ها…………………………………………………………………………. 16

1-2-3-1-تولید ترکیبات ممانعت کننده…………………………………………………………………….. 16

1-2-3-2-رقابت بر سر مکان های اتصال…………………………………………………………………. 17

1-2-3-3-رقابت جهت جذب و مصرف مواد مغذی……………………………………………………. 17

1-2-4-معیارها و روشهای انتخاب پروبیوتیک……………………………………………………………. 18

1-2-4-1-جمع آوری اطلاعات زمینه ایی…………………………………………………………………. 19

1-2-4-2-تهیه پروبیوتیک…………………………………………………………………………………….. 19

1-2-4-3-ارزیابی توان پروبیوتیک در جهت خارج سازی سویه های بیماری زا………………….. 19

1-2-4-4-ارزیابی امکان بیماریزایی پروبیوتیک…………………………………………………………… 19

1-2-4-5-ارزیابی اثر پروبیوتیک بر میزبان………………………………………………………………… 20

1-2-4-6-تولید انبوه ، ارزیابی سود اقتصادی……………………………………………………………… 20

1-3- سیستم ایمنی در ماهیان………………………………………………………………………………….. 21

1-3-1-ایمنی غیر اختصاصی………………………………………………………………………………….. 21

1-3-1-1-ایمنی غیر اختصاصی (ترکیبات مایع )………………………………………………………… 22

1-3-1-1-1-لیزوزیم…………………………………………………………………………………………… 23

1-3-1-1-2-سیستم عامل مکمل (کمپلان ) در ماهیان………………………………………………….. 23

1-3-1-2-ایمنی غیر اختصاصی ( سلولی )……………………………………………………………….. 23

1-3-1-2-1-لنفوسیت ها……………………………………………………………………………………… 23

1-3-1-2-2-نوتروفیل ها……………………………………………………………………………………… 24

1-3-1-2-3-ائوزینوفیل ها……………………………………………………………………………………. 24

1-3-1-2-4-مونوسیت ها…………………………………………………………………………………….. 24

1-3-2-ایمنی اختصاصی……………………………………………………………………………………….. 24

1-3-2-1-ایمنی همورال……………………………………………………………………………………….. 25

1-3-2-1-1-ایمنوگلوبولین M (IgM)……………………………………………………………………. 25

1-3-2-2-ایمنی با واسطه ی سلولی ……………………………………………………………………….. 25

1-4-اهمیت مطالعات خون شناسی در ماهیان……………………………………………………………… 26

1-4-1-شاخص های خونی……………………………………………………………………………………. 26

1-4-1-1-گلبول های سفید (لکوسیت……………………………………………………………………… 26

1-4-1-2-گلبول های قرمز (اریتروسیت ، هموسیت )………………………………………………….. 26

1-4-1-3-شاخص های گلبول قرمز یا اندیس های خونی……………………………………………… 27

1-4-1-4-هماتوکریت………………………………………………………………………………………….. 27

1-4-1-5-هموگلوبین…………………………………………………………………………………………… 27

1-5-شاخص های بیوشیمیایی…………………………………………………………………………………. 27

1-5-1-پروتئین کل پلاسما و آلبومین……………………………………………………………………….. 27

1-5-2-گلوکز…………………………………………………………………………………………………….. 28

1-5-3-گلوتامیک پیرویک ترانس آمیناز……………………………………………………………………. 28

1-6-رابطه عوامل محیطی و میکروفلور دستگاه گوارش………………………………………………….. 28

1-7-باکتری های اسید لاکتیک (LAB)…………………………………………………………………….. 29

1-7-1-رده بندی علمی………………………………………………………………………………………… 30

فصل دوم: سابقه ی تحقیق

2- سابقه ی تحقیق……………………………………………………………………………………………….. 32

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1-مکان و زمان انجام تحقیق……………………………………………………………………………….. 41

