………………………………………………………………………. 43

3-3-3-محیط مولر هینتون آگار……………………………………………………………………………………………………………………….. 44

3-3-4-محیط پایه قند……………………………………………………………………………………………………………………………………… 44

3-4-جمع آوری نمونه……………………………………………………………………………………………………………………………………… 45

3-5-جدا سازی سویه ها…………………………………………………………………………………………………………………………………… 45

3-6-نگهداری سویه ها……………………………………………………………………………………………………………………………………… 46

3-7-آنتی بیوگرام……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 46

3-7-1-تهیه سوسپانسیون باکتریایی………………………………………………………………………………………………………………….. 46

3-7-2-روش آنتی بیوگرام……………………………………………………………………………………………………………………………….. 47

3-8-بررسی مقاومت افزایش یافته به جنتامایسین و استرپتومایسین……………………………………………………………………. 48

3-9-اجرای PCR……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 48

3-9-1-آماده سازی واستخراج ژنوم………………………………………………………………………………………………………………….. 48

3-9-1-1-جوشاندن………………………………………………………………………………………………………………………………………… 49

3-10-اندازه گیری غلظت DNA ژنومیک تخلیص شده……………………………………………………………………………………. 49

3-11-الکتروفورز محصول استخراج ژنوم…………………………………………………………………………………………………………. 50

3-12-انتخاب و سنتز پرایمر…………………………………………………………………………………………………………………………….. 50

3-13-روش آماده سازی پرایمرها……………………………………………………………………………………………………………………… 51

3-13-1-محلول کاری پرایمر PCR…………………………………………………………………………………………………………………. 51

3-13-2- ترکیب واکنش PCR برای هر نمونه…………………………………………………………………………………………………. 52

3-14-انجام واکنش PCR…………………………………………………………………………………………………………………………………. 52

3-15-طریقه ساخت بافر…………………………………………………………………………………………………………………………………… 54

3-15-1-تهیه بافر(SX )TBE…………………………………………………………………………………………………………………………… 54

3-15-2-تهیه ژل Buffer Loading Gel……………………………………………………………………………………………………. 54

3-16-تهیه ژل الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………………………… 55

3-16-1-تهیه ی ژل آگاروز جهت انجام الکتروفورز ژنوم اسنخراج شده و محصول PCR…………………………………. 55

3-17-تعیین توالی……………………………………………………………………………………………………………………………………………. 55

فصل چهارم–نتایج و بحث

4-1-نتایج مربوط به جداسازی گونه های انتروکوکی از نمونه های بالینی………………………………………………………….. 56

4-2-نتایج حاصل از کشت انتروکوک ها بر روی محیط و رنگ آمیزی گرم……………………………………………………….. 57

4-3-نتایج حاصل از حساسیت آنتی بیوتیکی به روش دیسک دیفیوژن………………………………………………………………. 61

4-4-نتایج حاصل از استخراج…………………………………………………………………………………………………………………………… 61

4-5-نتایج PCR……………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 62

4-6-بحث………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 66

فصل پنجم–نتیجه‏گیری

5-1- نتیجه‏گیری………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 71

5-2-پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 72

منابع فارسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 73

منابع غیرفارسی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 73

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 84

فهرست جدول‏ها

عنوان صفحه

جدول(3-1) اجزای تشکیل دهنده محیط بلاد آگار…………………………………………………………………………………………….. 43

جدول(3-2) اجزای تشکیل دهنده ی محیط BHI براث……………………………………………………………………………………… 43

جدول(3-3) اجزای تشکیل دهنده محیط مولر هینتون آگار………………………………………………………………………………… 44

جدول(3-4) اجزای تشکیل دهنده محیط پایه قند………………………………………………………………………………………………. 44

جدول(3-5) مشخصات دیسک های آنتی بیوتیکی استفاده شده………………………………………………………………………….. 48

جدول(3-6) پرایمرهای استفاده شده برای پیدا کردن به سویه های انتروکوکی مقاوم به آمینوگلیکوزیدی…………….. 50

جدول( 3-7)محلول کاری جهت پرایمر aac(6ʹ)-Ie-aph(2ʹʹ)-Ia………………………………………………………………….. 51

جدول( 3-8 )محلول کاری جهت پرایمر aph(3ʹ)-IIIa……………………………………………………………………………………. 51

جدول (3-9 )محلول کاری جهت پرایمر ant(4)-Іa………………………………………………………………………………………… 51

جدول( 3-10) محلول کاری جهت PCR…………………………………………………………………………………………………………… 52

جدول(3-11) برنامه PCR بهینه سازی شده برای جفت پرایمر aac(6ʹ)-Ie-aph(2ʹʹ)-Ia……………………………….. 53

