13

2-5 انواع مراکز خدمات درمانی…………………………………………………………………………………………………………. 13

2-5-1 اراضی خدمات درمانی……………………………………………………………………………………………………………. 13

2-5-2 سرانه کاربری درمانی……………………………………………………………………………………………………………… 14

2-6 بیمارستان………………………………………………………………………………………………………………. 15

2-6-1 مکان یابی بیمارستان………………………………………………………………………………………………………………. 15

2-6-2 ویژگی های موثر در انتخاب مکان بیمارستان……………………………………………………………………….. 15

2-7 معیارهای مکان یابی بیمارستان………………………………………………………………………………………………….. 17

2-7-1 نزدیکی به مراکز مسکونی………………………………………………………………………………………………………. 17

2-7-2 فاصله از مراکز صنعتی…………………………………………………………………………………………………………… 18

2-7-3 فضاهای سبز……………………………………………………………………………………………………………….. 18

2-8 روش های تعیین اولویت گزینه ها…………………………………………………………………………………………….. 18

2-8-1 روش ترکیب خطی وزنی (WLC)………………………………………………………………………………………… 18

2-8-2 فرآیند تحلیل سلسله مراتبی (AHP)…………………………………………………………………………………… 19

2-8-2-1 چارچوب مفهومی فرآیند تحلیل سلسله مراتبی……………………………………………………………… 19

2-8-2-2 ساختن سلسله مراتبی………………………………………………………………………………………………………. 19

2-9 روش AHP………………………………………………………………………………………………………………………………….. 20

فصل سوم: روش تحقیق

3-1 مقدمه……………………………………………………………………………………………………………………. 23

3-2 موقعیت جغرافیایی اردبیل…………………………………………………………………………………………………………. 23

3-3 ویژگی های جغرافیایی………………………………………………………………………………………………………………… 24

3-4 تاریخچه شهر اردبیل…………………………………………………………………………………………………………………… 25

3-5 ساختار جمعیتی و اجتماعی اردبیل………………………………………………………………………………………….. 26

3-5-1 جمعیت شهری اردبیل…………………………………………………………………………………………………………… 26

3-5-2 تعداد خانوار در شهر اردبیل…………………………………………………………………………………………………… 26

3-5-3 بعد خانوار در شهر اردبیل……………………………………………………………………………………………………… 27

3-6 کاربری زمین شهری……………………………………………………………………………………………………………………. 27

3-6-1 وضعیت نظام کاربری اراضی اردبیل………………………………………………………………………………………. 29

3-6-1-1 دسترسی به خدمات درمانی……………………………………………………………………………………………… 30

3-6-1-2 کاربری تجاری…………………………………………………………………………………………………………………….. 31

3-6-1-3 کاربری آموزشی………………………………………………………………………………………………………………….. 31

3-6-1-4 کاربری ورزشی……………………………………………………………………………………………………………………. 32

3-7 وضعیت کالبدی زیر ساخت ها و خدمات موجود……………………………………………………………………… 32

3-7-1 برخورداری از شبکه آب و فاضلاب……………………………………………………………………………………….. 32

3-7-2 برخورداری از شبکه تلفن و مخابرات……………………………………………………………………………………. 33

3-7-3 برخورداری از شبکه برق………………………………………………………………………………………………………… 33

فصل چهارم:تجزیه و تحلیل و بیان نتایج حاصله از تحقیق

4-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………………………… 35

4-2 تعریف معیارها و تهیه لایه های مورد نظر…………………………………………………………………………………. 35

4-3 طبقه بندی مجدد داده ها…………………………………………………………………………………………………………… 36

4-3-1 نزدیکی به مراکز مسکونی………………………………………………………………………………………………………. 37

4-3-2 دسترسی به شبکه های ارتباطی اصلی……………………………………………………………………………….. 38

4-3-3 نزدیکی به فضای سبز شهری………………………………………………………………………………………………… 41

4-3-4 فاصله از کارگاه های صنعتی…………………………………………………………………………………………………. 43

4-3-5 فاصله از مراکز بیمارستانی موجود………………………………………………………………………………………… 44

4-3-6 فاصله از رودخانه…………………………………………………………………………………………………………………….. 46

4-3-7 نقشه کاربری اراضی شهری……………………………………………………………………………………………………. 48

4-4 روش AHP………………………………………………………………………………………………………………………………….. 52

4-5 همپوشانی (Overlay) کردن لایه های اطلاعاتی با استفاده از GIS……………………………………….. 55

فصل پنجم:بحث و تفسیر و نتیجه گیر و جمع بندی

5-1 نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………………………………………. 58

5-2 پاسخ به سوالات تحقیق……………………………………………………………………………………………………………… 59

5-3 پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………………………………. 60

منابع و مآخذ 63

چکیده

موضوع دسترسی به خدمات شهری از جمله مسائل مهمی است كه ابعاد گوناگون امور شهری را تحت تأثیر قرار می دهد. خدمات بهداشتی- درمانی نمونه ای از این دسته است كه الزام در دسترسی مناسب به آن ها برای تمامی افراد ضروری می باشد. تصمیم گیری برای مكانیابی مراكز خدمات بهداشتی – درمانی از جمله بیمارستان نه تنها از نظر نحوه ارائه خدمات و تحمیل هزینه ها به استفاده كنندگان حائز اهمیت است بلكه خود در توسعه شهر و تعیین الگوی توزیع مكانی تقاضا برای سكونت تأثیر قابل ملاحظه ای دارد. در این مطالعه، هدف عمده سنجش میزان كمبود بیمارستان ها در سطح شهر اردبیل، چگونگی توزیع جغرافیایی و مكانیابی بهینه این مراكز با توجه به استانداردها و ضوابط علمی بوده است. سپس با بهره گیری از امكانات سامانه اطلاعات جغرافیایی و تجزیه و تحلیل داده­ها و در نهایت با بهره گیری از شاخص همپوشانی برای مكانیابی بهینه فضاهای شهری به منظور احداث بیمارستان در این شهر اقدام شد. در این پژوهش داده های مكانی از روی نقشه های رقومی تهیه و داده های توصیفی نیز با استفاده از آمار و پژوهش های کتابخانه ای جمع آوری گردید. سپس برای هر یك از عوامل تأثیرگذار در مكانیابی بیمارستان، لایه های مرتبطه (مراکز مسکونی، فضای سبز، شبکه ارتباطی، کاربری اراضی، فاصله از مراکز صنعتی، فاصله از مراکز بیمارستانی موجود، فاصله از رودخانه) تهیه شد و در هر لایه حریم كاربری ها مشخص گردید؛ سپس با توجه به میزان تأثیر هر یك از معیارها و مقایسات زوجی به روش AHP و به کمک نرم افزار Expert choice وزن لایه ها محاسبه شد، نهایتاً با بهره گیری از نتایج حاصل از تلفیق لایه های اطلاعاتی، زمین های شهر اردبیل برای انتخاب مكان مناسب احداث بیمارستان در 4 دسته از عالی تا ضعیف تقسیم بندی گردید. نتایج حاصله نشان می دهند كه توزیع فعلی بیمارستان در منطقه مورد مطالعه متناسب با توزیع جمعیت نیست وبیشتر بیمارستان ها در قسمتهای مركزی شهر متمركز هستند. ضمناً مكان های تعیین شده برای بیمارستان، از نظرزمان دسترسی برای شهروندان مناسب می باشد.

