1

1-1-2 تعریف صرع………………………………………………………………………………………………………………

2

1-1-3 اپیدمولوژی صرع…………………………………………………………………………………………………………

3

1-1-4 اتیولوژی صرع…………………………………………………………………………………………………………….

3

1-1-4-1 علل قبل از زایمان…………………………………………………………………………………………………

3

1-1-4-2 ضربه های مغزی………………………………………………………………………………………………….

4

1-1-4-3 علل عفونی و بیماریها…………………………………………………………………………………………….

4

1-1-4-4 علل متابولیکی……………………………………………………………………………………………………..

4

1-1-4-5 سکته های مغزی…………………………………………………………………………………………………

5

1-1-4-6 صرع و ژنتیک…………………………………………………………………………………………………….

5

1-1-5تشخیص بیماری……………………………………………………………………………………………………………

5

1-1-6 درمان صرع………………………………………………………………………………………………………………….

7

1-1-7 فیزیوپاتولوژی صرع……………………………………………………………………………………………………….

9

1-1-8 طبقه بندی صرع……………………………………………………………………………………………………………

12

1-1-8-1 اجزاء تشنج…………………………………………………………………………………………………………

12

1-1-8-2 طبقه بندی بین المللی صرع……………………………………………………………………………………..

12

1-1-8-2-1 تشنج های موضعی……………………………………………………………………………………..

12

1-1-8-2-2 تشنج های عمومی………………………………………………………………………………………

13

1-1-9 صرع لوب گیجگاهی………………………………………………………………………………………………………

16

1-1-10 نقش نئوکورتکس در مکانیسم صرع زایی……………………………………………………………………………..

16

1-1-11 نقش صرع زایی نواحی لیمبیک…………………………………………………………………………………………

18

1-2 مدل های ایجاد صرع تجربی در حیوانات………………………………………………………………………………………..

20

1-2-1 کیندلینگ…………………………………………………………………………………………………………………….

21

1-2-2 کیندلینگ شیمیایی…………………………………………………………………………………………………………

21

1-2-3 انواع کیندلینگ شیمیایی…………………………………………………………………………………………………..

22

1-2-3 -1 تزریق درون بطنی مواد تشنج زا………………………………………………………………………………….

22

1-2-3 -2 تزریق سیستمیک مواد تشنج زا…………………………………………………………………………………..

22

1-3 استرس………………………………………………………………………………………………………………………………..

23

1-3-1 مفهوم استرس………………………………………………………………………………………………………………

23

1-3-2 مراحل پاسخ دهی به استرس ……………………………………………………………………………………………

25

1-3-3 پیامد های استرس…………………………………………………………………………………………………………

26

1-3-4 نوروآناتومی و فیزیولوژی استرس ………………………………………………………………………………………

27

1-3-4-1 سیستم سمپاتیک(SAM) ………………………………………………………………………………………..

28

1-3-4-2 سیستم هیپوتالاموس- هیپوفیز- آدرنال(HPA) ………………………………………………………………

28

1-3-5 تجارب اولیه مطالعات حیوانی نوروبیولوژی استرس…………………………………………………………………

32

1-4 اثرات استرس بر صرع……………………………………………………………………………………………………………….

32

فصل دوم–روش تحقیق و مواد

34

1-2 نوع حیوان و نحوه تهیه: …………………………………………………………………………………………………………….

35

2-2 شرایط نگهداری موش ها : ………………………………………………………………………………………………………..

35

2-3 مواد و لوازم مورد نیاز : ……………………………………………………………………………………………………………

35

2-3-1 مواد شیمیایی: ………………………………………………………………………………………………………………

35

2-3-2 ابزار و وسایل ……………………………………………………………………………………………………………….

36

2-4 گروه های مورد آزمایش : ………………………………………………………………………………………………………….

36

2-4-1 گروه بندی ماده ها: ………………………………………………………………………………………………………

37

2-4-2 گروه های ماده و گروه بندی نوزادان نر : ………………………………………………………………………………

39

2-5 شاخص های مورد آزمایش: ……………………………………………………………………………………………………..

42

2-6 بررسی مراحل 6 گانه رفتار تشنجی ……………………………………………………………………………………………..

43

فصل سوم–نتایج تحقیقات

44

3-1 استرس جدایی از مادر، استعداد ابتلای به صرع و تشنج زایی را در فرزندان افزایش می دهد……………………………..

45

3-2 استرس در سنین جوانی مادر، استعداد ابتلای به صرع و تشتج زایی در فرزندان کاهش می دهد. ………………………

47

3-2-1 استرس قبل از بارداری مادران…………………………………………………………………………………………………………….

47

3-2-2 استرس حین بارداری مادران………………………………………………………………………………………………………………

47

3-2-3 استرس در بارداری دوم مادران…………………………………………………………………………………………………………..

50

3-3: ماندگاری استرس در مادر، شدت تشنج فرزندان را پس از رسیدن به سن بلوغ افزایش می دهد……………………………

51

فصل چهارم – بحث و نتیجه گیری

53

4-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..

54

4-2 الف) استرس در سنین جوانی مادر، استعداد ابتلای به صرع و تشنج زایی در فرزندان را پس از رسیدن به بلوغ، کاهش می دهد…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..

55

4-3 ب) ماندگاری استرس در مادر، شدت تشنج فرزندان را پس از رسیدن به سن بلوغ افزایش می دهد.…………………….

57

4-4 ج)استرس جدایی از مادر، استعداد ابتلای به صرع و تشنج زایی را در فرزندان افزایش می دهد……………………………..

58

5-4 نتیجه گیری کلی………………………………………………………………………………………………………………………………………….

61

پیشنهادات …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

62

منابع فارسی و انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………………………………….

63

چکیده انگلیسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………….

72

فهرست شکل ها

عنوان	صفحه
1-1 امواج EEGدر حملات تشنجی………………………………………………………………………………………………………………………	6
1-2 تخریب فیبر های رابط نیم کره های مغزی…………………………………………………………………………………………..	8
1-3 تحریک عصب واگ……………………………………………………………………………………………………………………………………..	9
1-4 مقایسه امواج EEGدر حالت طبیعی و تشنجات……………………………………………………………………………………………….	11
1-5 میسر انتشار تشنج در صرع موضعی و عمومی………………………………………………………………………………………………….	14
1-6 مراحل تونیک و کلونیک……………………………………………………………………………………………………………………………..	14
1-7 تشنج ساده………………………………………………………………………………………………………………………………………………….	15
1-8 طبقه بندی تشنج ها……………………………………………………………………………………………………………………………………..	16
1-9 محور HPA………………………………………………………………………………………………………………………………………………..	31
2-1 موش ماده و نوزادانش………………………………………………………………………………………………………………………………….	36
2-2 شنای اجباری موش……………………………………………………………………………………………………………………………………..	38
2-3 محدودیت حرکت موش(Restrain) ……………………………………………………………………………………………………………	38
2-4 علامت گذاری موش ها………………………………………………………………………………………………………………………………..	41
2-5 نوزادان نر ………………………………………………………………………………………………………………………………………………….	41
2-6 استرس جدایی از مادر نوزادان نر…………………………………………………………………………………………………………………..	40
2-7 بررسی و زمانگیری مراحل تشنج……………………………………………………………………………………………………………………	42
2-8 ثبت دقیق عمق و مراحل تشنج………………………………………………………………………………………………………………………	43
2-9 تزریق درون صفاقی (IP) …………………………………………………………………………………………………………………………….	43