3-2-مکان پرورش……………………………………………………………………………………………….. 42

3-3-ذخیره سازی ، سازگاری و تقسیم بچه ماهیان……………………………………………………….. 43

3-4-پروبیوتیک مورد آزمایشLactobacillus plantarum………………………………………. 44

3-5-نحوه ی آماده سازی جیره غذایی……………………………………………………………………….. 44

3-6-زیست سنجی………………………………………………………………………………………………. 45

3-7-نحوه ی غذادهی……………………………………………………………………………………………. 45

3-8-بررسی عوامل فیزیکی و شیمیایی آب…………………………………………………………………. 46

3-9-بررسی پارامترهای خون شناسی………………………………………………………………………… 46

3-9-1-خون گیری و تهیه سرم……………………………………………………………………………….. 46

3-9-2-شاخص های خونی……………………………………………………………………………………. 47

3-9-2-1-شمارش گلبول های قرمز و سفید………………………………………………………………. 47

3-9-2-2-اندازه گیری هماتوکریت………………………………………………………………………….. 48

3-9-2-3-اندازه گیری هموگلوبین…………………………………………………………………………… 49

3-9-2-4-شاخص های گلبول قرمز………………………………………………………………………… 49

3-9-2-5-تشخیص افتراقی گلبول های سفید…………………………………………………………….. 50

3-10-فاکتورهای ایمنی…………………………………………………………………………………………. 51

3-10-1-شاخص های بیوشیمیایی ایمنی اختصاصی…………………………………………………….. 51

3-10-1-1-اندازه گیری ایمنو گلوبولینM (IgM)……………………………………………………… 51

3-10-2-شاخص های بیوشیمیایی ایمنی غیر اختصاصی……………………………………………….. 51

3-10-2-1-اندازه گیری فعلیت لیزوزیم……………………………………………………………………. 51

3-10-2-2-پروتئین کل سرم…………………………………………………………………………………. 52

3-11-روش انجام آزمایشات فلور باکتریایی روده در آزمایشگاه……………………………………… 52

3-11-1-روش آماده سازی محیط های کشت……………………………………………………………. 52

3-11-2-روش آماده سازی رقت های محلول روده و کشت اولیه…………………………………… 53

3-11-3-روش شمارش کلنی ها و تقسیم بندی آنها…………………………………………………….. 54

3-12-روش محاسبه شاخص های رشد…………………………………………………………………….. 54

3-12-1-اندازه گیری طول و وزن……………………………………………………………………………. 54

3-12-2-شاخص وضعیت…………………………………………………………………………………….. 55

3-12-3-درصد افزایش وزن………………………………………………………………………………….. 55

3-12-4-ضریب تبدیل غذایی………………………………………………………………………………… 55

3-12-5-ضریب رشد ویژه……………………………………………………………………………………. 55

3-12-6-میانگین رشد روزانه…………………………………………………………………………………. 55

3-12-7-شاخص کبدی………………………………………………………………………………………… 56

3-13-آماده سازی لاشه جهت تجزیه شیمیایی ……………………………………………………………. 56

3-14-تجزیه و تحلیل آماری………………………………………………………………………………….. 56

فصل چهارم: نتایج

4-نتایج………………………………………………………………………………………………………………. 58

4-1-نتایج حاصل از اندازه گیری عوامل محیطی…………………………………………………………… 58

4-1-1-دمای آب………………………………………………………………………………………………… 58

4-1-2-اکسیژن محلول آب……………………………………………………………………………………. 58

4-1-3-pH آب محیط پرورش……………………………………………………………………………… 58

4-2-نتایج حاصل از عملکرد رشد بچه ماهیان قزل آلا تحت تاثیر سطوح مختلف پروبیوتیک….. 59