کلمات کلیدی: بیمارستان، مکان یابی، اردبیل،AHP، GIS

مقدمه

در دهه اخیر به ویژه با توجه به هزینه های بالای خدمات پزشکی ناشی از توسعه و تکامل تکنولوژی پزشکی و نیز مشکلاتی که از نظر تامین مالی این هزینه ها برای اغلب دولت ها فراهم بوده است، سیاست گذاران و دولتمردان پذیرفته اند که بهداشت و درمان یک مسئله اجتماعی صرف نبوده و باید جنبه های اقتصادی نیز مورد توجه و بررسی قرار گیرد. لازم به ذکر است که در کشور ایران بیش از 5 درصدتولید ناخالص داخلیو 5 تا 10 درصد هزینه های دولت به این بخش اختصاص یافته است(فرح آبادی و همکاران،1389). بنابراین این پایان نامه برآن است که به مسئله جا نمایی مکان های بهینه جهت استقرار مراکز درمانی در شهر اردبیل پرداخته تا در صورت مهیا بودن شرایط مالی برای مسئولان در مکان های مناسب مراکز بیمارستانی احداث گردد تا شهروندان دسترسی راحت تری به مراکز درمانی بویژه بیمارستانی داشته باشند.

1. اما بررسی ها نشان می دهد که بیش از نیمی از منابع ملی بهداشتی در کشورهای مختلف به هدر می روند و در کشورهای توسعه نیافته، منابع محدود به صورت ناکارآمد مصرف می شوند و اعتبارات عمومی صرف خدماتی می شود که تناسب و اثر بخشی لازم را ندارند لذا ارزیابی عملکرد واحد های ارائه دهنده خدمات سلامتی، امروزه به موضوع بسیار مهمی تبدیل شده و استفاده از نتایج ارزیابی ها، به عنوان یک ابراز مدیریتی غیر قابل چشم پوشی، برای تمام مدیران در سطوح مختلف سیستم سلامت عمومیت یافته است(فرح آبادی و همکاران،1389).

1. شهرنشینی روندی مثبت است و شهرها موتور توسعه اقتصادی، اجتماعی و فرهنگی هستند. لیکن در شهرهای کنونی کیفیت زندگی شهری از نظر آسایش، ایمنی و زیبایی با افت شدید رو به رو گردیده است. متاسفانه برنامه ریزی شهری معاصر نه تنها نتوانسته است بر این مشکلات فائق آید بلکه گاهی خود به تشدید آن ها کمک کرده است(کریمی،1385).

• بیان مسئله

• دسترسی به خدمات درمانی را می توان از دو بعد فقدان کاربری و عدم قرارگیری مناسب آن مورد بررسی قرار داد، فقدان یک فعالیت نیاز به احداث یک کاربری در یک منطقه است اما عدم قرارگیری مناسب مقوله ای است که یک فعالیت مکان یابی مناسبی نداشته و منجر به اتلاف وقت، انرژی، هزینه رفت و آمد، کاهش دسترسی، اجبار به استفاده بیشتر از اتومبیل و… می گردد (خاکپور و همکاران، 1390). شهر اردبیل به عنوان مرکز استان اردبیل و به واسطه عواملی از قبیل مهاجرت روستا-شهری رشد فزاینده طبیعی جمعیت و نظایر اینها، با افزایش بیش از حد جمعیت و در نتیجه رشد فیزیکی بی برنامه در برخی از مناطق شهری مواجه بوده است. در حالی که از نظر توزیع فضایی بهینه ومکان گزینیعادلانه برای کاربری های خدمات عمومی مخصوصا خدمات بهداشتی و درمانی که دسترسی سریع و به موقع و راحت به آن ها دارای اهمیت است، فضای متناسبی در نظر گرفته نشده است. معمولا استقرار بسیاری از عناصر شهری و عمدتا انتفاعی بیشتر تابع ساز و کار های اقتصادی رقابت آزاد است، اما عناصر شهری عمومی غیر انتفاعی را نمی توان یکسره به ساز و کارهای اقتصادی بازار واگذار کرد، بلکه لازم است برای جبران ناکارآمدی های باراز به تصمیم ها و سیاست های مبتنی بر منافع تمسک جست که وظیفه اصلی برنامه ریزان و واحدهای خدمات عمومی بهداشتی و درمانی از آن جمله اند(یکانی فرد،1380). بنابراین، می توان گفت که برنامه ریزان می کوشند توزیع مراکز خدماتی را در محیط های شهری بهینه سازند و این توزیع متناسب با توزیع جمعیت و با میزان تقاضا در نقاط مختلف شهر باشد.

1. سیستم اطلاعات جغرافیایی تکنیکی کمی در تصمیم گیری، تعیین روندها و مکان یابی است که در مطالعات مربوط به مکان و سطوح مختلف برنامه ریزی به کار گرفته می شوند، روی آوردن به سیستم اطلاعات جغرافیایی امروزه از جمله کا رآترین شیوه ها برای ارتقای سیاست گذاری و نیز بهبود برنامه ریزی و اجرای طرح های شهری به شمار می رود. بنابراین برخوداری از یک شبکه اطلاعات جغرافیایی پیشرفته و کامل، بهترین زمینه را برای برنامه ریزی های گوناگون فراهم می آورد و موجب افزایش بهره وری در اجرای طرح ها، حتی در بخش های مختلف خدمات شهری می شود (احمدی و همکاران، 1390).

1. از آن جایی که ایجاد مراکز خدماتی جدید مستلزم صرف هزینه های زیادی می باشد، بنابراین تعیین بهترین مکان این مراکز به نحوی که تعداد بیشتری از شهروندان از خدمات آن بهره مند شوند، بسیار مهم است. عدم انتخاب محل بهینه برای ایجاد یک بیمارستان مشکلاتی را ایجاد خواهد کرد که از سال های گذشته در شهرهای بزرگ کسب شده است و حاکی از آن است که مکان یک بیمارستان نزدیک فضای سبز و پارک ها و دور از مناطق تجاری و شلوغ انتخاب گردد، راههای دسترسی به آن مناسب باشد یا به عبارت دیگر در نزدیکی را ه های اصلی شهر قرار داشته باشد، به مراکز با تراکم جمعیتی بالا نزدیک باشد تا تعداد بیشتری از شهروندان از خدمات آن بهره مند شوند و در نهایت در فاصله مناسبی از مراکز بیمارستانی موجود باشد تا توزیع خدمات درمانی در دورن شهر مناسب باشد (فرح آبادی و همکاران، 1390).