فهرست نمودار ها و منحنی ها

ی نوشته‌ها

1-7-1 ………….. مشخصات کلی استرپتوکوک ها 10

1-7-1-1 ……… استرپتوکوک پیوژن. 11

1-7-1-1-1 ….. بیماری زایی.. 12

1-7-1-1-2 ….. تست های تشخیصی.. 12

1-7-1-1-3 ….. درمان. 13

1-7-1-2 ……… استرپتوکوک پنومونیه. 13

1-7-1-2-1 ….. تست های تشخیصی.. 14

1-7-1-2-2 ….. بیماری زایی.. 15

1-7-1-2-3 ….. درمان. 15

1-7-2 ………….. مشخصات کلی استافیلوکوک ها 16

1-7-2-1 ……… استافیلوکوک اورئوس… 16

1-7-2-1-1 ….. تست های تشخیصی.. 17

1-7-2-1-2 ….. بیماری زایی.. 18

1-7-2-1-3 ….. درمان. 18

1-7-3 ………….. مشخصات کلی پسودوموناس ها 19

1-7-3-1 ……… پسودوموناس آئروژینوزا 19

1-7-3-1-1 ….. تست های تشخیصی.. 21

1-7-3-1-2 ….. بیماری زایی.. 21

1-7-3-1-3 ….. درمان. 21

1-8 ………………. تاریخچه درمانی گیاهان دارویی.. 22

1-8-1 ………….. ویژگی های خاص تولید گیاهان دارویی.. 23

1-8-2 ………….. شکل های مصرف گیاهان دارویی.. 23

1-9 ………………. ویژگی های گیاهان دارویی مورد آزمایش…. 23

1-9-1 ………….. گیاه درمنه. 23

1-9-1-1 ……… ترکیبات شیمیایی و اسانس گیاه 24

1-9-1-2 ……… خواص درمانی.. 25

1-9-2 ………….. گیاه اسطو خودوس… 25

1-9-2-1 ……… ترکیبات شیمیایی و اسانس گیاه 26

1-9-2-2 ……… خواص درمانی.. 26

1-9-3 ………….. گیاه دارچین.. 26

1-9-3-1 ……… ترکیبات شیمیایی و اسانس گیاه 28

1-9-3-2 ……… خواص درمانی.. 29

1-9-4 ………….. گیاه مورد یا مورت… 29

1-9-4-1 ……… ترکیبات شیمیایی و اسانس گیاه 31

1-9-4-2 ……… خواص درمانی.. 32

1-10 ……………. اسانس های گیاهی.. 32

1-11 ……………. نانواسانس های گیاهی.. 33

1-11-1 ………… کیتوزان. 33

1-12 ……………. بررسی اثرات ضد میکروبی.. 35

1-13 ……………. تعیین MIC به روش میکرودایلوشن (ریز رقت) 35

1-13-1 ………… متغیر های مؤثر در انجام آزمون MIC.. 36

1-13-2 ………… تعیین MBC.. 36

1-13-3 ………… دیسک دیفیوژن. 36

1-13-3-1 ……. دینامیک تشکیل هاله. 37

1-13-3-2 ……. دیسک های آنتی بیوتیک… 37

1-13-4 ………… انتشار در آگار (چاهک) 37

1-14 ……………. روش های تهیه سوسپانسیون. 38

1-15 ……………. بیان مسئله. 38

1-16 ……………. ضرورت اهمیت موضوع. 39

1-17 ……………. اهداف تحقیق.. 40

1-17-1 ………… هدف کلی.. 40

1-17-2 ………… هدف اختصاصی.. 40

1-18 ……………. فرضیات تحقیق.. 40

1-19 ……………. سوالات تحقیق.. 40

2-1 ………………. سوابق تحقیق در ایران و سایر کشور ها در زمینه استفاده از اسانس ها و نانواسانس های گیاهی 43

3-1 ………………. دستگاه های مورد نیاز. 48

3-2 ………………. مواد و وسایل مورد نیاز. 48

3-2-1 ………….. سوش های میکروبی مورد مطالعه. 50

3-2-2 ………….. اسانس های مورد مطالعه. 50

3-3 ………………. روش کار. 51

3-3-1 ………….. روش تهیه نانواسانس های درمنه، اسطوخودوس، مورد و دارچین.. 51

3-3-1-1 ……… تهیه محلول کیتوزان. 51

3-3-2 ………….. روش تهیه محیط کشت اولیه برای رشد. 53

3-3-2-1 ……… محیط BHI 53

3-3-2-2 ……… محیط MHA.. 53

3-3-2-3 ……… محیط BA.. 53

3-3-3 ………….. فعال کردن باکتری ها و انتقال آن ها به محیط کشت… 54

3-3-4 ………….. روش تهیه محلول سوسپانسیون میکروبی.. 54

3-3-5 ………….. روش ساخت کدورت های استاندارد مک فارلند. 54

3-3-6 ………….. تعیین MIC با روش میکرودایلوشن.. 55

3-3-6-1 ……… روش علمی تعیین MIC.. 55

3-3-7 ………….. تعیین حداقل غلظت کشندگی باکتری یا MBC.. 57

3-3-8 ………….. روش انتشار در آگار (دیسک کاغذی) 57

3-3-8-1 ……… دیسک های آنتی بیوتیک مورد آزمایش (شاهد مثبت) 58

3-3-9 ………….. روش انتشار در آگار (چاهک) 58

4-1 ………………. شرح مختصری از مطالعه. 61

4-2 ………………. نتایج FTIR ترکیبات نانواسانس ها 61

4-3 ………………. نتایج حاصل از پراکندگی نور دینامیکی برای مطالعه اندازه نانوذرات… 63

4-4 ………………. نتایج microscope Scanning electron مربوط به اسانس های نانوکپسول شده 64

4-5 ………………. نتایج microscope Transmission electronمربوط به اسانس های نانو کپسول شده 65

