2-4- انجام تست Nesslerization به منظور بررسی مقدار آمونیاک آزاد شده ……… 36

2-4-1- کشت کلنی ها ……………………………………………………………………. 36

2-4-2- تعیین غلظت آمونیاک آزاد شده در محلول واکنش توسط ال-آسپاراژیناز کلنی ها….. 37

2-4-3- محلول های لازم برای سنجش میزان فعالیت آنزیم ال-آسپاراژیناز کلنی ها…. 38

2-5- استخراج DNA………………………………………………………………………….

2-5-1- کشت باکتری به منظور استخراج DNA…………………………………………..

2-5-2- استخراج DNA ژنومی ………………………………………………………………. 41

2-6- واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR) ………………………………………………….. 42

2-7- الکتروفورز بر روی ژل آگارز ……………………………………………………… 43

2-8- خالص سازی محصول PCR …………………………………………………………

2-9- استخراج پلاسمید ……………………………………………………………………. 46

2-10- هضم آنزیمی و کلون کردن قطعه در داخل وکتور ……………………………. 47

2-10-1- الگوی برش آنزیمی ژن ال-آسپاراژیناز ll ……………………………………………

2-10-2- برش و آماده سازی وکتور pET23a(+) ……………………………………….

2-10-3- واکنش الحاق وکتور pET23a(+) با قطعه ژنی ال-آسپاراژینازll ………….

2-11-ایجاد سلول های Competant و انتقال پلاسمید …………………………….. 49

2-12-انتخاب کلون های مثبت …………………………………………………….. 50

2-13- تأیید کلنی های نوترکیب با PCR و هضم آنزیمی ……………………………. 51

2-13-1-PCR ……………………………………………………………………………

2-13-2- هضم آنزیمی ……………………………………………………………… 52

2-14- بیان و استخراج پروتئین بیان شونده توسط ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز ll …….

2-14-1- القاء بیان پروتئین آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll………………………………….

2-14-2- استخراج پروتئین های آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll و ال-آسپاراژیناز l ………..

2-15- بررسی اولیه بیان پروتئین نوترکیب ال-آسپاراژیناز ll و پروتئین ال-آسپاراژیناز l با SDS-PAGE……….

2-16- تعیین فعالیت آنزیمی یا فعالیت کلّی( IU ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز ……….. 58

2-17- تعیین پروتئین کلّی ( mg ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز ……………………………. 59

2-18- تعیین فعالیت ویژه( IU/mg ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز ………………………… 62

2-19- کشت سلول انسانی …………………………………………………………….. 62

2-19-1- تهیه محیط كشت RPMI1640 ……………………………………………..

2-20- تاثیر آنزیم ال-آسپاراژیناز ll (نوترکیب)،ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول های سرطانی انسانی…… 63

2-20-1- MTT Assay ………………………………………………………………

2-21- تست تغییرات سیتوپلاسمی سلول های سرطانی بعد از انجام تست MTT ………

فصل سوم نتایج ………………………………………………………… 67

3-1- بررسی و شماره گذاری کلنی ها …………………………………….. 68

3-2- نتایج اعداد جذب محلول های استاندارد سولفات آمونیوم در طول موج nm490……

3-3- بررسی اعداد جذب آمونیاک آزاد شده در محلول های به دست آمده از کلنی های جهش یافته…………. 70

3-4- جداسازی و تکثیر ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز ll ……………………………………

3-5- تعیین توالی قطعه ژنیl-aspsraginase ll…………………………………..

3-6- وارد کردن قطعه ژنیl-asparaginase ll در وکتور pET23a و تأیید آن …. 76

3-7- نتیجه SDS-PAGE نمونه های آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll , l و استاندارد ……. 79

3-8- محاسبۀ فعالیت آنزیمی(IU) ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و ال-آسپاراژیناز استاندارد.. 80

3-9- تعیین پروتئین کلّی (mg) آنزیم های ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و ال-آسپاراژیناز استاندارد……. 82

3-10- تعیین فعالیت ویژه( IU/mg ) آنزیم های ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و ال-آسپاراژیناز استاندارد…… 84

3-11- بررسی تأثیر آنزیم ال-آسپاراژینازll (نوترکیب)، ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول های سرطانی HeLa …………….