4-2-1-اثر بر وزن نهایی……………………………………………………………………………………….. 59

4-2-2-اثر بر طول نهایی……………………………………………………………………………………….. 59

4-2-3-اثر بر ضریب تبدیل غذایی…………………………………………………………………………… 60

4-2-4-ضریب رشد ویژه………………………………………………………………………………………. 60

4-2-5-درصد افزایش وزن……………………………………………………………………………………. 61

4-2-6-میانگین رشد روزانه……………………………………………………………………………………. 61

4-2-7-میزان ضریب چاقی……………………………………………………………………………………. 62

4-3-فلور باکتریایی روده ماهیان تیمار و شاهد…………………………………………………………….. 62

4-3-1-میزان باکتریL.pدر فلور روده قزل آلا در محیط کشت MRS…………………………… 62

4-3-2-توتال کانت باکتریایی روده ماهی قزل آلای رنگین کمان در محیط کشتTSA ……….. 62

4-4-نتایج حاصل از فاکتورهای خونی………………………………………………………………………. 63

4-4-1-تعداد گلبول های سفید خون………………………………………………………………………… 63

4-4-2-تعداد گلبول های قرمز خون…………………………………………………………………………. 64

4-4-3-غلظت هموگلوبین خون………………………………………………………………………………. 64

4-4-4-درصد هماتوکریت خون……………………………………………………………………………… 65

4-4-5-متوسط حجم گلبول قرمز…………………………………………………………………………….. 65

4-4-6-متوسط غلظت هموگلوبین سلولی………………………………………………………………….. 66

4-4-7-متوسط هموگلوبین گلبول قرمز……………………………………………………………………… 66

4-4-8-درصد لنفوسیت………………………………………………………………………………………… 67

4-4-9-مقادیر نوتروفیل………………………………………………………………………………………… 67

4-4-10-درصد منوسیت……………………………………………………………………………………….. 68

4-4-11-درصد ائوزینوفیل…………………………………………………………………………………….. 68

4-5-نتایج فاکتورهای سرم……………………………………………………………………………………… 68

4-5-1-میزان توتال ایمنوگلوبولین سرم خون………………………………………………………………. 69

4-5-2-میزان IgM……………………………………………………………………………………………… 69

4-5-3-میزان لیزوزیم سرم خون……………………………………………………………………………… 70

4-6-نتایج آنالیز لاشه…………………………………………………………………………………………….. 70

4-6-1-درصد رطوبت لاشه……………………………………………………………………………………. 70

4-6-2-درصد پروتئین لاشه…………………………………………………………………………………… 71

4-6-3-درصد چربی لاشه……………………………………………………………………………………… 71

4-6-4-درصد خاکستر لاشه…………………………………………………………………………………… 72

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-بحث……………………………………………………………………………………………………………… 74

5-1-عملکرد رشد………………………………………………………………………………………………… 74

5-2-فلور باکتریایی روده……………………………………………………………………………………….. 77

5-3-شاخص های خونی……………………………………………………………………………………….. 78

5-4-شاخص های ایمنی خون…………………………………………………………………………………. 81

5-4-1-لیزوزیم…………………………………………………………………………………………………… 81

5-4-2-ایمنوگلوبین IgM……………………………………………………………………………………… 83

5-5-آنالیز لاشه……………………………………………………………………………………………………. 84

5-6-جمع بندی…………………………………………………………………………………………………… 86

پیشنهادات ………………………………………………………………………………………………………….. 87

منابع………………………………………………………………………………………………………………….. 88

پیوست………………………………………………………………………………………………………………. 107

چکیده انگلیسی……………………………………………………………………………………………………. 121

فهرست جداول

عنوان صفحه

جدول 3-1: آنالیز تقریبی خوراک استفاده شده در تغذیه بچه ماهیان مورد آزمون………………….. 44

جدول4-1: میانگین دما، اكسیژن محلول و pH آب در مقاطع زمانی مشخص در طول دوره بررسی 58

جدول 4-2- میانگین وزن نهایی (گرم) در بچه ماهیان قزل آلا در تیمارهای مختلف……………. 59

جدول 4-3- میانگین طول نهایی (سانتیمتر) در بچه ماهیان قزل آلا در تیمارهای مختلف………. 59