4-6 ………………. نتایج آزمون تعیین حساسیت… 66

4-6-1-1 ……… نتایج MIC نانواسانس ها 68

4-6-1-2 ……… نتایج MIC اسانس ها 68

4-6-1-3 ……… نتایج MBC اسانس ها و نانواسانس ها 69

4-6-2 ………….. نتایج اثرات ضد میکروبی نانواسانس ها به روش انتشار دیسک و مقایسه با چند آنتی بیوتیک رایج 75

4-6-3 ………….. نتایج آزمایش انتشار در آگار(چاهک) 78

5-1 ………………. بحث.. 83

5-2 ………………. نتیجه گیری.. 89

5-3 ………………. پیشنهادات.. 89

. .. 90

چکیده لاتین..95

فهرست جداول

جدول 3-1 روش تهیه استاندارد لوله های مک فارلند. 55

جدول 4-1 نتایج آزمایش MIC و MBC نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد. 67

جدول 4-2 نتایج آزمایش MIC و MBC اسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد، دارچین بر حسب میکروگرم
بر میلی لیتر μg⁄ml 68

جدول 4-3 قطر هاله عدم رشد سویه های میکروبی مورد آزمایش در برابر تعدادی از دیسک های آنتی بیوتیکی متداول در آزمایش دیسک دیفیوژن 77

فهرست نمودارها

نمودار 4-1 نمودارحداقل غلظت بازدارندگی (MIC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استرپتوکوک پنومونیه. 71

نمودار 4-2 نمودار حداقل غلظت کشندگی ( MBC ) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استرپتوکوک پنومونیه. 71

نمودار 4-3 نمودارحداقل غلظت بازدارندگی (MIC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استرپتوکوک پیوژن. 72

نمودار 4-4 نمودارحداقل غلظت کشندگی (MBC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استرپتوکوک پیوژن. 72

نمودار 4-5 نمودارحداقل غلظت بازدارندگی (MIC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استافیلوکوک اورئوس… 73

نمودار 4-6 نمودارحداقل غلظت کشندگی (MBC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استافیلوکوک اورئوس… 73

نمودار 4-7 نمودارحداقل غلظت بازدارندگی (MIC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر پسودوموناس آئروژینوزا 74

نمودار 4-8 نمودارحداقل غلظت کشندگی (MBC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر پسودوموناس آئروژینوزا 74

فهرست شکل ها

شکل 1-1 سینوس های پارانازال اطراف بینی و صورت… 3

شکل 1-2 استرپتوکوک پیوژن رشد یافته در کشت خون. 11

شکل 1-3 رنگ آمیزی گرم از خلط که در آن استرپتوکوک پنومونیه. 13

شکل 1-4 رنگ آمیزی گرم استافیلوکوک اورئوس… 17

شکل 1-5 رنگ آمیزی گرم پسودوموناس آئروژینوزا 20

شکل 1-6 گیاه درمنه. 24

شکل 1-7 گیاه اسطوخودوس… 25

شکل 1-8 گیاه دارچین.. 28

شکل 1-9 چوب و پودر دارچین.. 28

شکل 1-10 گیاه مورد. 31

شکل 1-11 ساختار شیمیایی پلیمر کیتوزان. 34

شکل 1-12 ساختار مولکولی کیتین.. 35

شکل 3-1 اسانس های تهیه شده از شرکت باریج اسانس کاشان. 51

شکل 3-2 دستگاه اولترا سونی کیت در مرکز ژنتیک… 52

شکل 4-1 نتایج طیف سنجی مادون قرمز حاصل از ترکیب بیوپلی ساکاریدی کیتوزان. 62

شکل 4-2 نتایج طیف سنجی مادون قرمز حاصل از ترکیب اسید میرستیک… 62

شکل 4-3 نتایج حاصل از طیف سنجی مادون قرمز دو ترکیب کیتوزان و اسید میرستیک در کنار هم. 63

شکل 4-4 توزیع اندازه نانوذرات ترکیبات اسانس نانوکپسول شده با استفاده از دستگاه DLS. 64

شکل 4-5 تصویر ساختار نانوکپسول های کیتوزان حاوی اسانس توسط میکروسکوپ الکترونی.. 65

شکل 4-6 تصویر ساختار نانوکپسول کیتوزان حاوی اسانس توسط میکروسکوپ الکترونی.. 65

شکل 4-7 میکروپلیت بعد از انجام آزمایش MIC.. 66

شکل 4-8 میکروپلیت بعد از انجام آزمایش MIC.. 67

شکل 4-9 پلیت کشت داده شده مربوط به تأثیر نانواسانس اسطوخودوس بر روی استرپتوکوک پیوژن بعد از آزمایش MIC بر روی محیط کشت بلاد آگار برای تعیین MBC.. 69

شکل 4-10 پلیت کشت داده شده مربوط به تأثیر نانواسانس دارچین بر روی استرپتوکوک پنومونیه بعد از آزمایش MIC بر روی محیط کشت بلاد آگار برای تعیین MBC.. 69

شکل 4-11 پلیت های کشت شده مربوط به تأثیر اسانس اسطوخودوس بر روی استافیلوکوک اورئوس بر روی محیط آگار برای تعیین MBC.. 70

شکل 4-12 پلیت های کشت داده شده مربوط به تأثیر اسانس مورد بر روی پسودوموناس آئروژینوزا بر روی محیط آگار برای تعیین MBC، رقت شماره 3 رقت MIC.. 70

شکل 4-13 پلیت های تلقیح شده با باکتری پسودوموناس آئروژینوزا حاوی دیسک های کاغذی آغشته به غلظت های مختلف نانواسانس اسطوخودوس… 76

شکل 4-14 پلیت های تلقیح شده با باکتری استافیلوکوک اورئوس حاوی دیسک های کاغذی آغشته با غلظت های مختلف نانواسانس دارچین.. 76

شکل 4-15 پلیت تلقیح شده با باکتری استافیلوکوک اورئوس حاوی دیسک های آنتی بیوتیکی.. 77

شکل 4-16 پلیت تلقیح شده با پسودوموناس آئروژینوزا حاوی دیسک های آنتی بیوتیکی.. 78

شکل 4-17 پلیت تلقیح شده با باکتری استرپتوکوک پیوژن حاوی دیسک های آنتی بیوتیکی.. 78

شکل 4-18 پلیت تلقیح شده با استافیلوکوک اورئوس. قطر هاله عدم رشد در اطراف چاهک ها به خوبی قابل مشاهده است 79

شکل 4-19 پلیت تلقیح شده با پسودوموناس آئروژینوزا. قطر هاله عدم رشد در اطراف چاهک ها به خوبی قابل مشاهده است 80