جدول(3-12)برنامه PCR بهینه سازی شده برای جفت پرایمر aph(3ʹ)-IIIa……………………………………………………. 53

جدول(3-13) برنامه PCR بهینه سازی شده برای جفت پرایمر ant(4)-Іa……………………………………………………….. 54

جدول( 3-14) اجزای تشکیل دهنده بافر TBE………………………………………………………………………………………………….. 54

جدول(3-15) اجزای تشکیل دهنده ژل لودینگ بافر………………………………………………………………………………………….. 53

جدول( 4-1) درصد فروانی انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم در نمونه های بالینی…………………………… 60

جدول(4-2) درصدفراوانی سویه های انتروکوک حاوی یک ژن در نمونه های بالینی…………………………………………. 64

جدول(4-3) درصدفراوانی سویه های انتروکوک حاوی بیش از یک ژن در نمونه های بالینی………………………………. 66

فهرست نمودارها

عنوان صفحه

نمودار(4-1) درصد فراوانی انتروکوک های جداسازی شده از نمونه های بالینی………………………………………………….. 57

نمودار(4-2) نتایج حاصل از روش دیسک دیفیوژن برای تمام ایزوله های انتروکوکی…………………………………………. 61

فهرست شکل‏ها

عنوان صفحه

شکل( 4-1) کشت در محیط5/6 درصد BHI Broth Nacl……………………………………………………………………………… 57

شکل(4-2) کشت روی محیط بلاد آگار ……………………………………………………………………………………………………………. 58

……………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 27

(3-10-1 پروتئین 3AB ……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 27.

(4-10-1 پروتئین فرعی سلول ……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 28.

(5-10-1 پروتئین متصل کننده پرایمر برای سنتز RNA …………………………………………………………………………………………….. 28.

(11-1 محل سنتز RNA در سلول ………………………………………………………………………………………………………………………………….. 29

(12-1 چگونگی تشخیص RNA ویروسی و سلولی از یکدیگر ……………………………………………………………………………………….. 31

(13-1 مرحله تجمع و تشکیل ذرات عفونی …………………………………………………………………………………………………………………….. 32

(14-1 پاراکوویروس …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..33

(1-14-1 جداسازی و خصوصیات اولیه پاراکوویروس ………………………………………………………………………………………………………. 33

(2-14-1 پروتئین های پاراکوویروس ……………………………………………………………………………………………………………………………….. 34

(3-14-1 پردازش پروتئین در پاراکوویروس ها ………………………………………………………………………………………………………………… 35

(4-14-1 توالی 5´-UTR در پاراکوویروس ها ………………………………………………………………………………………………………………….. 36

(5-14-1 ارتباط ژنتیکی پاراکوویروس ها با پیکورنا ویروس های دیگر …………………………………………………………………………… 38

(6-14-1 تداخلات بین HPeV1-2 با سطح سلولهای حساس ………………………………………………………………………………………39

(7-14-1 عوارض کلینیکی و اپیدومیولوژی پاراکوویروس ها ……………………………………………………………………………………………. 41

(8-14-1 ویروس های مرتبط با پاراکوویروس ها در حیوانات …………………………………………………………………………………………. 41

جداول:

جدول 1) اعضای خانواده پیکورنا ویریده ………………………………………………………………………………………………………………………….. 4

جدول 2) گیرنده ها و کمک گیرنده های مورد استفاده در پیکورنا ویروس …………………………………………………………………… 19

جدول 3) میزان تشابه توالی اسیدهای آمینه بینHPEV-1 وHPEV-2 …………………………………………………………..43…….

جدول 4) تهیه محیط کشت………………………………………………………………………………………………………………………………………………..55

جدول 5) تهیه محلول های مورد نیاز برای استخراج پلاسمید…………………………………………………………………………………………….57

جدول 6) توالی و موقعیت پرایمرهای طراحی شده برای ناحیه5´ UTR ……………………………………………………………………….. 59

جدول 7) نتیجه مقایسه سکانس توالی های 5UTR با بانک ژنی به روش blast…………………………………………………………………. 65

جدول 8 )نتایج blast محصول PCR ………………………………………………………………………………………. …………………………………………….73

جدول 9- فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت بر اساس PCR……………….76

جدول10 – فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت برحسب جنس….…………76

جدول11- فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت برحسب سن..…….…………76

جدول 12- فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت برحسب فصل…..………….76

نمودار:

نمودار1- فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت بر اساس PCR………..…….77

نمودار-2 فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت برحسب جنس………………77

نمودار-3 فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت برحسب سن……..………..78.