3-12- بررسی تأثیر آنزیم ال-آسپاراژینازll (نوترکیب)، ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول های سرطانی LCL…………….

3-13- بررسی تغییرات سیتوپلاسمی سلول های سرطانی بعد از انجام تست MTT ………..

فصل چهارم بحث و پیشنهادات ……………………………………………….. 98

منابع …………………………………………………………………………………….. 108

چکیده:

ال- آسپاراژیناز آنزیمی است که موجب هیدرولیز آسپاراژین به اسید آسپاراتیک و آمونیاک می شود . نام دیگر آن ال-آسپار است . این آنزیم امروزه جهت درمان بیماری سرطان خون و برخی تومور ها استفاده می شود. بطور کلی سلولهای سرطانی قادر به سنتز اسید آمینه غیر ضروری آسپاراژین نیستند در حالی که سلولهای نرمال خودشان این اسید آمینه را می سازند لذا سلولهای سرطانی نیازمند به مقادیر بالا از آسپاراژین در حال گردش می باشند . ال- آسپاراژیناز با تجزیۀ ال-آسپاراژین مانع از دسترسی سلولهای سرطانی به منابع این اسیدآمینه می شود . مهمترین اثر جانبی این دارو حالت آلرژی یا واکنش افزایش حساسیت است . هدف ما از این تحقیق 1- تهیه پروتئین آنزیم ال-آسپاراژیناز از باکتری جهش یافتهE. coli. 2- تاثیر این پروتئین بر روی یک رده سلولی سرطانی به منظور ارزیابی فعالیت آن و 3- دستیابی به آنزیم ال-آسپاراژیناز موثرتر ، با کارایی بالا و عوارض جانبی کمتر بوده است. لذا به منظور رسیدن به اهداف فوق مراحل آزمایشگاهی زیر انجام شد: 1- قرار دادن باکتریE. coliدر معرض نور UV . 2- تخلیص DNA و انجام PCR به منظور تکثیر ژن آنزیم. 3- قرار دادن سکانس در داخل پلاسمید pET23a(+) و انتقال بهE. coli.4- خالص سازی پروتئین و تعیین مقدار آن. 5- تاثیر بر روی یک لاین سرطانی و تعیین مقدار تاثیر آن. به این ترتیب بعد از ایجاد جهش و سنجش میزان تولید و فعالیت آنزیم ال-آسپاراژیناز در کلنی های جهش یافته و تخلیص و تکثیر ژن این آنزیم از باکتری هایی که ال-آسپار را بیش از حد معمول تولید می کردند، محصول PCR این ژن ها برای تعیین توالی ارسال گردید و پس از تعیین توالی و مطابقت با بانک ژن بین المللی ncbi ، سکانس قطعه ژنیال-آسپاراژینازIIاز باکتریE. coliKIAU B1 به عنوان یک سکانس جدید در بانک ژن با کدGenBank: HQ116626.1 به ثبت رسید. ژن مذکور در وکتورpET23a(+)کلون و سپس پلاسمید نوترکیب حاصل در سلول هایE. coliBL21 ترانسفر شد. . از سلول های ترانسفر شده ،پروتئین نوترکیب ال-آسپاراژیناز استخراج شد و پس از سنجش این پروتئین آنزیمی با تست های نسلریزاسیون و برادفورد، میزان فعالیت آنزیمی(IU) و پروتئین کلّی(mg) آن مشخص و با نمونۀ استاندارد مقایسه شد. همچنین از نظر تأثیر بر سلول های سرطانی HeLa و LCL ، با نوع استاندارد قیاس شد. نتایج نشان داد که فعالیت ویژه ال-آسپاراژیناز نوترکیب برابر باIU/mg 178 می باشد، در حالی که فعالیت ویژه ال-آسپاراژیناز استانداردIU/mgr 77 به دست آمد. همچنین، آنزیم نوترکیب علاوه بر آن که از نظر سکانس و قدرت آنزیمی با نوع استاندارد تفاوت نشان می دهد ، نسبت به آن به نحو موثرتری بر رده های سلولی سرطانی HeLa و LCL تاثیر می گذارد.