۱-۱۹ فاکتور رشد رگ زایی.. 20

۱-۲۰ فاکتور رشد اپیدرمی.. 21

۱-۲۱ فاکتور رشد مشتق از پلاکت.. 22

۱-۲۲ فاکتور رشد تراریختی.. 24

۱-۲۳ اهداف طرح: 26

27

۲-۱ مواد، وسایل و دستگاه های موردنیاز برای آزمایش ها به شرح زیر است: 28

۲-۲ کشت و پاساژ رده سلول هایفیبروبلاستانسانی.. 30

۲-۲-۱ رده سلولی موردمطالعه. 30

۲-۲-۲ آماده سازی محیط کشت سلولی.. 30

۲-۲-۳ پاساژ سلولی.. 31

۲-۲-۴ شمارش سلولی.. 32

۲-۲-۵ انجماد و ذخیره سازی سلول ها 33

۲-۲-۶ ذوب کردن سلول های منجمد شده. 33

۲-۲-۷ تهیه فرآورده عصاره پلاکتی مشتق از خون بند ناف.. 34

۲-۳ بررسی اثر عصاره پلاکتی بر تکثیر (فیبروبلاست) 35

۲-۴ بررسی اثر فرآورده عصاره پلاکتی بر درصد بقاء سلول های فیبروبلاست.. 36

۲-۵ اندازه گیری میزان مهاجرت سلولی به روش assay Scratch. 36

۲-۶ فرمول بکار رفته در تست خراشیدگی.. 37

۲-۷ بررسی بیان ژن. 37

۲-۷-۱ مراحل استخراج RNA.. 38

۲-۷-۲ تیمار RNA با DNAaseІ. 40

۲-۷-۳ تعیین جذب نوری و غلظت نمونه های RNA.. 40

۲-۷-۴ الکتروفورز، رنگ آمیزی و مشاهده RNA بر روی ژل آگارز. 40

۲-۷-۵ سنتز cDNA.. 42

۲-۷-۶ واکنش زنجیره ای پلیمراز 43

۲-۷-7 پرایمر. 43

۲-۷-8 نحوه رقیق کردن پرایمر. 43

۲-۷-9 Real time PCR. 44

۲-۸ جمع آوری عصاره سلولی.. 46

۲-۸-۱ تعیین غلظت پروتئین ها به روش بردفورد. 46

۲-۸-۲ انجام تست وسترن بلات به منظور بررسی تغییرات سطح پروتئین های psmad2/3, smad2/3 در مسیر smad signaling 47

۲-۸-۳ مرحله الکتروفوز. 48

۲-۸-۴ مرحله ساندویچ. 48

۲-۸-۵ مرحله Blocking و افزودن آنتی بادی ها: 49

۲-۸-۶ مرحله Stripping. 50

۲-۸-۷ مرحله ظهور فیلم. 51

۲-۹ آنالیزهای آماری.. 51

.. 53

۳-۱ بررسی اثر غلظت های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون بند ناف بر تکثیر سلول های فیبروبلاست.. 54

۳-۲ بررسی اثر غلظت های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون بند ناف بر درصد بقاء سلول های فیبروبلاست.. 56

۳-۳ نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون بند ناف بر مهاجرت سلول های فیبروبلاست 57

۳-۴ نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت های مختلف لایزت پلاکتی مشتق از خون بند ناف بر بیان ژن های Smad2 و Smad3 درسلول های فیبروبلاست تیمار شده. 62

۳-۴-۱ کیفیت RNA استخراج شده. 62

۳-۵ بررسی میزان بیان پروتئین های Smad2- P Smad3 Smad3 P Smad2 توسط وسترن بلات.. 68

.. 72

4-1 بحث.. 73

4-2 نتیجه گیری.. 79

۴-3 پیشنهاد ها 80

. 81

منابع انگلیسی.. 82

فهرست جداول

جدول 1- 1: لیست کامل از فاکتورهای رشد در پلاکت (22) 9

جدول 1- 2: لیستی از محتویات α گرانول های پلاکتی (۲۲) 11

جدول 2- 1: تجهیزات مورداستفاده. 28

جدول 2- 2: مواد مصرفی جهت آزمایشات سلولی.. 29

جدول 2- 3: مواد و وسایل موردنیاز برای بررسی بیان ژن. 29

جدول 2- 4: مواد و وسایل موردنیاز برای تکنیک وسترن بلات.. 30

جدول 2- 5: توالی پرایمر. 43

فهرست اشکال

شکل 1- 1: مرحله التهاب در فرایند ترمیم زخم (۱۴) 5

شکل1- 2: مرحله شکل گیری بافت در فرایند ترمیم زخم (14) 6

شکل 1- 3: اتصالات دو پلاکت در ایجاد لخته پلاکتی (22) 10

شکل 1- 4: ارتباط مسیر سیگنالینگ smad2/3 با فرایند ترمیم زخم. 26

شکل 2- 1: کشت سلول در پلیت ۶ خانه. 36

شکل 2- 2: نحوه کشیدن خراش در تکنیک assay Scratch. 37

شکل 2- 3: ۳ فاز تشکیل شده در استخراج RNA.. 38

شکل 2- 4: نمای کلی از استخراج RNA.. 39

شکل 2- 5: RNA استخراج شده بر روی ژل اگاروز. 41

شکل 2- 6: ساختار شیمیایی سایبر گرین.. 44

شکل 2- 7: مکانیسم عمل سایبر گرین.. 45

شکل 2- 8: مرحله تهیه ساندویچ. 49

شکل 2- 9: مرحله Blocking و افزودن آنتی بادی ها 50

شکل 3- 1: بررسی افزایش تکثیر در غلظت های متفاوت عصاره پلاکتی مشتق از خون بند ناف در مقایسه با گروه های کنترل در ۲۴ ساعت 55

. 55

شکل 3- 3: نمودار مربوط به تأثیر غلظت های متفاوت UCB-PL بر درصد بقا فیبروبلاست در این شکل علامت* به معنی تفاوت معنی دار گروه با غلظت ۱۰% در مقایسه با همه گروه های دیگر به جز گروه POS و ۱۵%-۸% است. 57

. 58

شکل 3- 5: سنجش اثر UCB-PL ۸% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 58

شکل 3- 6: سنجش اثر UCB-PL ۱۰% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 59

شکل 3- 7: سنجش اثر UCB-PL/FBS بر میزان مهاجرت سلولی در سلول های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 60

شکل 3- 8: سنجش اثر FBS۱۰% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 61

شکل 3- 9: سنجش اثر گروه کنترل منفی بر میزان مهاجرت سلولی در سلول های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 62

شکل 3- 10: کیفیت RNA استخراج شده در گروه های مختلف.. 63

شکل 3- 11: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن GAPDH.. 64

شکل 3- 12: نمودار Amplification Plot حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن GAPDH.. 64

شکل 3- 13: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad۲. 65

شکل 3- 14: نمودار Amplification Plot حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad2. 65

شکل 3- 15: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad2. 66

شکل 3- 16: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad3. 66

شکل 3- 17: مطالعه اثر گروهای مختلف UCB-PL بر میزان بیان Smad2 در سلول های فیبروبلاست تیمار شده به روش Real time-PCR 67