• اهداف تحقیق

1. ارایه گزارشی از وضعیت و مشکلات وضع موجود شهر اردبیل در خصوص تعداد و نحوه توزیع مکان های مراکز بیمارستانی.

1. ارایه الگوی علمی و مناسب در جهت مکان گزینی صحیح بیمارستان با استفاده از GIS.

• اهمیت تحقیق

1. تخصیص بهینه و صحیح مکان یابی بیمارستان می تواند بسیاری از مسایل و مشکلات شهری را حل کند. به طوری که هر چقدر شهر بزرگتر باشد وضعیت تخصیص مکان یابی و توزیع آن پیچیده تر می گردد. با توجه به اینکه مطالعه موردی تحقیق حاضر، شهر اردبیل می باشد و توسعه شهر نیز روندی تصاعدی دارد بنابراین دقت در مکان یابی بیمارستان بسیار با اهمیت و ضروری است. از این رو توجه به فضاهای مورد نیازی که ضامن سلامت جسم و روح شهروندان است، در برنامه ریزی و ساختار شهر ضروری به نظر می رسد. در این زمینه نحوه توزیع، سازگاری و مطلوبیت، کمبودها و نارسایی هایی مورد بررسی و ارزیابی قرار می گیرد.

• سوالات تحقیق

1-5-2- استفاده های بالقوه بیواندیکاتورها 16

1-5-3- ویژگی های بیواندیکاتورها 16

1-6- آبسنگ های مرجانی.. 21

1-6-1- ضرورت مطالعه آبسنگ های مرجانی.. 22

1-6-2- جایگاه آبسنگ های مرجانی در رده بندی تکاملی موجودات… 23

1-6-2-2- رده …….…………………..Anthozoa23

1-6-2-3-.Faviidae……….24

1-6-2-3- خانواده Poritidae….24

24

‏ 1-6-4- فاکتورهای محدودکننده توزیع آبسنگ های مرجانی.. 25

‏1-6-5- انواع آبسنگ های مرجانی.. 26

‏1-6-6- فرآیند رشد در آبسنگ های مرجانی.. 26

1-6-7- روش های مختلف ته نشینی کربنات کلسیم در مرجان های سخت در طول رشد. 27

1-6-8- ساختمان مرجان های سخت… 28

1-6-8-1- ساختارداخلی.. 28

1-6-8-2- اسکلت مرجان های سخت… 30

1-6-9- بیماری در مرجان های سخت… 31

1-6-10- پدیده سفید شدگی در مرجان های سخت… 32

1-6-11- آبسنگ های مرجانی ایران.. 32

1-6-12- تهدیدات مختلف در مقابل آبسنگ های مرجانی.. 34

‏1-6-12-3- عوامل طبیعی.. 37

1-7- اهمیت تحقیق.. 37

1-8- اهداف… 40

1-9- فرضیه های آماری.. 40

1-10- پیشینه تحقیق.. 41

1-10-1- کاربرد مرجان های سخت Scleractinian جهت بررسی فلزات سنگین.. 41

فصل دوم(مواد و روش ها)

2-1- عملیات میدانی.. 53

2-1-1- انتخاب مکان نمونه برداری.. 53

2-1-2- نمونه برداری.. 54

2-2- عملیات آزمایشگاهی.. 56

2-2-1- دستگاه های مورد نیاز 56

2-2-2- مواد مورد نیاز 57

2-2-3- شناسایی مرجان های سخت… 58

2-2-4- آماده سازی نمونه ها 58

2-2-4-1- شستن لوازم آزمایشگاهی.. 60

2-2-5- هضم نمونه ها 61

2-2-5-1- هضم نمونه های مرجان.. 61

2-2-5-2- هضم نمونه های رسوب… 65

2-2-6- روش های اندازه گیری فلزات سنگین.. 65

2-2-6-1- انتخاب روش…. 66

2-2-6-2- محدودیت ها و مشکلات کار با دستگاه طیف سنجی جذب اتمی.. 67

2-2-6-3- کنترل کیفی.. 68

2-2-7- سنجش مقادیر فلزات در نمونه ها 69

2-3- تجزیه و تحلیل های آماری.. 72

فصل سوم (نتایج)

3-1- نتایج.. 75

3-2- نرمال بودن داده ها 75

3-3- نتایج مربوط به سطوح فلزات در بافت اسکلتی مرجان های خانواده های Faviidae و Poritidae و رسوبات پیرامونی آنها 75

3-3-1- غلظت عنصر نیکل دربافت اسکلتی مرجان های خانواده های Faviidae و Poritidae و رسوبات پیرامونی آنها بین ایستگاه های پارک زیتون، جزایر ناز و منطقه شیب دراز جنوب جزیره قشم.. 77

3-3-2- غلظت عنصر کادمیوم دربافت اسکلتی مرجان های خانواده های Faviidae و Poritidae و رسوبات پیرامونی آنها بین ایستگاه های پارک زیتون، جزایر ناز و منطقه شیب دراز جنوب جزیره قشم.. 77

3-3-3- غلظت عناصر نیکل و کادمیوم دربافت اسکلتی مرجان های خانواده Faviidae و Poritidae در هریک از ایستگاه های پارک زیتون، جزایر ناز و منطقه شیب دراز جنوب جزیره قشم.. 79

3-4- نتایج مربوط به سطوح فلزات به صورت نمودار 79

3-5- مقایسه ایستگاه ها ازلحاظ غلظت فلزات نیکل و کادمیوم بدون درنظرگرفتن نوع و خانواده نمونه ها 84

3-6- نتایج مربوط به ارتباط سطوح فلزات نیکل و کادمیوم دربافت اسکلتی مرجان های خانواده Faviidae و Poritidae و رسوبات پیرامونی آنها در هر ایستگاه و همبستگی های معنی دار 84

3-7- مقایسه ایستگاه ها از لحاظ غلظت فلزات نیکل و کادمیوم به عنوان متغیر همزمان.. 84

فصل چهارم(بحث و نتیجه گیری کلی)

4-1- غلظت عناصر نیکل و کادمیوم دربافت اسکلتی مرجان های خانواده های Faviidae و Poritidae و رسوبات پیرامونی آنها بین ایستگاه های پارک زیتون، جزایر ناز و منطقه شیب دراز جنوب جزیره قشم.. 87

4-2- ارتباط سطوح فلزات نیکل و کادمیوم دربافت اسکلتی مرجان های خانواده Faviidae و Poritidae و رسوبات پیرامونی آنها در هر ایستگاه و همبستگی های معنی دار 88