مقدمه:

با توجه به شیوع روز افزون انواع سرطان به عنوان یکی از مهمترین بیماری های تهدید کنندۀ سلامت انسان، دستیابی به روش های موثرتر در درمان سرطان به ویژه انتخاب ترکیبات دارویی با عوارض جانبی کمتر بیش از گذشته مورد توجه محققین قرار گرفته است.

آنزیم ال-آسپاراژیناز به صورت اختصاصی اسیدآمینه ال-آسپاراژین را به ال-آسپارتات و آمونیاک کاتالیز کرده و نقش مهمی را در متابولیسم همه ارگانیسم های زنده و نیز در داروشناسی بازی می کند(2). دو نوع ترکیب از ال-آسپاراژیناز وجود دارد : ال-آسپاراژیناز l، یک آنزیمconstitutive داخلی، و ال-آسپاراژیناز ll، یک آنزیم خارجی می باشد. این دو آنزیم از لحاظ بیوشیمیایی و ساختار ژنتیکی متفاوتند. ال-آسپاراژیناز ll به صورت گسترده در سلول هایپروکاریوتیو یوکاریوتی وجود دارد و بیش از پنج دهه مورد مطالعه فراوان قرار گرفته است(66). این آنزیم از منابع گوناگون مانند سلول های گیاهی و حیوانی، قارچ ها، مخمرها و باکتری ها جدا شده است(61).

ال-آسپاراژینازll یک عامل شیمی درمانی مهم می باشد که برای درمان نوعی از اختلالات لنفوپرولیفراتیو و لنفوما، به ویژه لوکمی لنفوبلاستیک حاد یا ALL[1] بکار برده می شود. این آنزیم بخش اصلی ترکیب پروتوکل های شیمی درمانی است که در درمان ALL اطفال به مدت تقریباً 30 سال استفاده می شود(6،5،4،3،2،1). بر این اساس، همچنین این آنزیم در جدیدترین رژیم های درمانی چند عاملی برای ALL بالغین قرار دارد(8،7). ال-آسپاراژیناز به عنوان یک دارو، اثربخشی خود را در درمان و مراحل بعدی استراتژی های مختلف شیمی درمانی اثبات کرده است. بزرگ ترین محدودیت استفاده از ال-آسپاراژیناز حساسیت شدید بالینی در دز اثر بخشی است، که در 78-3 درصد بیماران تحت درمان با فرم های اصلاح نشده آنزیم ظاهر می شود(11،10،9،3). با گذشت بیش از 10 سال به نظر می رسد پگ-ال-آسپاراژیناز به عنوان یک ترکیب جانشین برای ال-آسپاراژیناز ، مشکلات ناشی از انواع ترکیبات طبیعی را اصلاح کرده است(13،12). در این تحقیق سعی بر این شد تا با ایجاد جهش در باکتریKIAU E. coli، ارزیابی میزان تولید آنزیم ال-آسپاراژینازll در سویه جهش یافته، و دستیابی به ترتیب توالی جدید در ژن این آنزیم و کلون کردن آن، بتوان ال-آسپاراژینازی استخراج کرد که از نظر فعالیت ویژه و اختصاصیت در سطح بالاتری نسبت به نوع استاندارد قرار داشته باشد. همچنین با تاثیر این پروتئین آنزیمی بر رده سلولی سرطانی و ارزیابی فعالیت و درصد کشندگی آن بر این سلول ها، بتوان به آنزیم ال-آسپاراژیناز موثرتر، با کارایی بالا و عوارض جانبی کمتر دست یافت.

فصل اول: کلیات