شکل 3- 18: مطالعه اثر گروهای مختلف UCB-PL بر میزان بیان Smad3 در سلول های فیبروبلاست تیمار شده به روش Real time-PCR 68

شکل 3- 19: رنگ آمیزی ژل حاوی پروتئین ها 69

شکل 3- 20: وسترن بلات برای پروتئین Smad2. 70

شکل 3- 21: وسترن بلات برای پروتئین P Smad2. 70

شکل 3- 22: وسترن بلات برای پروتئین Smad3. 70

شکل 3- 23: وسترن بلات برای پروتئین p-Smad3. 71

چکیده

هدف:

بیوتیکها……………………………………………………………………………. 25

1-9-1)اکتینومایستها…………………………………………………………………………………………………………….. 26

1-9-1-1) باکتریSaccharopolyspora erythraea ……………………………………………………………. 30

1-10)تقسیم بندی آنتی بیوتیک ها ……………………………………………………………………………………………. 31

1-10-1) طبقه بندی بر مبنای شباهت عمومی ساختار شیمیایی…………………………………………………… 31

1-10-1-1)ماکرولیدها ………………………………………………………………………………………………………… 33

1-10-2) طبقه بندی بر اساس مکانیسم عمل……………………………………………………………………………. 35

1-10-3)آنتی بیوتیک های بازدارنده سنتز پروتئین………………………………………………………………………..35

1-11)عوامل تعیین کننده حساسیت و مقاومت میکروارگانیسم ها به آنتی بیوتیک ها………………………… 36

1-12)انتخاب آنتی بیوتیک ها……………………………………………………………………………………………………. 37

1-13)موارد کاربرد آنتی بیوتیک ها……………………………………………………………………………………………. 38

1-14)اریترومایسین………………………………………………………………………………………………………………. 38

1-14-1)تاریخچه و منبع………………………………………………………………………………………………………. 38

1-14-2)ساختمان و ویژگی های اریترومایسین…………………………………………………………………………. 40

1-14-3)آنتی بیوتیک های مشتق شده از اریترومایسین…………………………………………………………………. 42

1-14-4)فعالیت ضد باکتریایی اریترومایسین…………………………………………………………………………….. 43

1-14-5)مکانیسم عمل اریترومایسین……………………………………………………………………………………… 44

1-14-6)کاربردهای اریترومایسین و مشتقات آن………………………………………………………………………. 45

1-14-7)موارد منع مصرف اریترومایسین………………………………………………………………………………… 48

1-14-8)عوارض جانبی اریترومایسین……………………………………………………………………………………. 48

1-14-9) انواع در دسترس……………………………………………………………………………………………………. 49

1-15)میکروارگانیسم های صنعتی………………………………………………………………………………………….. 49

1-16)جداسازی و نگهداری میکروارگانیسم ها…………………………………………………………………………. 50

1-17)جداسازی میکروارگانیسم های مناسب از محیط……………………………………………………………….. 51

1-18)کلکسیون های کشت…………………………………………………………………………………………………….. 52

1-19)نگهداری میکروارگانیسم ها…………………………………………………………………………………………… 53

1-19-1)نگهداری در دمای پایین…………………………………………………………………………………………… 53

1-19-1-1) نگهداری روی محیط کشت شیب دار حاوی آگار…………………………………………………….. 53

1-19-1-2)نگهداری با استفاده از روش ژرف انجمادی……………………………………………………………. 54

1-19-1-3)نگهداری در نیتروژن مایع…………………………………………………………………………………….. 55

1-19-2)نگهداری در حالت بدون آب……………………………………………………………………………………. 55

1-19-2-1)نگهداری در خاک……………………………………………………………………………………………….. 56

1-19-2-2)نگهداری در سیلیکاژل…………………………………………………………………………………………. 56

1-19-2-3)نگهداری در سلولز……………………………………………………………………………………………… 57

1-19-2-4)نگهداری در آب مقطر…………………………………………………………………………………………. 57

1-19-2-5)نگهداری در روغن……………………………………………………………………………………………… 57

1-19-2-6) لیوفیلیزه کردن…………………………………………………………………………………………………… 58

1-20) محیط کشت تخمیر صنعتی…………………………………………………………………………………………. 59

1-21) نیازهای غذایی میکروارگانیسم ها………………………………………………………………………………….. 61

1-21-1) کربن……………………………………………………………………………………………………………………. 62

1-21-1-1) عوامل موثر بر انتخاب منبع کربن…………………………………………………………………………. 62

1-21-2) نیتروژن ……………………………………………………………………………………………………………. 63

1-21-3) هیدروژن و اکسیژن………………………………………………………………………………………………… 65

1-21-4) مواد معدنی…………………………………………………………………………………………………………… 65

1-22) تنظیم کننده های متابولیکی…………………………………………………………………………………………… .66

1-23) ضد کف ها………………………………………………………………………………………………………………… 66

1-24) طراحی و فرمول بندی محیط کشت………………………………………………………………………………. 67

1-25) فرایند تخمیر تولید آنتی بیوتیک …………………………………………………………………………………….68

1-25-1) مراحل کلیدی فرایند تولید یک نوع آنتی بیوتیک …………………………………………………………68

1-25-2) بخش های اصلی فرآیند تخمیری……………………………………………………………………………… 68

1-25-3) تهیه مایع تلقیح و فرایند توسعه آن…………………………………………………………………………… 74

1-25-4) مرحله بذر (Seeding )………………………………………………………………………………………….. 77

1-25-5) مرحله نهایی (مرحله تولید)…………………………………………………………………………………….. 79

1-25-6) تکنولوژی تخمیر آنتی بیوتیک………………………………………………………………………………….. 82

1-25-6-1) تخمیر شیک فلاسک………………………………………………………………………………………….. 82

1-25-6-2) فرمانتورهای همزندار…………………………………………………………………………………………. 83

1-25-7) تاثیر دما بر فرایند تخمیر آنتی بیوتیک………………………………………………………………………… 84

1-25-7-1) انتقال حرارت و کنترل دما………………………………………………………………………………….. 86

1-25-8) تاثیر pH روی متابولیسم سلول………………………………………………………………………………….87

1-25-9) مرحله شناسایی و استخراج محصول………………………………………………………………………… 89

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

پیشینه پژوهش……………………………………………………………………………………………………………………… 91

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1) میکروارگانیسم مورد استفاده………………………………………………………………………………………….. 97

3-2) معرف های رنگی مورد استفاده ……………………………………………………………………………………… 97

3-3) مواد لازم برای سنجش غلظت اریترومایسین……………………………………………………………………. 97

3-3-1) تهیه بافر pH 9.6…………………………………………………………………………………………………….. 97

3-3-2) تهیه بافر pH 4.2…………………………………………………………………………………………………….. 98

3-3-3) تهیه کلرفرم اشباع از بافر pH 9.6 و بافر pH 9.6اشباع از کلرفرم…………………………………. 98