نمودار4 – فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت برحسب فصل……..………78

اشکال:

شکل 1) نمای شماتیک کپسید ویروس ها ………………………………………………………………………………………………………………………. 9…..

شکل 2) دیاگرام شماتیک 8 زنجیره β ………………………………………………….. ……………………………………………………. 11

شکل 3) مدلی از پولیوویروس تیپ 1 .………………………………………………………………………. ………………………… 11

شکل 4) تداخلات میریستات با پروتئین های سطح ویروس …………………………………………………………………………………………….. 13

شکل 5) تصویر شماتیک ژنوم پیکورنا ویروس ها ……………………………………………………………………………………………………………….. 13

شکل 6) دو تیپ اصلی از IRES در پیکورنا ویروس ها ……………………………………………………………………………………………………… 15

شکل 7) چرخه تکثیر پیکورناویروس …………………………………………………………………………………………………………………………………… 17

شکل 8) تصویر شماتیکی از Canyon …………………………………………………………………… …… …………………….20

شکل 9) شکاف Canyon و نحوه قرار گرفتن دارو در VP₁……………………………………………………………………………………………… 20

شکل 10) مدل دخول پیکورنا ویروسها به درون سلول ………………………………………………………………………………………………………. 22

شکل 11) مکانیسم فرضی برای عبور RNA پیکورنا ویروس ها از عرض غشا ……………………………………………………………….. 22

شکل 12) تصویر سه بعدی از 3C^proویروس هپاتیت A ، 2A^proرینو ویروس و FMDV L^pro…………………………… 25…..

شکل 13) نحوه اتصال vpg به ابتدای ژنوم پیکورنا ویروسها، محل کلیواژ vpg………………………………………………………….. 29……

شکل 14) سنتز RNA و ترجمه پروتئین …………………………………………………………………… ………………………………………………….. 30

شکل 15) مدل سنتز ssRNA پولوویروس ……………………………………………………………………………………………………………………… 31

شکل 16) مراحل ساخته شدن واحدهای ساختمانی و عملکرد 3CD^proدر این مرحله ……………………………………………….. 32

شکل 17) مراحل مرفوژنز پیکورنا ویرس ها ……………………………………………………………………………………………………………………… 33

شکل 18) کلیواژ اولیه پروتئین پیکورنا ویروس ها …………………………………………………………………………………………………………… 36

شکل 19) دیاگرام شماتیک ساختار ثانویه ………………………………………………………………………………………………………………………… 37

شکل 20) دندروگرافی براساس پروتئین VP₃در پیکورنا ویروس ها ……………………………………………………………………………… 38

شکل 21) مقایسه توالی اسید آمینه ای در انتهای کربوسیلی از VP₁در بین پاراکوویروس ها و CAV ………………………. 39.

شکل 22) نتایج Plaque assay پاراکوویروس انسانی تیپ 1 ……………………………………………………………………………………….. 40

شکل 23) ارتباط فیلوژنیک بین پاراکوویروس ها و ایزوله های تازه جداشده از ویروس L jungan درحیوانات……………..42

فصل اول

کلیات………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….44

• بیان مساله…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..45

(2-1 فرضیه……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………46 (3-1اهداف تحقیق…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 47

1-4)ضرورت انجام تحقیق………………………………………………………………………………………………………………………………………………………47

فصل دوم

مروری بر متون گذشته………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….48

فصل سوم

مواد و روش ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….51

(1-3آماده سازی میكروتیوب و سرسمپلرها…………………………………………………………………………………………………………………………52

(2-3 مواد لازم برای تهیه سوسپانسیون ……………………………………………………………………………………………………………………………..52

(3-3 جداسازی RNA و ساخت cDNA…………………………………………………………………………………………………………………………….53

(4-3سنتز cDNA…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………54

3-5) Compatent……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….55

3-6) ترا نسفورم………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………56

Mini prep protocol ( 7-3 (استخراج پلاسمید)……………………………………………………………………………………………………………58

PCR (8-3……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..58

(9-3 روش تهیه ژل آگارز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………60

(10-3 روش آماده سازی مارکر 1kb……………………………………………………………………………………………………………………………………60

11-3)تکنیک الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..61

(12-3تهیه بافر الكتروفورز 1x………………………………………………………………………………………………………………………………………………61

(13-3روش استخراج DNA از ژل …………………………………………………………………………………………………………………………………….61

فصل چهارم

نتایج…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….63

مقایسه blast برخی توالی های مثبت با توالی موجود در بانک ژنی…………………………………………………………………………………..66

فصل پنجم

بحث و نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..79

بحث………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….80

نتیجه گیری………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………84

توصیه ها و پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………………………………………..85