4-3- عناصر نیکل و کادمیوم در مرجان های خلیج فارس…. 97

4-3-1- عناصر نادر در اسکلت کربنات کلسیمی مرجان ها 97

4-3-2- ورود عناصر نادر به کانیهای کربناته اسکلتی.. 97

4-4- تاثیر آلودگی های نفتی بر روی مرجان های خلیج فارس…. 101

4-5- آلودگیهای نفتی در خلیج فارس…. 104

4-5-1-آلودگی های نفتی حاصل از نشت نفت به محیط حین بهره برداری.. 105

4-5-2- آلودگیهای نفتی حاصل از سوانح ناشی از جنگ و آسیب دیدن نفتکش ها 106

4-5-3- مسیر حرکت لکه های نفتی ایجاد شده در حادثه های نوروز و جنگ خلیج فارس و آلودگی سواحل 107

4-6- نفت در رسوبات… 108

4-7- آلودگی به وجود آمده در اثر اشتعال چاههای نفت کویت در جنگ خلیج فارس…. 109

4-8- نتیجه گیری نهایی.. 110

4-9- پیشنهادات… 112

منابع فارسی و انگلیسی.. 114

فهرست جداول صفحه

جدول 1-1: فهرستی از صنایع به همراه فلزات سنگین احتمالی در پساب… 5

جدول 1-2: انتشار و فلزات کم مقدار در جو سطح جهان. 9

جدول 1-3: انتقال فلزات از هوا به سطح دریا ( برحسب نانوگرم بر سانتیمتر مربع) 10

جدول1-4: مقایسه اختصاصات بیواندیکاتورها و بیومارکرها 17

جدول 1-5: نمونه هایی از میزان فلزات توسط ارگانیزم های مختلف… 18

جدول 1-6: روش های اصلی مورد استفاده در پایش زیستی.. 20

جدول1-7: جزایر مرجانی خلیج فارس…. 33

جدول1-8: وسعت ودرجه بندی تهدیدات بروی آبسنگ های مرجانی نواحی مختلف دنیا 34

جدول 1-9: خلاصه ای از مطالعات منتخب پیشین بر روی غلظت فلزات سنگین در مرجان ها….

جدول2-3: شرایط زمانی و دمایی نمونه در دستگاه جذب اتمی کوره گرافیتی(SHIMADZU,AA 670G). 71

جدول3-1: برخی از گزینه های آمار توصیفی(میانگین، مقدار انحراف از معیار استاندارد، دامنه تغییرات داده ها و ماکزیمم و مینیمم همه داده ها) برای بررسی و مقایسه غلظت عناصر نیکل و کادمیوم دربافت اسکلتی مرجان های خانواده Faviidae و Poritidae و رسوبات پیرامونی آنها در هریک از ایستگاه های پارک زیتون، جزایر ناز و منطقه شیب دراز جنوب جزیره قشم. 76

جدول 3-2: نتایج حاصل از مقایسه عناصر نیکل و کادمیوم در دربافت اسکلتی مرجان خانواده Faviidae بین ایستگاه های پارک زیتون، جزایر ناز و منطقه شیب دراز جنوب جزیره قشم (میانگین ± انحراف از معیار) 78

جدول 3-4: نتایج حاصل از مقایسه عناصر نیکل و کادمیوم رسوبات پیرامونی مرجان ها بین ایستگاه های پارک زیتون، جزایر ناز و منطقه شیب دراز جنوب جزیره قشم (میانگین ± انحراف از معیار) 79

جدول 4-1: کاربری نواحی ساحلی و دریا و فشارهای اصلی محیطی در خلیج فارس…………………….102

جدول 4-2: عمده ترین وقایع اخیر نشت نفت در خلیج فارس………………106

فهرست شکل ها صفحه

شکل 1-1: شکل شماتیک از آنتوزوا (b) برش عرضی از قسمت دهانی پولیپ مرجان و قسمت های تشکیل دهنده……..29

……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 49

4-4 معین کردن اندازه مینیمال مجموعه……………………………………………………………………………………………………………………. 57

4-5 کارایی بهتر……………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 58

4-6 مقایسه نوع دیگری از دنباله ها…………………………………………………………………………………………………………………………… 60

مراجع

واژه نامه فارسی به انگلیسی………………………………………………………………………………………………………………………………….. 65

واژه نامه انگلیسی به فارسی……………………………………………………………………………………………………………………………………… 67

فهرست جدول ها

3-1 TNest(n, k)تعدادی از توپولوژی ه ای روی یک مجموعه−n نقطه ای ترتیب کلی شامل مجموعه محدب آشیانه ای است 33

3-2 تعدادTcvx(n) وTnest(n) از توپولوژی محدب آشیانه ای و توپولوژی محدب روی یک مجموعه ی ترکیب کلی–nنقطه ای، و تعدادT(n) از توپولوژی روی یک مجموعه ی–nنقطه است……………………………………………………………………………………. 40

4-1 تعدادی از اعدادمینیمال از نقاطm(k) هستند که برای ساختن یک توپولوژی دارایkمجموعه باز در محاسباتی در (27) به ازای]٢,٢۵k∈[ نیاز داریم………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 44

4-2 مقادیرf(n)را به ازای 10n≤بدست می آوریم ، در سطر پایین اندازه اندازه کوچکترین توپولوژی که بیشتر از 1 است، با استفاده از قضیه بالا بدست نمی آید، در این صورت^4/(2–(n2³از قضیه بالا بدست می آید، واعداد بدست امده را برای اینکه به اعداد صحیح تبدیل شوند، به سمت پایین روند می کنیم………………………………………………………………………………………………………………………………………… 44

فهرست شکل ها

• گراف جهتدار رابطهR……………. …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..8

2-1 شبکه ای از مقسوم علیه های عدد صحیح 60 است که به صورت مرتب تقسیم شده است…………………………………………………………. 14

2-2 شبکه ای از ریز مجموعه های{x, y, z}……………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 15

• …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 19

• …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 20

• شکل های توپولوژی برای) ,16 T(n …………………………………………………………………………………………………………………………………………. 21

• شکل های توپولوژی برای) ,16 T(n …… …………………………………………………………………………………………………………………………………….22

• …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 26

• …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 28

• ……………………………………………………………………………………………. ……………………………………………………………………………………………………………………28

3-1 یک نمونه از توپولوژی روی(8و1) است………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 37

3-2 در مثال ممکن است نقطه اضافه شده به خارج همسایگی ها شامل هیچ یک از همسایگی ها نباشد یا خارج دوتا همسایگی باشد و شامل یک همسایگی و همچنین امکان دارد شامل سه همسایگی باشد.. ……………………………………………………………………………………………………….38

3-3 امکان انتخاب برای MN(9) وجود دارد اگر همسایگی مینیمال MN(J) بسطی برای

(8و1)j∈ نباشد………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 38

3-4 امکان انتخاب برایMN(9)وجود دارد اگرMN(2)وMN(6)بسطی شامل 9 باشند………………………………………………………………………… 39