3-3-4) تهیه محلول برمو فنل بلو…………………………………………………………………………………………… 99

3-4) محیطهای کشت اسپوریزاسیون……………………………………………………………………………………… 100

3-4-1) محیط اسپورزایی…………………………………………………………………………………………………….. 100

3-4-1-1) باز کردن آمپول لیوفیلیزه………………………………………………………………………………………. 103

3-4-2) آزمایش ها با محیط کشت صنعتی برای تولید اریتروماسین……………………………………………..103

3-4-2-1) مرحله بذر دهی (Seeding)………………………………………………………………………………….. 103

3-4-2-1-1)تعیین pH هر کدام از ارلن ها…………………………………………………………………………….. 105

3-4-2-1-2) تعیین وزن تر بیومس (PMW )……………………………………………………………………….. 105

3-4-2-1-3)بررسی محیط های کشت از لحاظ آلودگی ( Contamination test )……………………… 106

3-4-2-2) مرحله تخمیر……………………………………………………………………………………………………….108

3-5) میزان اوره اضافه شده به محیط کشت تخمیر……………………………………………………………………109

3-5-1) اوره………………………………………………………………………………………………………………………..109

3-6) تجهیزات مورد استفاده در آزمایش ها …………………………………………………………………………….113

3-7) روش تهیه سوسپانسیون اسپوری…………………………………………………………………………………….113

3-8) روش سنجش غلظت اریترومایسین در نمونه های تخمیری………………………………………………..114

3-8-1) روش HPLC……………………………………………………………………………………………………………114

3-8-1-1) مقدمه ای بر کروماتوگرافی…………………………………………………………………………………….114

3-8-1-2) فاز ساکن و فاز متحرک…………………………………………………………………………………………118

3-8-1-3) اطلاعات حاصل از یک کروماتوگرام……………………………………………………………………….119

3-8-1-4) کاربردهای کیفی…………………………………………………………………………………………………..120

3-8-1-5) آنالیز کمی……………………………………………………………………………………………………………120

3-8-1-5-1) روش استاندارد خارجی(External Standard)……………………………………………………..120

3-8-1-5-2) روش افزایش استاندارد (Standard Addition)………………………………………………….. 121

3-8-1-5-3) استاندارد داخلی(Internal Standard)…………………………………………………………………121

3-8-1-6) نتیجه گیری………………………………………………………………………………………………………….122

3-8-2) روش TLC (Thin Layer Chromatography )…………………………………………………………..122

3-8-2-1) سیر تحولی و رشد……………………………………………………………………………………………….122

3-8-2-2) کوماتوگرافی لایه نازک (TLC )…………………………………………………………………………….123

3-8-2-3) کاربرد کروماتوگرافی لایه نازک……………………………………………………………………………..125

33-8-3) روش Spectrophotometric……………………………………………………………………………………126

3-8-3-1) با اسپکتروفوومتر آشنا شویم…………………………………………………………………………………..127

3-8-3-2) قانون بیر- لامبرت………………………………………………………………………………………………..128

3-8-3-3) استفاده از اسپکتروفوتومتر……………………………………………………………………………………..128

3-8-4) روش Bioassay………………………………………………………………………………………………………129

3-8-4-1) سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین…………………………………………………………………….131

3-8-4-2) محیط کشت پایه سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین……………………………………………131

3-8-4-2-1) محیط کشت مولر هینتون آگار……………………………………………………………………………132

3-8-4-2-2) محیط کشت مولر هینتون براث………………………………………………………………………….132

3-8-4-3) تهیه مایه تلقیح…………………………………………………………………………………………………….133

3-8-4-4) ایجاد چاهک……………………………………………………………………………………………………….134

3-8-4-5) تهیه بافر فسفات با 8 = pH……………………………………………………………………………………134

3-8-4-6) تهیه محلول های استاندارد…………………………………………………………………………………….134

3-8-4-7) افزودن محلول های آنتی بیوتیک در پلیت ها…………………………………………………………..135

3-8-4-8) اندازه گیری قطر هاله مهار شده……………………………………………………………………………..135

3-8-4-9) حذف و جایگزینی داده های گمراه کننده……………………………………………………………….136

3-8-4-10) رسم منحنی استاندارد…………………………………………………………………………………………136

3-8-5) استخراج اریترومایسین……………………………………………………………………………………………..137

3-8-5-1)تهیه محلول های استاندارد اریترومایسین………………………………………………………………….137

3-8-5-2) تهیه رقت های مایع تخمیر……………………………………………………………………………………139

3-8-5-3) استخراج اریترومایسین از مایع تخمیر……………………………………………………………………..139

3-8-5-4) تشکیل کمپلکس رنگی اریترومایسین با برموفنل بلو…………………………………………………..140

3-8-5-5) اندازه گیری میزان جذب کمپلکس رنگی اریترومایسین- برموفنل بلو……………………………140

فصل چهارم: نتایج

4-1 ) بررسی اثر غلظت30 گرم درلیتر آرد سویا برروی پارامترهای مورد نظر در طی تخمیر……………..142

4-1-1 ) بررسی اثرغلظت30 گرم در لیترآرد سویا برروی pH محیط کشت تخمیر……………………….143

4-1-2 ) بررسی اثرغلظت30 گرم درلیترآردسویا برروی درصد وزن تر بیومس درمحیط تخمیر………….143

4-1-3 ) بررسی اثرغلظت30 گرم در لیترآرد سویا در میزان تولید اریترومایسین……………………………144

4-1-4)بررسی اثرغلظت30گرم درلیترآردسویابرروی مورفولوژی باکتریerythraea.S……………………..145

4-2)سنجش ومقایسه همزمان پارامترهای مورد بررسی درتمام غلظت ها درطی فرایند تخمیر……………148

4-2-1 ) سنجش و مقایسه pH در حالت های مختلف………………………………………………………………148

4-2-2 )سنجش و مقایسه درصد وزن تر بیومس تولید شده در حالت های مختلف……………………….149

4-2-3 )سنجش و مقایسه میزان اریترومایسین تولید شده در حالت های مختلف ………………………….150

4-2-4 ) تعیین غلظت بهینه اوره و سویا برای محیط کشت تولید اریترومایسین……………………………151

4-2-4-1)بررسی پارامترهای مختلف برای غلظت بهینه(40% اوره) در تولید اریترومایسین…………….151

4-2-4-1-1) بررسی اثر غلظت بهینه (40% اوره) در میزان تولید اریترومایسین………………………….. 151