جدول 4-4- میانگین ضریب تبدیل غذایی بچه ماهیان قزل­آلا در تیمارهای مختلف………………. 60

جدول4-5- میانگین ضریب رشد ویژه بچه ماهیان قزل­آلا در تیمارهای مختلف……………………. 60

جدول4-6- میانگین درصد افزایش وزن بچه ماهیان قزل­آلا در تیمارهای مختلف…………………. 61

جدول 4-7- میانگین رشد روزانه بچه ماهیان قزل­آلا درتیمارهای مختلف…………………………… 61

جدول 4-8- میانگین میزان ضریب چاقی بچه ماهیان قزل­آلا درتیمارهای مختلف…………………. 62

جدول 4-9-میزان پروبیوتیک (لاکتوباسیلوس) در روده ماهیان قزل آلادرمحیط کشت MRS.. 62

جدول4-10-شمارش کلی فلور باکتریایی در روده ماهیان قزل آلا در محیط کشت TSA……… 63

جدول 4-11-تعدادگلبول های سفید خونی قزل آلا در تیمارهای شاهد وآزمایشی در پایان60روز 63

جدول 4-12-تعدادگلبول های قرمز خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان60روز 64

جدول 4-13- غلظت هموگلوبین g/dl)) خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان60

روز……………………………………………………………………………………………………………………. 64

جدول 4-14- درصد هماتوکریت % خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز 65

جدول 4-15- متوسط حجم گلبول قرمز خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60

روز………………………………………………………………………………………………………………….. 65

جدول 4-16- متوسط غلظت هموگلوبین سلولی خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان

60 روز…………………………………………………………………………………………………………….. 66

جدول 4-17- متوسط هموگلوبین گلبول قرمز خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان

60 روز…………………………………………………………………………………………………………….. 66

جدول4-18- درصد لنفوسیت خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز…. 67

جدول4-19-درصد نوتروفیل خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز….. 67

جدول4-20-درصد منوسیت خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز…… 68

جدول4-21-درصد ائوزینوفیل خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز… 68

جدول4-22-توتال ایمنوگلوبولین سرم خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60

روز………………………………………………………………………………………………………………….. 69

جدول4-23-میزان IgM سرم خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز.. 69

جدول4-24-میزان لیزوزیم سرم خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز. 70

جدول4-25-درصد رطوبت لاشه قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز…… 70

جدول4-26-درصد پروتئین لاشه قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز…… 71

جدول4-27-درصد چربی لاشه قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز…….. 71

جدول4-28-درصد خاکستر لاشه قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز…. 72