4-1 مجموعه ترتیب جزئی) P(T مربوط به توپولوژی القاء شده T به وسیله توپولوژیT در مثال2.4 اس

4-2 شیوه قضیه 3.3 به ازای K=105که در آن K₂=1101001 است…………………………………………………………………………………………………………… 51

4-3 شیوه قضیه 7.3 به ازای K=5550 که در آن K2=1010110101110 دوگان ایده آل مرتب یکریخت به• ⊕•است، که به وسیله روش دایره ای تعریف می کنیم. ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 54

4-4 یک روش کارا برای ساختن یک مجموعه ترتیب جزئی با 65535 پادزنجیر با استفاده از 19 عنصر است 59

4-5 شیوه قضیه 3.3 را برایK=4681بکار می بریم……………………………………………………………………………………………………………………………………… 60

1-3-5- پیلی……………………………………………………………………………………………………………………28

1-4-5- ایمونوگلوبولین A₁پروتئاز……………………………………………………………………………….30

1-5-5- لیپوپلی ساکارید (LPS) …………………………………………………………………………………………………………………………………..31

1-6-5- نقش LPS در بیماری زایی……………………………………………………………………………………………………………………………..32

1-1-6 کپسول…………………………………………………………………………………………………………………34

1-2-6- دخالت کپسول در بیماری زایی………………………………………………………36

1-3-6- ژنتیک بیان کپسول………………………………………………………….36

1-1-8 روش­ها و آزمون­های تشخیص آزمایشگاهی………………………………………………………38

1-2-8 روش­های تشخیص کلاسیک……………………………………………………………………………………….38

1-3-8- معایب تشخیص کلاسیک……………………………………………………………………………………39

1-4-8- برتری روش­های تشخیص مولکولی………………………………………………………………………………..40

1-1-9- اپیدمیولوژی …………………………………………………………………………..40

1-1-10- پیشگیری …………………………………………………………………………………………….44

1-1-11- درمان……………………………………………………………………………………………………………45

2-1 واکسن های کونژوگه…………………………………………………………………….48

2-2- واکسن های Hib………………………………………………………………………………………..49

2-3- پاسخ های واکسن کونژوگه…………………………………………..50

2-4- پاسخ های واکسن پلی ساکاریدی…………………….51

2-5- عوامل دخیل در ایمونوژنسیتی واکسن های کونژوگه پلی ساکاریدی – پروتئینی………………………………………………………………..51

2-5-1- طول زنجیره پلی ساکاریدی ………………………………..51

2-5-2- نوع اتصال…………………………………………………………………………………………………52

2-5-3- مولکول های حامل ……………………………………………………52

2-6-EDC یا EDAC…………………………………………………………………………………………52

2-7- کونژوگاسیون به روش آمیداسیون ………………………………………………………53

2-8- تهیه کونژوگه ایمونوژن هاپتن¹– حامل……………………………………………………….54

2-9- پروتئین های حامل مناسب برای ایجاد کونژوگه های آنتی ژنیک…………………………………………………..55

2-10- ادجوانت های مناسب در طراحی واکسن کونژوگه………………………………………………………………………………….56

2-11- سنجش فعالیت باكتری كشی……………………………………………………………………56

فصل سوم- مواد و روش ها

3-1-1 مواد و وسایل لازم ……………………………………………………………………60

3-2-1- تهیه میكروارگانیسم های به كار گرفته شده در این مطالعه……………………………………………………………………………………………………66

3-2-2-باز كردن سویه باکتری همو فیلوس آنفولانزای تیپ b لیوفیلیزه و کشت آن……………………………………………………………66

3-2-3-فرآوردن و تخلیص PRP………………………………………………………………………………………………………..66

3-2-4- تهیه بذر محیط کشت …………………………………………………..66

3-2-5-تیمار عصاره مخمر…………………………………………………………………..67

3-2-6-آماده کردن فرمانتور و تلقیح بذر ………………………………………………………………………………………………..70

3-2-7-نمونه گیری از فرمانتور…………………………………………………..72

3-2-8- مرحله رسوب دهی الکلی………………………………………..73

3-2-9- مرحله الکل زنی ……………………………………………………………………….73

3-2-10- مرحله شست و شو با کلریدمنیزیم………………………………………………………………………………………….74

3-2-11- تیمار با ستاولن…………………………………………………………………………74

3-2-12- افزودن فسفات سدیم………………………………………………….75

3-2-13- مرحله الکل زنی مجدد…………………………………………..75

3-2-14- تیمار با هیدروکسیل آپاتیت………………………………75

3-2-15- فیلتراسیون سوپرناتانت …………………………………………76

3-2-16- لیوفلیزاسیون ……………………………………………………………………………….76

3-2-17- تعیین خلوص PRP تخلیص شده ………………………………………………………………………………………………………….76

3-2-18- تست ریبوز …………………………………………………………………………………76

3-2-18- 1- اساس تست بیال …………………………………………..77

3-2-18- 2- معرف های تست بیال ……………………………….77

3-2-18- 3-محلولها و ترکیبات ………………………………………….77

3-2-18- 4-تهیه ی محلول های استاندارد ریبوز ………………………………………………………………………..77

3-2-18- 5- آماده سازی PRP تخلیص شده ……………………………………………………………………………….79

3-3-1- آزمون های پروتئین سنجی ……………………………………………………………………………………………….79

3-3-2روش برادفورد …………………………………………………………………………………..81

3-3-3- روش پروتئین سنجی Lowry ………………………………………………………………81

3-4-1- آزمون ایمونو ژل دیفیوژن ………………………………………………………………….83

3-5- سنجش نوکلئیک اسید …………………………………………………………………………………………………….83

3-6-تخلیص اگزوتوسین A سودوموناس آئروژینوزا PA103 …………………………………………………………………….84

3-6-1- طرز باز كردن سوش لیوفیلیزه جدید …………………………………………………………………………..84

3-6-2-تهیه لوله بذر ……………………………………………………………………………………….84

3-6-3- اطمینان از خالص بودن سوش …………………………………………………………………………..85

3-6-4- تست سوش برای تولید اگزوتوکسین A ………………………………………………………………………………………………..85

3-6-5-تهیه محیط کشت ………………………………………………………………………85

3-6-7- رسوب با استات روی 1 مولار ………………………………………………………….87

3-6-8- رسوب با سولفات آمونیوم …………………………………………………………………………………………..87

3-6-9- دیالیز اگزوتوكسین A …………………………………………………………………………….88

3-6-10- کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل اگزوتوكسین A ………………………………………………………………………………..89