4-2-4-1-2 ) بررسی اثر غلظت بهینه (40% اوره) بر روی pH محیط کشت ………………………………152

4-2-4-1-3 ) بررسی اثر غلظت بهینه (40% اوره) بر روی درصد وزن تر بیومس…………………………153

4-2-4-1-4 ) بررسی اثر غلظت بهینه (40% اوره) بر روی مورفولوژی باکتری…………………………….153

فصل پنجم: بحث و پیشنهادها

تاثیر ترکیبات به کار رفته در محیط کشت تخمیر در تولید آنتی بیوتیک ها…………………………………….158

5-1) رابطه بین منابع نیتروژنی استفاده شده در محیط کشت تخمیر و تولید اریترومایسین………………159

5-1-1) مقایسه اثر غلظت های مختلف اوره و سویا به عنوان منبع نیتروژنی بر تولید اریترومایسین…160

5-2) رابطه بین منبع نیتروژنی استفاده شده و pH محیط کشت تخمیر…………………………………………162

5-3) رابطه بین رشد باکتریSaccharopolysporaerythraeaو میزان تولید اریترومایسین………..163

5-4) رابطه بین میزان رشد باکتریSaccharopolysporaerythraeaوتغییرات بیومس درطی فرایند تخمیر………………………………………………………………………………………………………………………………….165

5-4-1) سینتیک رشد میکروارگانیسم ها………………………………………………………………………………….165

5-5)رابطه بین مورفولوژی سویهSaccharopolysporaerythraeaو تولید اریترومایسین…………….169

5-6) برآورد هزینه ها…………………………………………………………………………………………………………….171

5-6-1) محاسبه میزان اریترومایسین تولیدی و قیمت تمام شده منبع نیتروژنی سویا دریک bach صنعتی……………………………………………………………………………………………………………………………….172

5-6-1-1) استفاده از 30 گرم در لیتر کنجاله سویا در محیط تخمیر…………………………………………….172

5-6-1-2) استفاده از غلظت بهینه 40% اوره در محیط تخمیر…………………………………………………….173

5-7) پیشنهادها…………………………………………………………………………………………………………………….175

منابع و مراجع……………………………………………………………………………………………………………………..177

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………. 184

ضمایم………………………………………………………………………………………………………………………………..185

عنوان فهرست جداول صفحه

جدول (1-1): راهنمای دوزاژ ماکرولیدهای خوراکی…………………………………………………………………..33

جدول (1-2): ویژگی های اریترومایسین…………………………………………………………………………………..40

جدول(1-3): نقش فیزیولوژیکی عناصر غذایی پرمقدار درون سلول و میزان متوسط مورد نیاز………….61

جدول(1-4 ): مهمترین منابع نیتروژن برای تولید تعدادی از متابولیت های ثانویه……………………………65

جدول(1-5): مراحل کلیدی فرایند تولید یک نوع آنتی بیوتیک…………………………………………………….72

جدول (1-6): محدوده بهینه دما برای گروه های باکتریایی………………………………………………………….85

جدول (3-1) : ترکیبات محیط کشت اسپورزایی……………………………………………………………………….101

جدول(3 -2): ترکیبات محلول میکروالمنت …………………………………………………………………………..101

جدول (3-3): ترکیبات محیط کشت بذردهی ………………………………………………………………………….104

جدول (3-4): محیط کشت مرحله تخمیر………………………………………………………………………………..108

جدول(3-5): خصوصیات اوره……………………………………………………………………………………………….111

جدول(3-6): آنالیز اوره…………………………………………………………………………………………………………112

جدول(3-7): غلظت های اریترومایسین در حجم های استاندارد اریترومایسین و حجم های مورد نیاز برای

تهیه آن ها……………………………………………………………………………………………………………………………..139

جدول ( 4-1 ) : غلظت های مختلف اوره و سویا استفاده شده در حالت های مختلف………………………148

عنوان فهرست نمودارها صفحه

نمودار ( 4-1): تغییرات pH در طی فرایندتولید اریترومایسین در محیط کشت حاوی 30 گرم در لیتر آرد سویا…………………………………………………………………………………………………………………………………….143

نمودار(4-2): تغییرات درصد وزن تر بیومس در طی فرایند تخمیر در محیط حاوی 30گرم در لیتر آرد سویا…………………………………………………………………………………………………………………………………….143

نمودار( 4-3) : میزان اریترومایسین تولید شده در روزهای مختلف تخمیر در غلظت 30 گرم در لیتر آرد سویا…………………………………………………………………………………………………………………………………….144

نمودار(4-4): تغییرات pH محیط کشت در طی فرایند تخمیر در غلظت های مختلف……………………..149

نمودار(4-5): درصد وزن تر بیومس تولید شده در غلظت های مختلف طی فرایند تخمیر………………149

نمودار(4-6) : میزان اریترومایسین تولید شده در غلظت های مختلف طی فرایند تخمیر…………………150

نمودار(4-7): میزان اریترومایسین تولید شده را در حضور 40% درطی فرایند تخمیر………………………151

نمودار(4-8): تغییرات pH در حضور 40% اوره درطی فرایند تخمیر…………………………………………..152

نمودار(4-9): درصد وزن تر بیومس در طی فرایند تخمیر در غلظت 40% اوره………………………………153

عنوان فهرست اشکال صفحه

شکل (3-1): روش تهیه کلروفرم اشباع از بافر و بافر اشباع از کلروفرم………………………………………….99

شکل (3-2): محیط اسپورزایی در روز چهارم انکوباسیون………………………………………………………….102

شکل (3-3): محیط اسپورزایی در روز چهاردهم انکوباسیون………………………………………………………102

شکل (3-4): فرمول شیمیایی و عکسی از اوره………………………………………………………………………….110

شکل (3-5): روش تهیه سوسپانسیون اسپوری………………………………………………………………………….113

شکل ( 3-6): نمونه ای از سرسمپلر فیلتردار…………………………………………………………………………….113

شکل (3-7): نمایی از دستگاه HPLC……………………………………………………………………………………..119

شکل (3-8): نمونه ای از یک کروماتوگرام………………………………………………………………………………119

شکل (3-9): نمایی از روش TLC………………………………………………………………………………………….125

شکل (4-1): مورفولوژی میسلیوم ها در روز چهارم تخمیر………………………………………………………..145

شکل (4-2): مورفولوژی میسلیوم ها در روز ششم تخمیر………………………………………………………….146

شکل (4-3): مورفولوژی میسلیوم ها در روز هشتم تخمیر…………………………………………………………146

شکل (4-4): مورفولوژی میسلیوم ها در روز دهم تخمیر……………………………………………………………147

شکل (4-5): مورفولوژی میسلیوم ها در روز یازدهم تخمیر……………………………………………………….147

شکل(4-6): مورفولوژی میسلوم هایSaccharopolysporaerythraeaدر روز چهارم تخمیر در

غلظت 40% اوره……………………………………………………………………………………………………………………154

شکل(4-7): مورفولوژی میسلوم هایSaccharopolyspora erythraeaدر روز ششم تخمیر در

غلظت 40% اوره…………………………………………………………………………………………………………………..154

شکل(4-8): مورفولوژی میسلیوم هایSaccharopolyspora erythraeaدر روز هشتم تخمیر در

غلظت 40% اوره………………………………………………………………………………………………………………..155

شکل(4-9): مورفولوژی میسلوم هایSaccharopolyspora erythraeaدر روز دهم تخمیر در

غلظت 40% اوره…………………………………………………………………………………………………………………155

شکل(4-10): مورفولوژی میسلوم هایSaccharopolysporaerythraeaدر روز یازدهم تخمیر در

غلظت 40% اوره…………………………………………………………………………………………………………………156

چکیده فارسی

1-1-2 کلزا و اهمیت اقتصادی آن……………………………………………………………………

5

1-2 تنش خشکی………………………………………………………………………………..