فهرست شکل ها

عنوان صفحه

شكل( 1-1) ماهی قزل آلای رنگین كمان ”Oncorhynchus mykiss”…………………………. 13

شکل (1-2) رابطه عوامل محیطی و میکروفلور دستگاه گوارش………………………………………… 29

شکل (3-1) موقعیت جغرافیایی گارگاه پرورش ماهی سردابی(قزل آلا) اشکرآب سیاهکل……… 41

شکل (3-2) نمایی از کارگاه پرورش ماهی سردابی اشکراب سیاهکل………………………………… 42

شکل (3-3) نمایی از کانال های بتونی پرورش و تیمار و تکرارها……………………………………. 43

شکل(3-4) پودر اولیه حاوی10¹¹-10¹²…………………………………………………………………… 44

شکل(3-5) رقت های مختلف از10⁶-10¹⁰………………………………………………………………. 44

شکل(3-6) غذای آماده و غنی شده با پروبیوتیک…………………………………………………………. 45

شکل (3-7) غذادهی روزانه بر اساس محاسبات روزانه………………………………………………….. 46

شکل (3-8) خونگیری از سیاهرگ در محل ساقه دمی…………………………………………………… 46

شکل (3-9) دستگاه سانتریفوژ و نحوه ی جداسازی سرم خون………………………………………… 47

شکل (3-10) دستگاه سانتریفیوژ هماتوکریت………………………………………………………………. 48

شکل (3-11) دستگاه اسپکتروفتو متر نور مرئی و UV…………………………………………………… 49

شکل(3-12): دستگاه اسپکتروفتومتر مدل 2100-VIS شرکت Unico آمریکا…………………….. 51

شکل(3-13)دستگاه Auto Analyzer مدلBT- 1500……………………………………………. 52

شکل (3-14) نحوه ی آماده سازی محیط کشت TSA و MRS آگار………………………………… 53

شکل (3-15) برداشت روده و تهیه رقت های مختلف و کشت در پلت های TSAو MRS…… 54

شکل (3-16) نگهداری پلت ها در انکوباتور و شمارش باکتری ها…………………………………… 54

شکل (3-17) آماده سازی لاشه جهت تجزیه شیمیایی…………………………………………………… 56

چکیده

تحقیق حاضر به منظور ارزیابی تاثیر باکتری اسید لاکتیکLactobacillu plantarum(KC426951) جداسازی شده از روده قزل آلای رنگین کمان بر فاکتورهای رشد ، فلور باکتریایی روده ،فاکتورهای خونی و ایمنی بچه ماهیان قزل آلای رنگین کمان (Oncorhynchus mykiss) در بهار و تابستان سال 1392انجام شد. بچه ماهیان قزل آلای رنگین کمان با میانگین وزن 24/2±56/3 به مدت 2 هفته با شرایط پرورشی محیطی در یک مرکز پرورش خصوصی ماهیان سردآبی (اشکرآب سیاهکل) در استان گیلان قبل از شروع آزمایش سازگار شدند . ماهیان در قالب یک طرح کاملا تصادفی به شش گروه شامل 540 قطعه بچه ماهی تقسیم شدند . پارامترهای کیفی آب شامل درجه حرارت ، مقدار اکسیژن محلول و pH به ترتیب 3/0±3/17 درجه سانتی گراد ،43/0±5/8 میلی گرم و 26/0±4/7 اندازه گیری شد .پنج گروه از ماهیان ( هر گروه شامل 90 ماهی) با جیره حاوی 10⁶(تیمار1) ، 10⁷(تیمار2) ، 10⁸(تیمار3) ، 10⁹(تیمار4) و10¹⁰(تیمار5) cfu g^-1 لاکتو باسیلوس پلانتاروم و گروه کنترل (شاهد) بدون جیره حاوی پروبیوتیک به مدت 60 روز تغذیه شدند . تغذیه ماهیان بر اساس 3 درصد بیوماس وزن بدن بصورت روزانه و برابر صورت پذیرفت. نتایج نشان داد که میزان وزن نهایی ، طول نهایی، ضریب رشد ، درصد افزایش وزن و میانگین رشد روزانه در تیمار 2 بیشترین و در تیمار 5 کمترین مقدار و میزان ضریب تبدیل غذایی در تیمار 2 کمترین و در تیمار 5 بیشترین را به خود اختصاص داده بودند(05/0> P). همچنین بالاترین میزان توتال لاکتیک اسید روده ماهیان قزل آلا در تیمار4 و در حالیکه کمترین مقدار مربوط به تیمار شاهد و بالاترین توتال کانت مربوط به تیمار 2 و کمترین تیمار 5 بدست آمد(05/0> P). فاکتورهای خونی: بالاترین سطوح گلبول های قرمز در تیمار 5 (3/10408±3/898333) ، گلبولهای سفید در تیمار4 (4/702±3/10833) ، حجم گلبول های قرمز در تیمار 1(8/3±7/508) ، غلظت هموگلوبین در تیمار 5 (15/0±2/11) ، هماتوكریت در تیمار 5 (2±42) ،فراوانی لنفوسیت ها در گروه شاهد (53/1±67/69) ، فراوانی نوتروفیل ها در تیمار 5 (1±39) ، بدست آمد (05/0> P).