3-16-2-1مواد مورد نیاز: ………………………………………………………………………89

3-6-11سنجش تولید اگزوتوكسین ………………………………………………………..89

3-6-11-1-سنجش توکسیسیتی ……………………………………………………………………………….90

3-6-12- دتوكسیفای كردن اگزوتوكسین A به روش فرمآلدیئد ……………………………………………………………………………91

3-7- ژل فیلتراسیون جهت تخلیص كونژوگه PRP هموفیلوس آنفولانزای تیپb (Hib) با اگزو توکسین A سودوموناس آئروژینوزا …………………..92

3-8- آزمون های کنترل و کیفی کونژوگه …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….92

3-9- سنجش پروتئین …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………92

3-11- تعیین میزان اسید نوکلئیک …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..93

3-12- كنترل توكسیسیته غیرعادی((Abnormal toxicity ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………94

3-13- آزمون پیروژنی ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….94

3-14- ایمیونیزاسیون خرگوشها و خونگیری …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………94

3-15تهیه بافر باربیتال : ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..94

3-16- تهیه محلول کوماسی بلو و رنگ بر : ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….94

3-16- پلی آكریل آمید ژل الكتروفورز درحضور سدیم دو دسیل سولفات(SDS-PAGE) ………………………………………………………..96

3-16-1- اصول روش SDS-PAGE …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….96

3-16-3- محلول­های مورد نیاز ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….97

3-16-4- تهیه ژل پایین SDS-PAGE ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….97

3-16-5- تهیه ژل بالا با SDS-PAGE …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………98

3-16-6-رنگ آمیزی ژل پلی آكریل آمید ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………99

3-16-7- محلول­های مورد نیاز ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………100

3-16-8- روش رنگ آمیزی …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………101

3-17- آزمون بررسی فعالیت باکتریسیدالی سرم حیوان ایمیون (SBA) ………………………………………………………………………………………………………………………………….101

3-17-1- اصول آزمون SBA ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….101

3-17-2- مواد مورد نیاز برای آزمون SBA Serum Bactericidal Assay)) …………………………..101

3-17-3-روش انجام آزمون ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………102

فصل چهارم: نتایج

4-1-کشت سویه باکتری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….107

4-2- شرایط کشت در فرمانتور……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..108

4-3- تعیین خلوص PRP ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..109

4-4- اندازه گیری میزان ریبوز ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….111

4-5- کنترل میزان پروتئین در پلی ساکارید PRP و ETA و PRP- ETA……………………………………………………………………………………………………………..113

4-6- کنترل میزان اسید نوکلئیک در پلی ساکارید PRP و PRP- ETA………………………………………………………………………………………………………………………..113

4-7- کونژوگاسیون PRP با اگزوتوکسینA سودوموناس آئروژینوزا……………………………………………………………………………………………………………………………………………………114

4-8- بازده کونژوگاسیون PRP-ETA ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………115

4-9- کنترل پیروژنی …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..115

4-10- کنترل توکسیسیتی غیر عادی در موش سوری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….116

4-11- آزمون ایمونوژل دیفیوژن…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………116

4-12- الکتروفورز (SDS-PAGE) برای بررسی وزن مولکولی …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….117

4-13- ارزیابی فعالیت باکتری كشی سرم حیوان واکسینه شده ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….117

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1- واکسن های کونژوگه ی (Hboc) PRP-CRM197………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….124

5-2- واکسن کونژوگه ی PRP-TT ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..125

5-3- واکسن کونژوگه ی PRP-OMP ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..125

5-4- تولید کپسول هموفیلوس آنفولانزای تیپ b(PRP) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..126

5-5- کونژوگاسیون PRP با اگزوتوکسین A…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….127

5-6- سرم باکتریسیدال اسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….128

نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. ……………………………………………………………….129

پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. ………… …………………………………………………………129

منابع…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 130

فهرست شکل ها

شکل 1-1 کلونی هموفیلوس آنفلوانزا در محیط شکلات آگار……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..19

شکل1-2 هموفیلوس آنفلوانزا………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….20

شکل1-3 تیپ های مختلف کپسول هموفیلوس آنفلوآنزا…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………35

شکل 1-4 پراکندگی سنی عفونت Hib از اکتبر 1990 تا سپتامبر 1991 در شش منطقه در انگلستان و والس. از 433 مورد گزارش شده (84%) 362 مورد به علت hib ، (13%) 54 مورد به علت غیر سروتیپی و 13 مورد سروتیپ نشده بودند…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….41

شکال3-1- باز کردن سویه PTCC هموفیلوس آنفلوانزا……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..67

شکال3-2- تیمار عصاره مخمر . چپ: تغییر رنگ آب در روز اول دیالیز عصاره مخمر.راست: روز سوم دیالیز عصاره مخمر بدون تغییر رنگ آب……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………70

شکال3-3- فرمانتور Novo-Paljas کشور هلند………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………71

شکال3-4 راست: اضافه کردن عصاره مخمر و فاکتور رشد – چپ : اضافه کردن بذر به محیط کشت…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..72

شکال3-5رسوب حاصل از الکل زنی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..74

شکل3-6 تهیه استانداردهای ریبوز(الف -قبل از حرارت ، ب – بعد از حرارت) …………………………………………………………………………………………………………….78

شکل 3-7 رسوب با سولفات آمونیوم…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….88

شکل 3-8 دیالیز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………89

شکل 4-1کلونی هموفیلوس آنفلانزا روی محیط شکلات آگار………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………107

شکل 4-2 تست آکروفلاوین…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….107

شکل 4-3 طیف سنجی NMR ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….110

شکل 4-4 منحنی FTIR……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..111

شکل 5-5 آزمون ایمونوژل دیفیوژن…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….116

شکل 4-6- الکتروفورز (SDS-PAGE) برای PRP-ETA و ETA…………………………………………………………………………………………………………………………………..117

فهرست جدول ها و نمودارها

نمودار 3-1نمودار استاندارد لوری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..83

جدول 4-1 شاخص های فرمانتاسیون Hib جدول…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..108

نمودار 4-1 تغییرات جذب نوری برای رشد Hib…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….109

نمودار 4-2 تغییرات PH در رشد Hib…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….109

نمودار 4-3 تغییرات گلوکز در رشد Hib……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………110

جدول 4-2 تهیه استاندارد برای غلظت ریبوز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………112

نمودار 4-4- منحنی استاندارد ریبوز……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………112