8

1-2-1 مکانیسم­های مقاومت به خشکی در گیاهان زراعی……………………………………………….

11

1-2-2 اثر تنش خشکی بر روی کلزا…………………………………………………………………

12

1-2-3- ﺗﺄثیر تنش خشکی بر رشد و فتوسنتز………………………………………………………

14

1-2-4 اثر تنش خشکی روی آنزیم­های آنتی­اکسیدانت و مالون­دی­آلدهید………………………………

18

1-2-5 ﺗﺄثیرتنش خشکی بر میزان نیترات و نیترات ردوکتاز…………………………………………….

19

1-2-6 ﺗﺄثیر تنش خشکی بر القای اسمولیت­های سازگار………………………………………………

21

1-3 کلیاتی در زمینه مسیر درک علامت (Singal transduction) در گیاهان…………………………….

21

1-3-1 اثر تنش­های محیطی در فرایند­های مولکولی در گیاهان………………………………………………………….

23

1-3-2 مسیرهای ژن­های کنترل کننده تنش­های غیر­زنده………………………………………………………………………

24

1-4 ژن­های مورد مطالعه…………………………………………………………………………………………………………..

24

1-4-1 پروتئین کینازها………………………………………………………………………………………………………………

26

1-4-2 خانواده ژنیMAPK……………………………………………………………………………………………………..

28

1-4-3 ژن حساس به اکسین………………………………………………………………………………….

33

فصل دوم: مواد و روش­ها………………………………………………………………………

34

2-1 شرایط رشد………………………………………………………………………………………………………………….

34

2-1-1 نحوه تیمار­دهی گیاهان…………………………………………………………………………………………………

35

2-1-2 برداشت نمونه……………………………………………………………………………………………………………

35

2-1-2-1 برداشت نمونه جهت انجام بررسی­های مولکولی……………………………………………..

35

2-1-2-2 برداشت نمونه جهت انجام بررسی­های فیزیولوژیک………………………………………………………………

36

2-2 روش های بکار گرفته شده در آزمایشات مولکولی………………………………………………………………………..

36

2-2-1 پودر کردن و آماده سازی نمونه جهت استخراج RNA ………………………………………………………….

36

2-2-2 استخراج RNA از بافت گیاهی……………………………………………………………………………………………………

36

2-2-3 اندازه­گیری میزان غلظت RNA و رقیق سازی نمونه­ها…………………………………………………………………..

37

2-2-4- روش تهیه cDNA………………………………………………………………………………………………

37

2-2-5- واکنش RT-PCR………………………………………………………………………………………………

38

2-2-6 تهیه ژل الکتروفورز……………………………………………………………………………………………………………………..

38

2-2-6-1 تهیه TBE 5X…………………………………………………………………………………………………

38

2-2-7 پرایمر­های استفاده شده در این پژوهش………………………………………………………………………………………….

38

2-3 روش­های بکار گرفته شده در آزمایشات فیزیولوژیکی……………………………………………………………………………

38

2-3-1 طرز تهیه عصاره گیاهی جهت تعیین میزان فعالیت آنزیم­های آسکوربات و گایاکول پراکسیداز…………………….

39

2-3-1-1 اندازه­گیری فعالیت آنزیم آسكوربات پراكسیداز(APX)………………………………………………………

39

2-3-1-2 اندازه­گیری فعالیت آنزیم گایاكول پراكسیداز(GPX)………………………………………………………..

39

2-3-2 سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز………………………………………………………………………………………………………………..

40

2-3-3 اندازه­گیری میزان پراکسیداسیون چربی­ها (MDA)……………………………………………………………………………….

40

2-3-4 اندازه­گیری پروتئین کل…………………………………………………………………………………………………………….

41

2-3-5 اندازه­گیری قندهای محلول………………………………………………………………………………………………………………….

41

2-4 آنالیزهای آماری…………………………………………………………………………………………………………………………..

42

فصل سوم: نتایج………………………………………………………………………………………………………………………………….

43

3-1 نتایج حاصل از بررسی­های انجام یافته در سطح مولکولی…………………………………………………………………………….

43

3-1-1 بررسی بیان ژنProtein Kinaseتحت اثر تنش خشکی در گیاه کلزا(B.napus)………………………….

45

3-1-2 بررسی بیان ژنMAPK4تحت اثر تنش خشکی در گیاه کلزا(B.napus)…………………………………….

46

3-1-3 بررسی بیان ژنMAPK3تحت اثر تنش خشکی در گیاه کلزا(B.napus)…………………………………….

48

3-1-4 بررسی بیان ژنAuxin responsive proteinتحت اثر تنش خشکی در گیاه کلزا(B.napus)……………

49

3-2 بررسی نتایج حاصل از آزمایشات فیزیولوژیکی…………………………………………………………………………………………….

49

3-2-1 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان فعالیت آنزیم گایاکول پر­اکسیداز (GPX) درگیاه کلزا………………………………

50

3-2-2 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX) درگیاه کلزا……………………………..

52

3-2-3 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) درگیاه کلزا……………………………………………..

53

3-2-4 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان مالون­دی­آلدهید (MDA) درگیاه کلزا…………………………………………………

55

3-2-5 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان پروتئین کل درگیاه کلزا…………………………………………………………………………..

55

3-2-6 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان قندهای محلول درگیاه کلزا………………………………………………………………………

57

فصل چهارم: بحث و بررسی…………………………………………………………………………………………………………………………….

58

4-1- بررسی های انجام شده در سطح مولکولی……………………………………………………………………………………………………

61

4-2 بررسی­های انجام شده در سطح فیزیولوژیکی……………………………………………………………………………………………….

66

4-3 نتیجه­گیری کلی………………………………………………………………………………………………………………………………………..

67

4-4 پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………….

68

5- ضمائم…………………………………………………………………………………………………………………………………………..