……………………………………………………………………………………………………………………. 25

1-9-تشخیص توکسوپلاسموز………………………………………………………………………………………………………. 29

1-9-1- تشخیص مستقیم…………………………………………………………………………………………………………… 29

1-9-1-1-تشخیص هیستولوژی (بافت شناسی…………………………………………………………………………. 29

1-9-1-2- جداسازی توکسوپلاسما گوندی……………………………………………………………………………….. 30

1-9-1-3-تکنیک واکنش زنجیری پلیمراز (PCR1-15-2-تشخیص غیر مستقیم……………… 30

1-9-2-تشخیص غیر مستقیم ……………………………………………………………………………………………………… 31

1-9-2-1- تست رنگی سابین – فلدمن……………………………………………………………………………………. 34

1-9-2-2- سنجش آنتی بادی فلوئورسنت غیر مستقیم………………………………………………………….. 34

1-9-2-3- تست سنجش آگلوتیناسین ایمنوسوربنت………………………………………………………………. 35

1-10-الایزا (ELISA)…………………………………………………………………………………………………………………. 35

1-10-1- الایزای مستقیم ………………………………………………………………………………………………………….. 36

1-10-2- الایزای غیر مستقیم……………………………………………………………………………………………………. 36

1-10-3- الایزای ساندویچ…………………………………………………………………………………………………………… 37

1-10-3-1-الایزای ساندویچ مستقیم………………………………………………………………………………………… 37

1-10-3-2-الایزای ساندویچ غیر مستقیم…………………………………………………………………………………. 37

1-10-4- الایزای رقابتی یا مهاری………………………………………………………………………………………………. 37

1-11-کاربرد پروتئین های نوترکیب در تشخیص توکسوپلاسماَ………………………………………………. 38

1-12-تولید پروتئین نوترکیب…………………………………………………………………………………………………….. 39

1-13-تشخیص سرولوژی توکسوپلاسموزیس در دوران حاملگی……………………………………………… 39

1-14-ارزش تشخیصی ایزوتایپ های مختلف ایمونوگلوبولین

اختصاصی توکسوپلاسما در تشخیص عفونت……………………………………………………………………………….. 40

1-15-کاربرد IgGAvidity در افتراق عفونت حاد از مزمن توکسوپلاسموزیس……………………… 42

1-16-درمان 44

1-17-پیشگیری 47

1-18- بیان مسئله و اهمیت آن………………………………………………………………………………………………….. 48

1-19- دلایل انتخاب موضوع ……………………………………………………………………………………………………… 50

1-20-اهداف و فرضیا ت ……………………………………………………………………………………………………………. 51

فصل دوم: مروری بر تحقیقات گذشته

2-1- مروری بر تحقیقات گذشته …………………………………………………………………………………………………………….. 53

فصل سوم: مواد و روشها

3-1- تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی ……………………………………………………………….. 59

3-1-1-مکانیسم تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی……………………………………………… 59

3-1-2- تهیه و تخلیص پروتئین های نو تركیب rGRA7 (pUET-GRA7) و

rGRA6(PUET-GRA6 ……………………………………………………………………………………………………………… 60

3-2- بررسی و تائید پروتئین های تخلیص شده……………………………………………………………………….. 62

3-2-1- بررسی و تائید پروتئین های نوترکیب GRA7 و GRA6 بوسیله آنالیز SDS-PAGE 62

3-2-2- تائید هویت پروتئین بیان شده با روش وسترن بلات………………………………………………….. 66

3-3- دیالیز نمونه های تخلیص شده…………………………………………………………………………………………… 71

3-4- تعیین غلظت پروتئین………………………………………………………………………………………………………… 71

3-5- سیستم های الایزا(اصول کار) …………………………………………………………………………………………… 71

3-5-1- طراحی سیستم های الایزا…………………………………………………………………………………………….. 72

3-5-1-1- نکات تکنیکی در الایزا……………………………………………………………………………………………… 72

3-5-1-2- برخی مشکلات در الایزا…………………………………………………………………………………………… 74

3-6- بررسی پتانسیل PUET-GRA7 و PUET-GRA6 در تشخیص عفونت حاد و مزمن …

توکسوپلاسموز با روش الایزا………………………………………………………………………………………………………….. 76

3-6-1-برقراری شرایط الایزا……………………………………………………………………………………………………….. 76

3-6-2- استفاده از لیزات باکتری در الایزا ………………………………………………………………………… 76

3-7- اندازه گیری میزان آنتی بادی به روش الایزای غیر مستقیم …………………………………… 77

3-8-تعیین Cut off در روش الایزا ………………………………………………………………………………………….. 80

3-9- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgG با کیت تجاری Euroimmun ………………………………… 81

3-10- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgM با کیت تجاری Euroimmun ……………………………… 82

3-11- برقراری شرایط بهینه به منظور محاسبه Avidity Index IgG ………………………………… 82

3-12- اندازه گیری IgG Avidity Index با استفاده از پروتئین های نوترکیب PUET-GRA7 و

PUET-GRA6 83

3-13- اندازه گیری IgG Avidity Index با استفاده از کیت تجاری EUROIMMUN ….. 83

3-14- اندازه گیری IgG Avidity Index با استفاده از کیت تجاری Microgen………………… 85

3-15- محاسبه اندکس اویدیته نسبی (RAI) Relative avidity Index ……………………………… 88

3-16- کنترل کیفی ……………………………………………………………………………………………………………………. 88

3-16-1- حساسیت ……………………………………………………………………………………………………………………. 88

3-17-طراحی تحقیق ……………………………………………………………………………………………………………. 88

3-18- تعداد نمونه و روش نمونه گیری ………………………………………………………………………………….. 89

3-18-1- تعداد نمونه …………………………………………………………………………………………………………………. 89

3-18-2- روش نمونه گیری………………………………………………………………………………………………………… 89

فصل چهارم: نتایج آزمایشات

4-1 :تهیه و تخلیص پروتئین های نو تركیب rGRA7 (pUET-GRA7 و rGRA6

(PUET-GRA6 92

4-2- تایید هویت پروتئین های تخلیص شده با روش وسترن بلات ……………………………………….. 93

4-3- بررسیIgG,IgM,IgG Avidity نمونه های سرمی با کیت استاندارد Euroimmun 94

4-3-1- نتیجه آزمایشات IgG ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرمهای

ایرانی با کیت Euroimmun…………………………………………………………………………………………………………… . 95

4-3-2- نتیجه آزمایشات IgM ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرمهای با کیت Euroimmun 95

4-3-3-نتیجه آزمایشات IgG Avidity ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرم ها

با کیت Euroimmun …………………………………………………………………………………………………………………… 96

4-4- برقراری شرایط ELISA Avidity با پروتئین های نوترکیب ………………………………………. 100

4-5- نتایج آزمایش Avidity ELISA با استفاده از پروتئین نوترکیب GRA6 برای تمایز

عفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار……………………………………………………………………………….. 103

4-6- نتایج آزمایش Avidity ELISA با استفاده از پروتئین نوترکیب GRA7 برای تمایز

عفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار ایران …………………………………………………………………….. 103

4-7- بررسی نتایج ناهمخوان بین الایزا اویدیته با پروتئین های GRA6 وGRA7 و کیت

Euroimmun با استفاده از کیت Microgen………………………………………………………………………………. 104

فصل پنجم:بحث، پیشنهادات

منابع 121

خلاصه انگلیسی ………………………………………………………………………………………… 127

ضمائم 129

فهرستجداول

عنوان صفحه

جدول3-1: جدول ارزیابی اویدیتی در کیت میکروژن……………………………………………………………….. 87

جدول 4-1: نتایج آزمایشات Avidity ELISA,IgG,IgM سرم ها با کیت Euroimmon……… 97

جدول 4-2: بررسی نتایج ناهم خوان با کیت های Microgen,Euroimmun و پروتئین های

GRA6 وGRA7 ……………………………………………………………………………………………………………………. 106

جدول شماره 4-3: نتایج آزمایش IgG وIgG Avidity با پروتئین های GRA6 و GRA7

بر روی سرم های زنان باردار ………………………………………………………………………………………………… ….. 108

فهرست شکل ها

عنوان صفحه

شکل1-1- شكل شماتیك یك تاكی زوایت و یك برادی زوایت توكسوپلاسما گوندی ………….. 4

شکل1-2- عكس میكروسكوپ الكترونی یك تاكی زوایت، سوش VEGكه در حال

نفوذ به یك نوتروفیل صفاق موش می باشد…………………………………………………………………………………. 7

شکل1-3- عکس میکروسکوپ الکترونی از تاکی زوایت سوش VEG در حال تقسیم

اندودیوژنی داخل ماکروفاژ صفاق موش………………………………………………………………………………………… 8

شکل1-4- یك كیست بافتی توكسوپلاسما كه حاوی بیش از هزار برادی زوایت می باشد……. 9

شکل 1-5- راه های انتقال انگل توکسوپلاسما گوندی در میزبان اصلی و حد واسط……………… 16

شکل 1-6- دختری با هیدروانسفالی بعلت توکسوپلاسموز مادرزادی……………………………………….. 25

شکل 1-7- شکل شماتیک انواع الایزا…………………………………………………………………………………………. 38

شکل3-1:نوارهای کیت میکروژن…………………………………………………………………………………………………. 87

شکل 4-1 : تخلیص پروتئین GRA6 به روش کروماتوگرافی تمایلی …………………………………….. 92

شکل 4-2: تخلیص پروتئین GRA7 به روش کروماتوگرافی تمایلی ……………………………………….. 93

شکل 4-3: بررسی هویت آنتی ژنیسته پروتئین های GRA6 وGRA7

تخلیص شده باروش وسترن بلات ……………………………………………………………………………………………….. 94

شکل 4-4 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما

در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA6 ………………………………………………………………………… 101

شکل 4-5 : تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمن

عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA6………………………………………. 101

شکل 4-6 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما

در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA7………………………………………………………………………….. 102

شکل 4-7 : تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمن

عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA7……………………………………….. 102

شکل4-8: مدلی از بلوغ آنتی بادی های IgG به آنتی ژن های توکسوپلاسمای………………………. 105

شکل 4-9: نتایج کیت میکروژن………………………………………………………………………………………………………………… 106

شکل4-10: مقایسه اجرای تست Avidity با کیت Euroimmun و پروتئین GRA6 برای افتراق

عفونت حاد و مزمن و تحت حاد………………………………………………………………………………………………….. 107

چکیده فارسی

توکسوپلاسموزیس که توسط انگل اجباری درون سلولی توکسوپلاسما گوندی، ایجاد می شود. در افرادی که از سیستم ایمنی سالمی برخوردارند، عفونت اولیه معمولاً بدون علائم ویا با عوارض خفیفی همراه است، ولی در نوزادانی که عفونت را به طور مادرزادی دریافت کرده اند، ممکن است منجر به عوارض خطرناکی مثل عقب ماندگی ذهنی، کوری و یا حتی مرگ شود. بنابراین تشخیص صحیح عفونت اخیر (recent) توكسوپلاسما و تمایز آن از عفونت مزمن در زنان باردار، اهمیت حیاتی در مراقبتهای درمانی مادر و جلوگیری از بروز عوارض عصبی- مغزی در جنین دارد. از آنجایی که پاسخ آنتی بادی های IgM در درصد قابل ملاحظه ای از افراد، ماه ها یا حتی سال ها پس از کسب عفونت، مثبت باقی می ماند، تمایز صحیح میان عفونت حاد و مزمن به ویژه در زنان باردار، اهمیت فوق العاده ای دارد. در حال حاضر، بنظر می رسد تركیب دو روش الایزای IgM و الایزای آویدیته IgG بهترین و مطمئن ترین نتایج را برای تشخیص عفونت حاد و تمایز آن از عفونت مزمن می دهند. شرایط بهینه روش IgG avidity ELISA برای تمایز سرم ها از عفونت حاد ومزمن با استفاده از دو پروتئین GRA7 وGRA6 برقرار (develop) شد. در نهایت ،كارایی روش avidity ELISA با استفاده از دو پروتئین فوق برای تشخیص عفونت حاد و مزمن در زنان باردار بررسی شد. در این تحقیق از کیت استاندارد Microgen جهت مقایسه نتایج ناهمخوان مابین کیت Euroimmun و پروتئین های نوترکیب GRA6 وGRA7 استفاده شد، نتایج بدست آمده از کیت Microgen دقیقا شبیه با پروتئین های نوترکیب بود. دراین تحقیق از 21 سرم حاد و 28 سرم مزمن و 29 سرم تحت حاد زنان مبتلا به توکسوپلاسما كه حاد و مزمن وتحت حاد بودن آن با استفاده از تست های استاندارد سرولوژیك برای ما مشخص شده بود استفاده شد . از21 سرم حاد در آویدیته الایزا با پروتئین GRA6 ، تنها 1 سرم آویدیته بالا داشت و از 28 سرم مزمن ، 2سرم آویدیته پایین داشت و از 29 سرم تحت حاد 5 سرم آویدیته پایین داشتند. در آزمایش با پروتئین GRA7 از 21 سرم حاد، 1 سرم آویدیته بالا داشتند و از 28سرم مزمن همه سرم ها آویدیته بالا داشتند و از 29 سرم تحت حاد ، 6 سرم آویدیته پایین داشتند.همچنین در این تحقیق تعدادی از سرم ها که نتایج ناهمخوانی ما بین کیت Euroimmun و پروتئین های نوترکیب GRA6 و GRA7داشتند را با استفاده از کیت استاندارد Microgen بررسی کردیم که نتایج این کیت استاندارد شبیه پروتئین های نوترکیب GRA6 و GRA7بخصوص پروتئین GRA6 بود که این یافته ها کارایی بهتر GRA6 را نشان می دهد. استفاده از آنتی ژنهای نوترکیب به جای آنتی ژنهای توتال انگل در کیت تشخیصی آویدیته الایزا ممکن است منجر به افزایش کارایی آنها شده و استانداردسازی کیتها را نیز تسهیل کند.